周丹蓉 葉新福 王小安 韋曉霞 劉萍

摘 ?要??為研究辣木多糖的酶促提取工藝和辣木不同部位的多糖含量，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以多糖提取率為指標(biāo)，選擇纖維素酶用量、提取溫度、提取時(shí)間、液料比為試驗(yàn)因素，采用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)對(duì)纖維素酶輔助提取辣木多糖的工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，并在此基礎(chǔ)上研究辣木不同部位的多糖含量差異。4種因素對(duì)辣木多糖提取率的影響順序依次為：纖維素酶用量>提取溫度>液料比>提取時(shí)間。建立辣木多糖提取率（Y）與纖維素酶用量（X₁）、提取溫度（X₂）、提取時(shí)間（X₃）、液料比（X₄）的二次正交回歸模型：Y = 18.6602+0.8134X₁+0.7572X₂–0.4312X₃+0.6909X₄–?0.5181X₁²–0.4935X₂²–0.6277X₄²，該模型擬合度好，4個(gè)因素均對(duì)多糖提取率有顯著影響（p<0.05）。通過回歸模型獲得優(yōu)化的提取工藝為：纖維素酶用量1.60%，提取溫度53?℃，提取時(shí)間68?min，液料比52∶1，在此條件下辣木多糖提取率為19.83%，實(shí)際值與預(yù)測(cè)值一致。辣木不同部位的多糖含量結(jié)果表明，辣木根、花、嫩葉、莖中均含有豐富的多糖，其中根中含量最高且極顯著高于其他部位（p<0.01），可進(jìn)一步開發(fā)利用。采用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)優(yōu)化得到的辣木多糖酶促提取工藝條件準(zhǔn)確可靠，可有效提高辣木多糖提取率并可在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。

關(guān)鍵詞 ?辣木;多糖;纖維素酶;正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì);含量中圖分類號(hào)??Q949.748.5??????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼??A

Optimization for Enzymatic Extraction Process of Polysaccharide from Moringa oleifera?Lam. and the Contents

ZHOU Danrong¹， YE Xinfu^1*， WANG Xiaoan¹， WEI Xiaoxia¹， LIU Ping²

1.?Fruit Research Institute， Fujian Academy of Agricultural Sciences， Fuzhou， Fujian 350013， China; 2. Yangtze University， Jingzhou， Hubei 434023， China

Abstract ?Single factor experiments?incluing?enzymatic dosage， extraction temperature， extraction time， ratio of liquid to material，?and quadratic regression orthogonal rotation combination design were?used?to optimize the?enzymatic extraction process of polysaccharide fromMoringa oleiferaLam..?The quadratic orthogonal regression model of extracted polysaccharide rate （Y） for enzymatic dosage （X₁）， extraction temperature?（X₂）， extraction time?（X₃） and?ratio of liquid to material?（X₄） wasY=18.6602+0.8134X₁+0.7572X₂–0.4312X₃+0.6909X₄–0.5181X₁²–0.4935X₂²–0.6277X₄²， which had a?good fitting degree. The four factors had significant effects on rate of polysaccharide extracted （p<0.05）. Furthermore， the optimal compound enzymatic extraction process conditions were as follows： enzymatic dosage of 1.60%， extraction temperature of 53?℃， extraction time of 68 min， and ratio of liquid to material of 52∶1. Under optimal conditions， the verified value of extracted polysaccharide rate was 19.83%. The contents of polysaccharide from different parts ofMoringahad remarkable difference. The content was ranked downward?in root， flower， tender leaves， and stalk. It was?accurate and reliable that the quadratic regression orthogonal rotation combination design was used to optimize enzymatic extraction process conditions，and the extraction efficiency of polysaccharide fromMoringacould?be improved effectively， so it could?be applied in the actual production. Furthermore， the content of polysaccharide in the root ofMoringawas the highest?and it was worthy of exploitation and utilization.

