趙玲鈺 龐 軍 高文惠

(河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，石家莊 050000)

三氟氯氰菊酯(LC)是一種新型的具有廣譜、高效、中等毒性和能生物降解的擬除蟲菊酯類殺蟲劑之一，其結(jié)構(gòu)式如圖1所示，廣泛應(yīng)用于糧谷、蔬菜等農(nóng)作物中。近年來，隨著我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)技術(shù)的不斷發(fā)展，促進(jìn)了農(nóng)作物的生產(chǎn)與種植量，然而農(nóng)作物的大量種植給病蟲害提供了良好的滋生環(huán)境[1]，嚴(yán)重影響了種植業(yè)的發(fā)展，不合理的施用農(nóng)藥又會產(chǎn)生農(nóng)藥殘留問題，對人體健康造成威脅；另外，三氟氯氰菊酯不僅應(yīng)用廣泛，其殘留對人體有一定危害，容易出現(xiàn)頭昏、嘔吐、全身抽搐等癥狀，嚴(yán)重的還會造成致畸、致癌；因此，對三氟氯氰菊酯農(nóng)藥殘留量的測定顯得十分重要。我國國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，谷物中三氟氯氰菊酯的最大殘留量為1 mg/kg[2]。目前用于樣品中三氟氯氰菊酯的檢測方法主要有色譜法[3-6]和色譜-質(zhì)譜法[7-9]，但色譜法樣品前處理復(fù)雜、檢測成本高、分析周期長，因此建立一種快速、靈敏、準(zhǔn)確的檢測方法尤為重要。近年來，分子印跡技術(shù)與電化學(xué)快速檢測方法相結(jié)合制備的分子印跡電化學(xué)傳感器已成功地應(yīng)用于實(shí)際樣品檢測中[10-12]，該類傳感器具有靈敏度高、專一性強(qiáng)、制作和檢測成本低的優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已受到科研工作者的廣泛關(guān)注。

圖1 三氟氯氰菊酯結(jié)構(gòu)式

目前，基于電沉積殼聚糖膜制備三氟氯氰菊酯分子印跡電化學(xué)傳感器鮮見報(bào)道。本研究以三氟氯氰菊酯為模板分子，殼聚糖為功能單體，采用電沉積法制備三氟氯氰菊酯分子印跡電化學(xué)傳感器，并對印跡傳感器的性能進(jìn)行研究，同時將其應(yīng)用于糧谷中三氟氯氰菊酯農(nóng)藥殘留的快速檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三氟氯氰菊酯(純度：99%)；殼聚糖(脫乙酰度≥90%)；鐵氰化鉀、戊二醛、甲醇、冰醋酸、氫氧化鈉等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LK98BⅡ電化學(xué)分析儀；三電極系統(tǒng)(CHI104玻碳電極(3 mm)、CHI115鉑絲電極、CHI111 Ag/AgCl電極)；S22-2型恒溫磁力攪拌器；pH211臺式酸度計(jì)。

1.3 方法

1.3.1 玻碳電極預(yù)處理

采用不同粒徑(0.5～0.05 μm)的Al2O3粉末作為拋光粉，將玻碳電極置于麂皮上逐級打磨成鏡面后置于超純水和無水乙醇中反復(fù)超聲清洗1 min，取出電極置于0.5 mol/L的H2SO4溶液中循環(huán)掃描，直至獲得穩(wěn)定的循環(huán)伏安曲線，待清洗完畢后，將電極置于探針溶液中進(jìn)行循環(huán)掃描，如果得不到準(zhǔn)可逆的循環(huán)伏安峰(峰電流比為1∶1，峰電位差小于85 mV)，則重新處理電極。

1.3.2 殼聚糖印跡膜的制備

將經(jīng)過打磨處理的玻碳電極置于2.0×10-4mol/L三氟氯氰菊酯-殼聚糖(LC-CS)電沉積混合溶液中，以-1.5 V的恒電位下電沉積5 min。在負(fù)電位條件下電極周圍的水分子易被還原而消耗質(zhì)子，同時在電極表面產(chǎn)生氣泡，此時殼聚糖為了補(bǔ)償水分子還原所消耗的質(zhì)子而進(jìn)行去質(zhì)子化[13]。與此同時，部分與殼聚糖通過氫鍵等分子間作用力而相互吸引的三氟氯氰菊酯分子一同沉積到工作電極表面，形成一層嵌有三氟氯氰菊酯的分子印跡膜。電沉積后的印跡電極用超純水沖洗后，置于2.5%的戊二醛(GA)溶液中浸泡10 min，取出印跡電極，于室溫下晾干2 h。然后將此印跡電極置于洗脫劑中浸泡洗脫模板分子，再將其置于探針溶液中進(jìn)行表征，制備三氟氯氰菊酯分子印跡電化學(xué)傳感器(LC-CS/MIP)。

