葛志文 高瑀瓏 劉 慧 鄭云飛 邱偉芬

(南京財經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院；江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 210023)

作為世界上最大的稻谷生產(chǎn)國和消費國，我國稻谷種植面積廣闊，且稻谷儲藏的安全與防控問題一直備受關(guān)注。稻谷的儲藏期一般為3年，儲藏過程中，微生物在適宜的環(huán)境條件下滋生，容易引起儲藏稻谷發(fā)霉、腐爛和變色，直接或間接地影響儲藏稻谷的質(zhì)量和安全[1]。平板計數(shù)法、菌落形態(tài)特征觀察和菌種鑒定技術(shù)常被使用，然而這些方法存在操作規(guī)程復(fù)雜、分析耗時、低精度和低重復(fù)性等缺點[2]。為了評估儲藏稻谷中微生物污染情況，本研究采用一種BIOLOG ECO平板生物學(xué)方法來評估儲藏稻谷中微生物污染狀況，具有重要意義。

BIOLOG ECO平板法的原理在于：由于微生物的種類和數(shù)量與微生物群落的代謝功能密切相關(guān)，因此通過四唑染色測定法對微生物群落代謝功能特性進(jìn)行分析。該測定法根據(jù)四唑鹽類由原初氧化態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)檫€原態(tài)時呈現(xiàn)的明顯顏色變化，實現(xiàn)快速表征儲藏稻谷中微生物群落狀況[3]。BIOLOG ECO平板法在很多研究中已有應(yīng)用，如用于研究沉積物[4]、廢水[5]、活性污泥[6]和土壤等[7]。此類平板上有96個微孔，每32個微孔為一個生物學(xué)平行，每板共計3個生物學(xué)平行。每個平行中除對照孔外各個孔內(nèi)都含有一種不同的單一碳源和相同含量的四唑紫染料。群落中微生物在利用碳源的過程中產(chǎn)生自由電子，與四唑紫染料反應(yīng)發(fā)生氧化還原反應(yīng)，產(chǎn)生顏色變化，孔的吸光度變化反映了微生物對碳源的利用程度，即反映了環(huán)境樣品微生物群落的代謝功能特性。不同微生物類群利用碳源的能力不同，產(chǎn)生的不同吸光度變化即可表征微生物群落差異[8]。

但是，在稻谷儲藏領(lǐng)域，目前對微生物群落水平代謝功能性的研究很少。在本研究中，利用BIOLOG ECO平板對儲藏稻谷微生物群落的代謝功能特性進(jìn)行了分析，探討了不同儲藏期限與儲藏稻谷微生物群落之間的關(guān)系，為稻谷安全儲藏與防控提供一種新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

稻谷樣品依照三層五點法(糧庫上、中、下三層，每層四個角落和中間設(shè)為采樣點)從安徽省現(xiàn)代糧食物流中心庫采集，包括未儲藏、儲藏1年、儲藏2年和儲藏3年四種樣品，四種稻谷樣品均來自相同地域。稻谷樣品在溫度(20±5)℃和相對濕度(50±5)%的糧庫常規(guī)儲藏條件下進(jìn)行儲藏。取樣后，每種樣品每層每點稱量10 g，混合均勻，制得150 g的混合樣品，分別標(biāo)記為S0、S1、S2和S3，在均質(zhì)袋中4 ℃保藏。

1.2 儀器

SF-CF-2A超凈工作臺；VOSHIN-600R無菌均質(zhì)機(jī)；ES-08B電子天平；BIOLOG ECO平板；SpectraMax M2e多功能酶標(biāo)儀。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理與平板加樣

分別稱取25.00 g稻谷樣品于250 mL三角瓶中，加入225 mL 0.85%無菌生理鹽水，在4 ℃以200 r/min振蕩浸提1 h，靜置3 min后分別將樣品梯度稀釋至10-2倍，每個樣品做三個平行，將三個平行的菌液混合均勻后，用8道加樣槍吸取150 μL至 BIOLOG ECO平板的微孔中，在25 ℃下培養(yǎng)，每隔24 h用酶標(biāo)儀在590 nm(顏色+濁度)和750 nm(濁度)讀取數(shù)據(jù)。