Keywords ?Moringa oleiferaLam.;?polysaccharide;?cello lase;?orthogonal rotation combination design;?content

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.01.023

辣木（Moringa oleiferaLam.）為辣木科辣木屬熱帶落葉喬木，原產(chǎn)于北印度喜馬拉雅區(qū)域及非洲，目前已在我國(guó)廣東、福建等省大面積種植。辣木含有氨基酸、礦質(zhì)元素、微量元素等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，被譽(yù)為“生命之樹”;辣木也是治療糖尿病、高血壓、皮膚病、貧血癥、關(guān)節(jié)炎、腫瘤等疾病的傳統(tǒng)藥材^[1-4]。近年來(lái)，人們對(duì)辣木營(yíng)養(yǎng)成分和藥用成分的研究越來(lái)越系統(tǒng)和廣泛，發(fā)現(xiàn)辣木不同部位均含有生物活性成分^[5-7]，其中辣木多糖為辣木提取物中的重要有效成分之一^[8]，具有清除自由基、抗丙肝病毒等多種活性^[9-10]，有很高的利用價(jià)值。

植物多糖是植物體內(nèi)普遍存在的一大類生物大分子，有提高機(jī)體免疫力、降血糖、降血脂、抗腫瘤等多種重要的生物活性，是天然藥物的常見來(lái)源^[10]。植物多糖的提取工藝仍是研究熱點(diǎn)，常見的提取方法有溶劑提取法、酸提法、堿提法、酶促法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法等。其中，酶技術(shù)是近年來(lái)廣泛應(yīng)用的一項(xiàng)生物技術(shù)，在多糖提取過程中，使用酶可降低提取條件，在比較溫和的條件下分解植物組織，還可分解提取液中的淀粉、果膠、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，提高提取效率。常用的酶有蛋白酶、纖維素酶、果膠酶等。酶解法的優(yōu)勢(shì)越來(lái)越受到研究人員的關(guān)注，有眾多關(guān)于酶在多種植物多糖提取中應(yīng)用的報(bào)道^[11]，而在辣木多糖的提取研究中^[12-14]未見酶促法提取的報(bào)道。本研究選擇纖維素酶，采用酶促法和二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)對(duì)辣木中多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，建立回歸模型，探討最佳提取條件;在此基礎(chǔ)上研究辣木植株不同部位多糖的含量，以期為辣木多糖的有效提取利用提供依據(jù)。

1??材料與方法

1.1材料

1.1.1 ?植物材料??辣木的根、莖、葉、花于2016年5月17日采自福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所辣木試驗(yàn)基地（北緯26°7′47″，東經(jīng)119°19′59″），種子于2015年12月10日采于該基地，經(jīng)電熱恒溫鼓風(fēng)干燥機(jī)80?℃烘干，粉碎后過80目篩，收集篩下物密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 ?主要試劑??纖維素酶：Solarbio，北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：C8270，酶活：3 U/mg;無(wú)水葡萄糖、硫酸、蒽酮等均為分析純?cè)噭?/p>

1.1.3 ?主要儀器??TU-1900雙光束紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;FW100高速萬(wàn)能粉碎機(jī)：蘇州江東精密儀器有限公司;FA2004電子分析天平：上海恒平科學(xué)儀器有限公司;UNIQUE-S15超純水機(jī)：銳思捷科學(xué)儀器有限公司;SHB-III循環(huán)水式多用真空泵：上海亞榮生化儀器廠;PCD-C3000電熱恒溫鼓風(fēng)干燥機(jī)：上海龍躍儀器設(shè)備有限公司。

1.2方法

1.2.1 ?多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制??多糖的測(cè)定以無(wú)水葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，采用蒽酮-硫酸比色法^[15]。準(zhǔn)確稱取無(wú)水葡萄糖（已于120?℃烘箱中烘1 h，取出放干燥器冷卻備用）標(biāo)準(zhǔn)品25 mg，精密稱定，置250 mL量瓶中，加反滲透水適量溶解，稀釋至刻度，搖勻，即得（每 l mL中含無(wú)水葡萄糖0.1?mg）。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密量取對(duì)照品溶液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，分別置具塞試管中，分別加水補(bǔ)至2.0 mL，精密加入硫酸蒽酮溶液（稱取蒽酮0.1?g，加濃硫酸100 mL溶解，搖勻）8 mL，搖勻，置沸水浴中加熱15 min，取出，迅速冷卻，以相應(yīng)的試劑為空白對(duì)照，625 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。得溶液中無(wú)水葡萄糖濃度C（mg/mL）與其吸光度A的回歸方程為：C= 0.329×A–0.055，相關(guān)系數(shù)r=0.997，說明該檢測(cè)方法中，葡萄糖溶液濃度與吸光度有良好的線性關(guān)系。