在相同條件下，采用不含三氟氯氰菊酯模板分子的殼聚糖沉積液中進(jìn)行電沉積，所制備的電極為非印跡電極(NIP)。

1.4 樣品處理

樣品：大豆、玉米、糙米(均為市售)。

稱取粉碎后樣品5.00 g，用20 mL乙腈提取(分2次提取，每次10 mL)，渦旋振蕩2 min，超聲15 min，4 000 r/min離心10 min，合并2次上清液，用乙腈定容至20mL，待測。

1.5 電化學(xué)方法

本研究采用恒電位法沉積殼聚糖印跡膜，沉積電位為-1.5 V；沉積時間為5 min，采用循環(huán)伏安法(CV)表征印跡膜的響應(yīng)特性，表征電位為-0.2～0.8 V，采用差分脈沖伏安法(DPV)對實(shí)際樣品進(jìn)行測定，電位增量為4 mV；脈沖幅度為50 mV。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用Origin8.0對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析以及圖形處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 三氟氯氰菊酯電化學(xué)活性研究

為確定三氟氯氰菊酯是否具有電活性，并考察其對分子印跡電化學(xué)傳感器的檢測是否帶來影響，將處理后的玻碳電極置于含有1 mmol/L三氟氯氰菊酯的醋酸鈉電解質(zhì)溶液中循環(huán)掃描，循環(huán)伏安曲線如圖2所示。由圖2可知，三氟氯氰菊酯在-0.7 V處有一還原峰出現(xiàn)，但是該峰電流值太低，不足5 μA，難以采用電化學(xué)分析法對其直接進(jìn)行測定，因此需要借助于電活性探針進(jìn)行間接檢測。

結(jié)合電化學(xué)分析的方法，采用分子印跡技術(shù)制備三氟氯氰菊酯分子印跡電化學(xué)傳感器，借助于電活性探針間接檢測糧谷中三氟氯氰菊酯農(nóng)藥殘留。

圖2 三氟氯氰菊酯在醋酸鈉電解質(zhì)溶液中的循環(huán)伏安曲線

2.2 功能單體的選擇

制備分子印跡電化學(xué)傳感器的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)就是根據(jù)待測物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)選擇合適的功能單體。殼聚糖(CS)是甲殼素經(jīng)脫乙酰作用形成的一種含有豐富的-NH2和-OH的高分子化合物，并且經(jīng)過化學(xué)改性后可以得到具有特殊功能的新材料[14]，其結(jié)構(gòu)式如圖3所示。

圖3 殼聚糖分子結(jié)構(gòu)式

目前，較多學(xué)者利用殼聚糖結(jié)構(gòu)中豐富的功能基團(tuán)與待測物質(zhì)通過價鍵結(jié)合的方式形成分子印跡復(fù)合膜，并將其修飾材料固定在工作電極表面制備成具有高選擇性的分子印跡電化學(xué)傳感器，同時對許多的金屬離子、有機(jī)物等物質(zhì)具有良好的螯合、吸附作用也是其一大優(yōu)勢[15]。陳娟娟[16]以殼聚糖為功能單體，選擇不同的有機(jī)磷農(nóng)藥為模板分子，采用電沉積的方法制備了各種有機(jī)磷分子印跡電化學(xué)傳感器，結(jié)果令人滿意。因此本研究采用殼聚糖作為功能單體電沉積于電極表面制備印跡聚合物膜。

2.3 電沉積電位的選擇

為了初步確定殼聚糖的電沉積電位，實(shí)驗(yàn)設(shè)置在-1.7～0 V的電位區(qū)間進(jìn)行掃描。結(jié)果如圖4所示，殼聚糖沉積液的循環(huán)伏安曲線在-1.6 V附近出現(xiàn)了一個還原峰，同時在掃描過程中電極周圍有氣泡出現(xiàn)，表明殼聚糖在沉積過程中物理形態(tài)發(fā)生了變化，即溶劑水在pH偏酸性的條件下還原成氫氣并釋放出來，殼聚糖上結(jié)合的質(zhì)子為補(bǔ)充水中質(zhì)子的缺失而去質(zhì)子化，并析出附著在電極表面形成殼聚糖沉積層[17]。

圖4 工作電極在殼聚糖沉積液中的循環(huán)伏安曲線

根據(jù)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象初步確定了殼聚糖在醋酸鈉溶液中的沉積電位為-1.6 V，為得到最優(yōu)的殼聚糖電沉積電位，實(shí)驗(yàn)選擇了不同的沉積電位進(jìn)行電沉積實(shí)驗(yàn)，并進(jìn)行優(yōu)化。