1.3.2 AWCD值的計算

BIOLOG ECO平板上的平均吸光度變化值(AWCD)用以衡量微生物利用不同碳源的能力，通常經(jīng)過對一系列單時間點的AWCD值變化趨勢，以及樣品間AWCD值單因素方差分析來比較樣品間微生物群落代謝特性的不同。一般認(rèn)為AWCD值較大的樣品具有較高的碳源利用能力，也往往具有較高的微生物豐度。某時刻平板內(nèi)平均色度的計算公式為:

(1)

式中：Ci為不同時刻除對照孔外的各反應(yīng)孔在590 nm和750 nm下的吸光度差值，R為對照孔在590 nm和750 nm下的吸光度差值，n為碳源數(shù)。Ci-R小于0.06的孔計算時記為零[9]。

1.3.3 多樣性指數(shù)的計算

除AWCD值之外，多樣性指數(shù)的計算也是一種常用的單時間點計算單一數(shù)值指標(biāo)的方法。依照度量動植物多樣性的思想，Zak[10]等提出基于BIOLOG ECO微平板的功能多樣性指數(shù)的計算方法。

1.3.3.1 Shannon-Wiener多樣性指數(shù)(H′)

H′=-∑PilnPi

(2)

Pi=(Ci-R)/∑(Ci-R)

式中:Pi為每一孔吸光度除以所有孔吸光度的和。通過(Ci-R)與除法對變量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，消除在點樣及培養(yǎng)過程中對吸光度變化帶來的影響誤差。

1.3.3.2 Shannon均勻度指數(shù)(E)

E=H′/lnS

(3)

式中：S為微生物可以利用的碳源數(shù)目，即顏色有變化的孔數(shù)。

1.3.3.3 Simpson 多樣性指數(shù)(D)

D=1-∑Pi2

(4)

1.3.3.4 McIntosh多樣性指數(shù)(U)

(5)

式中：ni為第i孔的相對吸光值(Ci-R)。

1.3.3.5 McIntosh均勻度指數(shù)(E)

(6)

式中：S為顏色變化的孔的數(shù)目，N是相對吸光度值總和。

以上指數(shù)均表征微生物群體利用碳源能力的多樣性，同普通生態(tài)學(xué)中多樣性指數(shù)含意。

1.3.4 主成分分析(PCA)

本研究兩種基于對單一數(shù)值的比較方法具有方便直觀的特點，但由于這種計算方法不考慮碳源的分布方式，無差異的對待不同碳源產(chǎn)生的數(shù)據(jù)，與樣品真實情況產(chǎn)生差異，因此本研究也從多維數(shù)據(jù)角度進(jìn)行分析。

一個BIOLOG ECO微孔板上含有31種碳源類型，其中分為羧酸類、碳水化合物類、氨基酸類、聚合物類、雙親化合物類和胺類。為避免微生物群落代謝差異對統(tǒng)計分析結(jié)果產(chǎn)生影響，利用對采集的吸光度數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)變換后獲得的Rsi值進(jìn)行PCA分析。

Rsi= (Ci-R) /AWCD

(7)

式中：Ci為不同時刻除對照孔外的各反應(yīng)孔在590 nm下的吸光度值；R為對照孔的吸光值。

經(jīng)過BIOLOG ECO平板培養(yǎng)第9天后，儲藏稻谷的微生物群落代謝功能達(dá)到穩(wěn)定期，選取該時間點的吸光度值進(jìn)行主成分分析，得出的結(jié)果更為接近儲藏稻谷微生群落代謝功能的真實狀態(tài)。采用SPSS 19.0和Origin 8.5軟件進(jìn)行分析與作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同儲藏年限稻谷微生物群落在培養(yǎng)期間內(nèi)平均色度變化率

AWCD(Average well color development，平均色度變化率)是反映儲藏稻谷微生物群落代謝活性，即微生物利用單一碳源能力的重要指標(biāo)[11]。在試驗中，應(yīng)用BIOLOG ECO生態(tài)微板在單時間點上計算單個值(AWCD)來確定碳源的代謝率，更準(zhǔn)確地對儲藏稻谷微生物群落的碳源代謝活性與多樣性進(jìn)行比較。根據(jù)式(1)，繪制本研究中不同儲藏年限稻谷樣品微生物群落利用總碳源的AWCD變化曲線，如圖1所示。