1.2.2 ?多糖的提取??多糖的提取參照梁鵬等^[9]的方法并略加修改。精確稱取干燥的辣木根粉末0.5000 g于三角瓶中，提取液為pH 5.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液，水浴搖床（100 r/min），浸提1次。根據(jù)考察的因素改變相應(yīng)的試驗(yàn)參數(shù)，提取后趁熱抽濾，用少量提取液洗滌濾器，合并濾液與洗液，放冷，移至500 mL量瓶中，用提取液稀釋至刻度，搖勻，備用。

1.2.3 ?多糖的測(cè)定??多糖的測(cè)定采用蒽酮-硫酸比色法^[15]。精確量取樣品溶液0.5 mL于10 mL容量瓶中，以試劑空白為參比，按蒽酮-硫酸比色法測(cè)定其在625 nm處的吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所測(cè)樣品溶液的質(zhì)量濃度，并計(jì)算辣木根粉中多糖的提取率或含量：

式中，C為多糖溶液濃度（mg/mL），n為稀釋倍數(shù)，V為溶液體積（mL），v為測(cè)定溶液體積（mL），m為辣木樣品用量（g）。

1.2.4 ?實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)??采用單因素試驗(yàn)分別單獨(dú)考察纖維素酶用量（0、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、

2.0%、2.4%，以辣木根粉用量為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算）、提取溫度（20、30、40、50、60、70?℃）、提取時(shí)間（30、60、90、120、150?min）、液料比（10∶1、20∶1、40∶1、60∶1、80∶1，mL∶g）、提取次數(shù)（1、2、3次）對(duì)辣木多糖提取率的影響。

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)4個(gè)因素進(jìn)行四元二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)^[16]，二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)的因素水平編碼表見表1。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用SPSS?13.0軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合分析，并采用Duncans新復(fù)極差檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析。

2結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)

2.1.1 ?纖維素酶用量對(duì)辣木多糖提取率的影響??在提取溫度50?℃、提取時(shí)間90 min、液料比40∶1時(shí)，分別測(cè)定纖維素酶用量在0、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%、2.4%條件下的辣木多糖提取率。由圖1可知，使用纖維素酶能顯著提高辣木多糖的提取率，且隨著纖維素酶用量增大，提取率隨之增加。纖維素酶用量<1.2%時(shí)，提取率增加緩慢;酶用量從1.2%提高到2.0%時(shí)，提取率增加迅速;當(dāng)酶用量>2.0%后，增加酶用量雖能提高提取率，但趨勢(shì)趨于平緩。因此，從節(jié)約成本的角度考慮，選擇纖維素酶用量為2.0%為最佳比例，在此條件下，多糖的提取率為19.24%，比未使用酶時(shí)提高45.21%。

2.1.2 ?提取溫度對(duì)辣木多糖提取率的影響??在纖維素酶用量為2.0%、提取時(shí)間90 min、液料比40∶1時(shí)，分別測(cè)定提取溫度25、30、40、50、60、70?℃條件下的辣木多糖提取率。由圖2可知，當(dāng)溫度從25?℃升高到50?℃，多糖提取率緩慢增加，但增幅較小;當(dāng)提取溫度從50?℃提高到60?℃，多糖提取率直線上升，提取率達(dá)19.04%，比25?℃時(shí)提高33.24%，效果顯著;溫度繼續(xù)升高多糖提取率反而下降，主要原因一是溫度過高可能引起多糖降解或轉(zhuǎn)化，二是溫度過高會(huì)使纖維素酶失活（最適溫度為45～65?℃，pH 4.5～6.5），反而起不到促進(jìn)提取的作用。因此，選擇60?℃為最佳提取溫度。