固定電沉積時間為3 min，研究不同的電沉積電位對傳感器響應(yīng)特性的影響。分別選取在-1.9、-1.7、-1.5、-1.4、-1.2、-1.0 V電位下進(jìn)行恒電位電沉積實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)電位越負(fù)，電極周圍產(chǎn)生氣泡的速度越快，同時產(chǎn)生的氣泡量增大。將沉積后的電極洗脫模板分子后，于探針溶液中表征時相對峰電流較?。欢?dāng)沉積電位為-1.5 V時，相對峰電流達(dá)到最大，最終確定最佳沉積電位為-1.5 V。電沉積曲線如圖5所示，由圖5可以看出，在沉積過程中電流響應(yīng)受到抑制，呈逐步下降趨勢，表明沉積膜在形成過程中阻礙了電極表面的電子傳遞；同時由非印跡電沉積曲線可以看出，模板分子的存在與否對電沉積曲線無明顯影響，說明在電沉積的過程中，模板分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生改變，對殼聚糖的電沉積實(shí)驗(yàn)沒有影響。

圖5 殼聚糖電沉積曲線

2.4 電沉積時間的選擇

電沉積時間的長短直接影響沉積膜的厚度，進(jìn)而影響分子印跡電化學(xué)傳感器的響應(yīng)性能。在最佳電沉積電位-1.5 V條件下，考察了不同的電沉積時間對三氟氯氰菊酯分子印跡電化學(xué)傳感器性能的影響。分別選取沉積1、2、3、5、7、9、10 min，根據(jù)傳感器在洗脫模板分子后的相對峰電流值及對模板分子的吸附性能來選擇最佳電沉積時間，結(jié)果如圖6所示。在2 min前，隨著沉積時間的增加，峰電流值逐漸下降，表明沉積時間短，洗脫時膜易脫落；沉積2～10 min時，相對峰電流在沉積5 min時最大，并在5 min后相對峰電流呈下降趨勢，表明沉積時間小于5 min時，所形成的印跡膜薄，有助于探針離子到達(dá)電極表面，洗脫后響應(yīng)電流值逐漸增大，大于5 min時，形成的印跡膜較厚，直接影響到傳感器的靈敏度。因此，最佳電沉積時間為5 min。

圖6 不同沉積時間相對峰電流變化值

2.5 洗脫條件的優(yōu)化

將模板分子從聚合膜中成功洗脫是形成印跡空穴的重要環(huán)節(jié)，洗脫的基本原理是選擇合適的洗脫劑破壞模板分子與功能單體之間的作用力，以達(dá)到洗脫模板分子的目的。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)三氟氯氰菊酯的化學(xué)性質(zhì)，選擇了冰醋酸-甲醇=1∶5 (V∶V)作為最佳洗脫劑；并對洗脫時間進(jìn)行了研究，結(jié)果如圖7所示，浸泡洗脫10 min后響應(yīng)電流值達(dá)到最大。因此，最佳洗脫時間為10 min。

在優(yōu)化模板分子洗脫條件后，考察了印跡電極對模板分子的吸附時間。將制備好的三氟氯氰菊酯分子印跡電化學(xué)傳感器置于濃度為0.5 μmol/L的三氟氯氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)溶液中吸附不同的時間后，于探針溶液中表征。結(jié)果表明，吸附1 min后響應(yīng)電流值趨于穩(wěn)定，表明印跡電極上吸附的模板分子量已達(dá)到飽和。因此，確定1 min為最佳吸附時間。

圖7 洗脫時間優(yōu)化曲線

2.6 印跡性能表征

采用CV對三氟氯氰菊酯分子印跡電化學(xué)傳感器的性能進(jìn)行表征，如圖8所示，比較了不同印跡電極于探針溶液中的電化學(xué)行為。

注：a為沉積電極；b為沉積電極洗脫后再吸附；c為沉積電極洗脫后；d為裸電極。圖8 不同電極在電活性探針溶液中的循環(huán)伏安圖

沉積電極于探針溶液中掃描時，呈現(xiàn)的響應(yīng)電流值較小，不足5 μA，表明殼聚糖沉積印跡膜致密，阻礙了探針離子進(jìn)行電子傳遞；當(dāng)洗脫模板分子之后再次掃描時，響應(yīng)電流值增強(qiáng)，表明洗脫模板分子之后，于電極表面形成了許多印跡空穴，探針離子通過這些空穴到達(dá)電極表面進(jìn)而發(fā)生氧化還原反應(yīng)；將印跡電極再次吸附模板分子之后，響應(yīng)電流值明顯下降，表明模板分子再次占據(jù)部分印跡空穴，導(dǎo)致響應(yīng)電流值減小。曲線的電化學(xué)信號明顯弱于裸電極，表明在印跡電極表面除帶一些特異性能的空穴外，還覆有一層殼聚糖印跡聚合膜。