圖1 不同儲藏年限稻谷AWCD隨時間的變化

結(jié)果顯示，四種不同儲藏期限稻谷微生物群落的AWCD值在培養(yǎng)第1天均處于延滯期。從第2天起，AWCD值均呈現(xiàn)明顯增加趨勢并持續(xù)升高，表明微生物群落開始在平板上代謝利用有機(jī)碳源物質(zhì)。選擇4種樣品第1天到第9天的AWCD值進(jìn)行代謝活性分析，在這段期間內(nèi)的斜率代表微生物群落代謝的平均速率。AWCD值的增加速率在第3天以后越來越小，在培養(yǎng)第9天，AWCD值變化達(dá)到相對穩(wěn)定狀態(tài)，表明微生物群落中可培養(yǎng)微生物在培養(yǎng)期內(nèi)利用碳源的功能相對穩(wěn)定。

未儲藏新鮮稻谷(S0)的AWCD值明顯高于其他儲藏年限的稻谷，從0增加到0.969 8。儲藏1年稻谷的微生物群落代謝速率最小，從0增加到0.731 3，表明稻谷在未儲藏期，其微生物群落代謝功能最旺盛，而儲藏1年后，稻谷的微生物群落代謝功能明顯小于其他儲藏年限的稻谷。在儲藏期，儲藏稻谷中微生物群落的代謝功能呈現(xiàn)出先減小后增加的趨勢，在儲藏1年后微生物群落代謝功能達(dá)到最低，其后隨著儲藏時間的增加，微生物群落利用碳源的能力逐漸增加。以上結(jié)果分析可得，不同儲藏年限稻谷微生物群落間的代謝功能多樣性存在差異，且未儲藏的稻谷微生物群落與儲藏一定期限的稻谷微生物群落間存在差異。

2.2 不同儲藏年限稻谷微生物群落利用不同種類碳源的動力學(xué)特征

根據(jù)化學(xué)基團(tuán)的性質(zhì)，將ECO板上的31種碳源分成6類，即氨基酸類、聚合物類、雙親化合物類、胺類、羧酸類、碳水化合物類[12]。為考察儲藏稻谷微生物對不同碳源類型的利用情況，按照式(1)計算每類碳源的AWCD值并分別作圖。

由圖2可知，隨著培養(yǎng)時間的增加，儲藏稻谷微生物對6類碳源利用的AWCD值均呈現(xiàn)不斷增加的趨勢。不同的微生物群落，其對6類碳源的利用能力不同。碳水化合物的AWCD值最高，氨基酸類和聚合物類的AWCD值相近且略低于碳水化合物，最低的是雙親化合物類，這表明儲藏稻谷微生物群落對碳水化合物類碳源的代謝利用率最高，對雙親化合物類碳源的利用率最低。

圖2 不同儲藏年限稻谷對不同碳源的利用

對不同碳源的4種儲藏稻谷樣品AWCD值之間進(jìn)行方差分析(表1)，結(jié)果表明：在6類碳源中，儲藏稻谷微生物群落對于氨基酸類、聚合物類、雙親化合物類、羧酸類和碳水化合物類的碳源利用率沒有顯著差異。但是，在利用胺類碳源上，儲藏稻谷的微生物群落的碳源利用率呈顯著差異 (P<0.05)，利用能力大小順序為S0>S1>S3>S2。

在儲藏過程中，由于田間微生物與儲藏微生物的演替以及糧庫通風(fēng)、熏蒸等措施，均會對儲藏稻谷的微生物群落產(chǎn)生影響[13]。此外，稻谷儲藏年限不同，其微生物群落對6類碳源中胺類碳源的利用存在顯著差異，可依此作為辨別儲藏稻谷微生物污染滋生程度的指標(biāo)開發(fā)建立快速識別方法，這是今后需研究解決的問題。

表1 不同碳源四種儲藏稻谷AWCD值的方差分析

2.3 多樣性指數(shù)

微生物群落的代謝功能多樣性可由功能多樣性指數(shù)反映，表2顯示了不同儲藏年限稻谷微生物群落的Shannon多樣性指數(shù)(H')、Shannon均勻度指數(shù)(E)、Simpson指數(shù)(D)、McIntosh多樣性指數(shù)(U)、McIntosh均勻度指數(shù)(E)。Shannon多樣性指數(shù)(H')在很大程度上受到群落物種豐富度的影響。多樣性指數(shù)越高，表明儲藏稻谷微生物群落的代謝功能多樣性越大。Shannon均勻度指數(shù)(E)越高，微生物群落中物種數(shù)分布越均勻[14]。

