張 輝 馬惠清 王森茂 王曉娟

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院綜合內(nèi)科，北京 100020)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)又稱為震顫麻痹，是一種多發(fā)于老年人群的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。其主要的病理特征為腦內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元變性壞死，由此引起黑質(zhì)紋狀體通路遭受破壞，殼核、尾狀核中多巴胺的含量降低，從而誘發(fā)一系列錐體外系癥狀[1]。PD的發(fā)生是年齡因素、環(huán)境因素以及遺傳等相互作用的結(jié)果，但其具體病因和發(fā)病機(jī)制仍不明確[2]。神經(jīng)炎性反應(yīng)是由小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生多種神經(jīng)炎性反應(yīng)因子導(dǎo)致的細(xì)胞和組織損傷[3]，最終導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡和壞死，加劇神經(jīng)變性過(guò)程。近年來(lái)，研究[4]證實(shí)，慢性神經(jīng)炎性反應(yīng)損傷在PD的發(fā)病中起著至關(guān)重要的作用。

核因子-κB(nuclear factor-κB， NF-κB)是一類能與多種基因啟動(dòng)子部位的κB位點(diǎn)發(fā)生特異性結(jié)合并促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的DNA結(jié)合蛋白的總稱。它能夠與許多基因啟動(dòng)子區(qū)域的固定核苷酸序列結(jié)合而啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄，從而在機(jī)體的免疫應(yīng)答、炎性反應(yīng)以及細(xì)胞的生長(zhǎng)調(diào)控等方面發(fā)揮重要作用[5]。在神經(jīng)系統(tǒng)中，NF-κB幾乎存在于所有類型細(xì)胞中，主要包括神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞，是能夠調(diào)節(jié)多種炎性反應(yīng)和免疫基因表達(dá)的一種重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，參與調(diào)節(jié)許多促炎物質(zhì)，如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β， IL-1β)等的轉(zhuǎn)錄[6]。

銀杏葉提取物(ginkgo biloba extract，EGb)是從銀杏葉中分離純化的提取物，近年來(lái)，藥理學(xué)研究[7]證實(shí)，銀杏葉提取物具有抗血小板活化因子、抗心腦缺血、降血脂、抗氧化、抗炎性反應(yīng)和增強(qiáng)記憶等功能。

本研究利用魚(yú)藤酮皮下注射制備PD大鼠模型，同時(shí)給予不同劑量的銀杏葉提取物觀察其對(duì)腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的影響，同時(shí)觀察其黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元中NF-κB的調(diào)控及其對(duì)腦內(nèi)神經(jīng)炎性反因子TNF-α和IL-1β表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Beckman公司，美國(guó))，UV260紫外分光光度儀(Shimadzu公司，日本)，BiometraUnio II PCR儀(Biometra公司，德國(guó))，Olympus AX70/Coolsnapfx/MetaMorph顯微圖像分析系統(tǒng)(Olympus公司，日本)，低溫離心機(jī)(Beckman公司，美國(guó))，Western blotting成像系統(tǒng)(Vilber Fusion Solo公司,法國(guó))。

魚(yú)藤酮(Sigma公司,美國(guó))，銀杏葉提取物滴劑(威瑪舒培博士藥廠,德國(guó))，TNF-α和IL-1β檢測(cè)試劑盒(南京建成生物科技有限公司)，酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase, TH，Sigma公司,美國(guó))、NF-κB P56抗體(Abcam公司,美國(guó))，β-actin和山羊抗兔IgG抗體(1∶1 000，Santa Cruz公司,美國(guó))。

3月齡雄性SD大鼠32只，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

將32只實(shí)驗(yàn)大鼠采用數(shù)字表法隨機(jī)分為對(duì)照組、PD模型組、低劑量組和高劑量組，每組8只。所有實(shí)驗(yàn)大鼠在實(shí)驗(yàn)期間自由進(jìn)食水，在同一實(shí)驗(yàn)室按照清潔級(jí)標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)。

1.2.2 動(dòng)物模型的制備及藥物干預(yù)

PD模型組和藥物干預(yù)組(低劑量和高劑量)大鼠按照2.0 mg·kg-1·d-1背部皮下注射魚(yú)藤酮(魚(yú)藤酮溶解在葵花籽油中混勻， 4 ℃避光保存)，其中治療組大鼠在魚(yú)藤酮注射前30 min給予EGb灌胃治療共30d，給藥濃度為高劑量組100 mg·kg-1·d-1和低劑量組50 mg·kg-1·d-1，對(duì)照組大鼠給予背部皮下注射葵花油1 mL/kg。