2.7 選擇性及穩(wěn)定性研究

采用DPV對傳感器的重復(fù)性和穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，選取了與三氟氯氰菊酯結(jié)構(gòu)類似的擬除蟲菊酯類殺蟲劑，如胺菊酯，聯(lián)苯菊酯進(jìn)行選擇性吸附實(shí)驗(yàn)，同時選取了與模板分子結(jié)構(gòu)差異較大的聯(lián)苯三唑醇、腈菌唑等三唑類農(nóng)藥進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)。將印跡電極置于探針溶液中，加入濃度為0.7 μmol/L的目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行吸附實(shí)驗(yàn)，采用DPV進(jìn)行表征，結(jié)果如圖9所示。通過吸附前后響應(yīng)電流的變化值(ΔI)可以看出，吸附相同濃度的不同物質(zhì)，印跡電極對模板分子三氟氯氰菊酯的ΔI值最大，但由于聯(lián)苯菊酯和胺菊酯在結(jié)構(gòu)上與三氟氯氰菊酯相似，并且分子量比三氟氯氰菊酯小，使得聯(lián)苯菊酯和胺菊酯能夠吸附在印跡電極的識別空穴上，從而引起響應(yīng)電流的變化，但是對三唑類農(nóng)藥的吸附幾乎無響應(yīng)電流變化，說明該傳感器可以對三氟氯氰菊酯和其結(jié)構(gòu)類似物進(jìn)行測定。

將制備的三氟氯氰菊酯分子印跡電化學(xué)傳感器連續(xù)測定20次，所得ΔI的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.5%(n=20)，表明該傳感器具有良好的重復(fù)性，并且傳感器的檢測性能無衰減現(xiàn)象。

圖9 印跡電極的選擇性研究

2.8 線性關(guān)系和檢出限

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，配制含有0.02～2.0 μmol/L的三氟氯氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用DPV檢測，以三氟氯氰菊酯的濃度為橫坐標(biāo)，DPV響應(yīng)電流變化值(ΔI)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，不同濃度的DPV曲線如圖10所示，隨著三氟氯氰菊酯濃度的增大，ΔI值逐漸增大。該傳感器在0.1～1.0 μmol/L濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，檢出限為0.04 μmol/L，線性方程為ΔI=10.495c+0.063 9，線性相關(guān)系數(shù)R=0.993 5。

注：a～f: 0.1、0.2、0.5、0.7、0.9、1.0 μmol/L。圖10 不同三氟氯氰菊酯濃度的DPV曲線

2.9 回收率和精密度實(shí)驗(yàn)

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，取市售大豆、玉米、糙米作為樣品，采用三氟氯氰菊酯分子印跡電化學(xué)傳感器對其進(jìn)行檢測，結(jié)果均未檢出擬除蟲菊酯類農(nóng)藥。在0.1 μmol/L和0.5 μmol/L 2個添加水平下對陰性樣品進(jìn)行樣品加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，測定結(jié)果如表1所示，樣品加標(biāo)平均回收率在81.2%～94.6%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在2.1%～4.1%之間(n=5)。結(jié)果表明該方法的回收率和精密度良好。

表1 樣品的回收率和精密度實(shí)驗(yàn)(n=5)

3 結(jié)論

本研究以三氟氯氰菊酯為模板分子，殼聚糖為功能單體，采用電沉積法制備三氟氯氰菊酯分子印跡電化學(xué)傳感器。實(shí)驗(yàn)過程中對制備的傳感器響應(yīng)特性進(jìn)行了研究，選取不同種類的物質(zhì)考察了傳感器的選擇性能。結(jié)果表明該傳感器具有較好的選擇性響應(yīng)，可對三氟氯氰菊酯及其結(jié)構(gòu)類似物進(jìn)行測定；三氟氯氰菊酯的濃度在0.1～1.0 μmol/L范圍內(nèi)與其相對峰電流呈良好的線性關(guān)系，其檢出限可達(dá)0.04 μmol/L，樣品加標(biāo)平均回收率為81.2%～94.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)≤4.1%，連續(xù)進(jìn)行吸附洗脫20次之后傳感器性能無衰減現(xiàn)象。與傳統(tǒng)色譜方法以及色譜-質(zhì)譜方法相比，該傳感器不僅靈敏度高，而且樣品處理簡單，抗干擾能力強(qiáng)，操作簡單，檢測快速，可以滿足對糧谷中三氟氯氰菊酯殘留量的快速檢測。