由表2知，S0的微生物群落在Shannon多樣性指數(shù)和Shannon均勻度指數(shù)上與其他儲藏年限稻谷有顯著差異(P<0.05)。S0的Shannon多樣性和均勻度指數(shù)最高，其次是S1、S2和S3，表明稻谷在未儲藏時，儲藏稻谷中微生物的豐富性和均勻性最高，儲藏環(huán)境使得微生物群落豐富性和均勻性有所下降。隨著儲藏時間的延長，多樣性指數(shù)和均勻度均有相應(yīng)地增加。然而，四種儲藏稻谷的Simpson指數(shù)和McIntosh指數(shù)間沒有顯著的差異，表明四種儲藏稻谷微生物群落中最常見的物種是相似的。

2.4 主成分分析

主成分分析被應(yīng)用在多元分析中，用來評估在特定環(huán)境下微生物群落的碳源代謝情況并區(qū)分不同樣品微生物群落之間的差異。通過降維，不同儲藏年限稻谷間微生物群落代謝特征的差異通過在主向量空間中的點位置差異直接反映出來。如圖3所示，多元向量被轉(zhuǎn)換成兩個不相關(guān)的主分量向量。第1、2主成分分別占總變異的62.696%和13.157%，第1主成分是變異的主要來源。由圖知，稻谷樣品S0,S1,S2分布點的位置與其他稻谷樣品的分布點的位置存在顯著的間距，而其他稻谷樣品間的點位置均相近，說明未儲藏新鮮稻谷的微生物群落代謝功能特性與儲藏期內(nèi)稻谷的微生物群落代謝功能特性存在顯著差異，儲藏期內(nèi)稻谷間微生物群落的代謝功能特性差異不顯著，說明儲藏環(huán)境會對儲藏稻谷微生物群落代謝功能產(chǎn)生一定的影響。

表2 稻谷微生物群落代謝功能多樣性指數(shù)比較

注：表格中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，n=4。對每類多樣性指數(shù)采用Duncan多重范圍檢驗分析，每一列不同的小寫字母(a,b)表示樣品間差異的顯著性(P<0.05)，樣品間字母相同表示之間差異不顯著，不同則表示差異顯著。

表3 BIOLOG ECO平板上31種碳源在第1、2主成分上的載荷值

注：未儲藏新鮮稻谷3組平行樣品標(biāo)記為S01,S02,S03;儲藏1年稻谷標(biāo)記為S11,S12,S13;儲藏2年稻谷標(biāo)記為S21,S22,S23;儲藏3年稻谷標(biāo)記為S31,S32,S33。圖3 不同儲藏年限稻谷微生物群落功能特性主成分分析得分圖

從6類碳源中31種碳源在2個主成分上的載荷值在表4中可見，除吐溫40，α-環(huán)式糊精，D-木糖，D-半乳糖醛酸，D-葡萄糖氨酸，衣康酸和L-蘇氨酸外，其余24種碳源均集中在第1主成分上，決定了主成分1的變異，主要包括雙親化合物類、氨基酸類、羧酸類、碳水化合物類和胺類。影響主成分2變異的碳源主要包括1-磷酸葡萄糖，D,L-α-磷酸甘油，4-羥基苯甲酸，衣康酸，苯乙胺和腐胺，主要屬于雙親化合物類和胺類。綜合第1、2主成分結(jié)果，被稻谷微生物群落特異利用的碳源有：D-木糖，衣康酸與主成分1呈顯著負(fù)相關(guān)，而與主成分2呈顯著正相關(guān)；丙酮酸甲酯，N-乙酰-D-葡萄糖胺，2-羥基苯甲酸與主成分1呈顯著正相關(guān)，而與主成分2呈顯著負(fù)相關(guān)。

3 結(jié)論

稻谷在未儲藏期，其微生物群落代謝功能最旺盛，在儲藏1年后微生物群落代謝功能達(dá)到最低，其后隨著儲藏時間的增加，微生物群落代謝功能逐漸增加。

在6類碳源利用中，4種稻谷樣品的微生物群落對碳水化合物類碳源的代謝利用能力最強(qiáng)，且其對胺類碳源的代謝利用間存在顯著差異(P<0.05)。

未儲藏新鮮稻谷的微生物群落多樣性最大，進(jìn)入儲藏期后，隨著儲藏時間的增加，微生物群落多樣性呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。

通過主成分分析發(fā)現(xiàn)，未儲藏新鮮稻谷微生物群落的代謝功能與其他儲藏年限稻谷微生物群落的代謝功能存在顯著的差異。