1.2.3 取材

藥物干預(yù)24 h后，直接將大鼠斷頭取腦，在冰板上用刀片迅速分離中腦、紋狀體和大腦皮質(zhì)，放入液氮速凍后轉(zhuǎn)入低溫冰箱備用。

1.2.4 蛋白提取及濃度測(cè)量

取每只大鼠中腦和同側(cè)紋狀體組織，加入RIPA組織裂解液，勻漿器放在冰浴中，以2 000 r/min上下勻漿20次，然后吸至1.5 mL離心管中。冰浴放置30 min。4 ℃, 10 000 r/min，離心30 min。小心吸出上清，按實(shí)驗(yàn)需要分裝放入EP管中，-80 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。按蛋白定量試劑盒微量測(cè)定方法測(cè)定組織勻漿總蛋白含量。分別取25 μL蛋白標(biāo)準(zhǔn)液和樣品勻漿液 (1∶40)，放入96孔板中，加200 μL工作液(A∶B=50∶1)，30 s混勻。置培養(yǎng)箱中37 ℃孵育30 min。冷卻到室溫，用酶標(biāo)儀在570nm測(cè)定各孔吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品蛋白含量。

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附法

采用酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)TNF-α和IL-1β，取適量紋狀體組織標(biāo)本，研磨勻漿，取適量加至已包被抗體的酶標(biāo)板孔內(nèi)，4 ℃緩慢搖晃孵育過(guò)夜，采用試劑盒自帶的洗滌液進(jìn)行洗滌，加入一抗，室溫孵育2h，洗滌，再加入二抗，洗滌后進(jìn)行TMB顯色，用酶標(biāo)儀在450nm測(cè)定各孔吸光度值。

1.2.6 Western blotting

取適量相關(guān)樣本蛋白，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)移至NC膜上，用5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂奶粉室溫封閉，依照實(shí)驗(yàn)?zāi)康姆謩e加入兔源GFAP(1∶1 000)、Iba1和NF-κB P65抗體(1∶500)，4 ℃過(guò)夜。NC膜以TTBS洗3次。山羊抗兔IgG 抗體(1∶1 000)室溫避光1 h，漂洗3次，成像系統(tǒng)掃描并測(cè)定目標(biāo)蛋白吸光度值，與β-actin ( 1∶3 000) 比值后，做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)大鼠的一般狀況

魚(yú)藤酮背部皮下注射30d后，PD模型組大鼠行為學(xué)出現(xiàn)明顯改變，表現(xiàn)為主動(dòng)活動(dòng)減少，活動(dòng)時(shí)步態(tài)不穩(wěn)多向一側(cè)偏斜等類PD樣癥狀。治療組大鼠給予銀杏葉提取物灌胃后上述癥狀有明顯改善，且高劑量組癥狀改善更加顯著。

2.2 各組大鼠紋狀體中神經(jīng)炎性反應(yīng)因子的改變

與對(duì)照組相比，PD模型組大鼠紋狀體組織中炎性反應(yīng)因子TNF-α和IL-1β增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。銀杏葉提取物干預(yù)后紋狀體中TNF-α和IL-1β較模型明顯減少(P<0.05)，且有明顯的劑量依賴性，高劑量組較低劑量組TNF-α和IL-1β明顯減少(P<0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠腦內(nèi)TNF-α和IL-1β的比較Tab.1 The content of TNF-α and IL-1β in rat brains

*P<0.05，**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsPD group;△P<0.05vsL-EGb group;TNF-α：tumor necrosis factor-α;IL-1β:interleukin-1β;PD:Parkinson’s disease;L-EGb:low dose ginkgo biloba extract;H-EGb: high dose ginkgo biloba extract.

2.3 各組大鼠腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP和Iba1的表達(dá)改變

與對(duì)照組相比，PD模型組大鼠腦組織中GFAP和Iba1表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，銀杏葉提取物干預(yù)后GFAP和Iba1表達(dá)與模型組相比被抑制(P<0.05)，且有明顯的劑量依賴性，高劑量組較低劑量組GFAP和Iba1表達(dá)明顯減少(P<0.05)(圖1，表2)。

Con: control;PD:Parkinson’s disease;L-EGb:low dose EGb;H-EGb: high dose EGb.

表2 各組大鼠腦內(nèi)GFAP、Iba1 和 NF-κB的比較Tab.2 Expression of GFAP，Iba1 and NF-κB in rat brains of each group

*P<0.05，**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsPD group;△P<0.05vsL-EGb;NF-κB:nuclear factor-κB;PD:Parkinson’s disease;L-EGb:low dose ginkgo biloba extract;H-EGb: high dose ginkgo biloba extract.

2.4 各組大鼠中腦NF-κB的表達(dá)改變

與對(duì)照組相比，PD組大鼠中腦NF-κB表達(dá)明顯增加(P<0.01)，銀杏葉提取物干預(yù)后明顯抑制NF-κB表達(dá)(P<0.05)，且有明顯的劑量依賴性，高劑量組較低劑量組NF-κB表達(dá)明顯減少(P<0.05)(表2，圖2)。

圖2 不同劑量銀杏葉提取物對(duì)大鼠腦內(nèi)NF-κB表達(dá)的影響Fig.2 The effect of different dosage of ginkgo biloba extract (EGb) for NF-κB of the rat brains

Con: control;PD:Parkinson’s disease;L-EGb:low dose EGb;H-EGb: high dose EGb.

3 討論

慢性神經(jīng)炎性應(yīng)激反應(yīng)是各種神經(jīng)退行性疾病的主要病理改變之一[8-9]。隨著年齡的老化，機(jī)體的免疫功能紊亂，導(dǎo)致體內(nèi)炎性反應(yīng)因子分泌增加，導(dǎo)致機(jī)體損傷，其中腦的衰老可能涉及中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)免疫活性細(xì)胞過(guò)度激活而導(dǎo)致的免疫炎性反應(yīng)，其病灶周圍存在大量激活的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞，可產(chǎn)生大量補(bǔ)體、炎性細(xì)胞因子及其他急性期反應(yīng)物等，故小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性反應(yīng)的關(guān)鍵靶點(diǎn)[10-11]。筆者的前期研究[12]顯示魚(yú)藤酮背部皮下注射可以導(dǎo)致大鼠腦內(nèi)TH明顯減低，出現(xiàn)類PD樣癥狀，表明魚(yú)藤酮是一種有效制備PD動(dòng)物模型的工具藥[12]。本研究中筆者發(fā)現(xiàn)，在PD 動(dòng)物模型腦內(nèi)出現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物GFAP和Iba1表達(dá)的明顯增加，表明小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞被激活和誘導(dǎo)，同時(shí)可見(jiàn)PD動(dòng)物模型腦內(nèi)的炎性反應(yīng)因子TNF-α和IL-1β的表達(dá)也明顯增加，說(shuō)明PD動(dòng)物模型腦內(nèi)發(fā)生了明顯的神經(jīng)炎性反應(yīng)。

筆者前期實(shí)驗(yàn)[12]證實(shí)，銀杏葉提取物能明顯增加PD大鼠模型腦內(nèi)TH的表達(dá)，從而增加腦內(nèi)多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)的含量，改善PD大鼠模型的運(yùn)動(dòng)障礙癥狀。銀杏葉提取物具有多種生物學(xué)活性，在本研究中筆者進(jìn)一步探討了其對(duì)PD動(dòng)物模型腦內(nèi)神經(jīng)炎性損傷的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，神經(jīng)毒性物質(zhì)魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的PD模型腦內(nèi)出現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活。激活的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)影響周圍局部組織環(huán)境中炎性反應(yīng)因子TNF-α和IL-1β的釋放，同時(shí)誘導(dǎo)黑質(zhì)神經(jīng)元內(nèi)的NF-κB表達(dá)增加。銀杏葉提取物能有效抑制上述炎性反應(yīng)，從而減少大鼠腦內(nèi)黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的損傷，起到腦保護(hù)作用。

NF-κB是介導(dǎo)許多免疫和炎性反應(yīng)的中心物質(zhì)，同時(shí)也是細(xì)胞凋亡信號(hào)通路中一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，它主要通過(guò)調(diào)節(jié)一系列參與炎性反應(yīng)及凋亡的基因轉(zhuǎn)錄來(lái)發(fā)揮作用，是慢性神經(jīng)炎性反應(yīng)中的關(guān)鍵蛋白[13]。本研究顯示，帕金森病大鼠腦內(nèi)出現(xiàn)NF-κB表達(dá)明顯增加，既往研究[14]證實(shí)，NF-κB的過(guò)度激活可以誘導(dǎo)半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶3表達(dá)，從而加速神經(jīng)細(xì)胞凋亡和壞死。本研究證實(shí)，銀杏葉提取物能有效抑制NF-κB的表達(dá)，減少炎性反應(yīng)因子TNF-α和IL-1β的釋放，從而有效減少帕金森病大鼠腦內(nèi)黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元損傷，是治療PD的有效方法。

本研究證實(shí)銀杏葉提取物能有效抑制腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活，減少腦內(nèi)NF-κB的表達(dá)和炎性反應(yīng)因子TNF-α和IL-1β的釋放，改善PD大鼠腦內(nèi)的神經(jīng)炎性反應(yīng)，起到腦保護(hù)作用，為PD的臨床治療提供了新的靶點(diǎn)，同時(shí)為臨床藥物的選擇提供了新的思路。