2.1.3 ?提取時(shí)間對(duì)辣木多糖提取率的影響??在纖維素酶用量為2.0%、提取溫度60?℃、液料比40∶1時(shí)，分別測(cè)定提取時(shí)間30、60、90、120、150 min條件下的辣木多糖提取率。如圖3所示，隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)，多糖提取率呈先升高后降低的趨勢(shì)，其中以提取時(shí)間為90?min時(shí)提取率最高，可達(dá)19.74%，故選擇90 min為最佳提取時(shí)間。

2.1.4 ?液料比對(duì)辣木多糖提取率的影響??在纖維素酶用量為2.0%、提取溫度60?℃、提取時(shí)間90 min時(shí)，分別測(cè)定液料比（mL∶g）為10∶1、20∶1、40∶1、60∶1、80∶1條件下的辣木多糖提取率。如圖4所示，以液料比20∶1時(shí)提取率最高，為19.34%;在相同物料時(shí)，隨著提取液體積增大，多糖提取率反而下降。

2.1.5 ?提取次數(shù)對(duì)辣木多糖提取率的影響??在纖維素酶用量為2.0%、提取溫度60?℃、提取時(shí)間90 min、液料比20∶1時(shí)，重復(fù)提取3次，每次提取后分別定容并測(cè)定多糖提取率。從圖5可以看出，第一次酶解浸提提取率為19.34%，第二次酶解浸提提取率僅為3.71%，即第一次酶解浸提即可實(shí)現(xiàn)84.49%的多糖浸出，故研究中為了節(jié)約成本和提高效率，選擇1次酶解浸提即可。

2.2二次回歸正交試驗(yàn)

二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果見表2，按照1.2.2節(jié)方法進(jìn)行試驗(yàn)，多糖提取率由不同試驗(yàn)條件下的測(cè)定值、標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算及換算而得。由結(jié)果可知，不同提取條件下的多糖提取率有一定差異。各項(xiàng)方差分析見表3。

2.2.1 ?回歸方程的建立??運(yùn)用SPSS?13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)（表2）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得到纖維素酶用量（X₁）、提取溫度（X₂）、提取時(shí)間（X₃）、料液比（X₄）4個(gè)因素與辣木多糖提取率（Y）之間的二次正交回歸方程為：

Y=18.6602+0.8134X₁+0.7572X₂–0.4312X₃+

0.6909X₄–0.1720X₁X₂+0.0810X₁X₃+0.0053X₁X₄+

0.1076X₂X₃+0.0897X₂X₄+0.0483X₃X₄–0.5181X₁²–

0.4935X₂²–0.1914X₃²–0.6277X₄²。

由方差分析結(jié)果可知，模型中X₁X₂、X₁X₃、X₁X₄、X₂X₃、X₂X₄、X₃X₄及X₃²項(xiàng)對(duì)提取率的影響均不顯著（p>0.05）。由于試驗(yàn)設(shè)計(jì)的正交性，各回歸系數(shù)間無(wú)相關(guān)性，因此可根據(jù)方差分析結(jié)果，直接剔除模型中的不顯著項(xiàng)建立回歸方程。簡(jiǎn)化的二次正交回歸方程為：

Y=18.6602+0.8134X₁+0.7572X₂–0.4312X₃+

0.6909X₄– 0.5181X₁²–0.4935X₂²–0.6277X₄²。

2.2.2 ?回歸模型的顯著性檢驗(yàn)??按照顯著性條件對(duì)回歸方程進(jìn)行可靠性檢驗(yàn)。由表3可知，回歸模型F=4.9353，p<0.01，表明該模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可以建立回歸方程;失擬項(xiàng)F=1.2043，p>0.05，失擬項(xiàng)不顯著，說明回歸模型與實(shí)際情況擬合好，無(wú)失擬因素存在，可用回歸方程代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

2.2.3 ?主效應(yīng)分析??顯著性檢驗(yàn)的p值可反映各試驗(yàn)因素對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)影響程度的大小，p值越小表明該因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響越大。由表3可知，4個(gè)試驗(yàn)因素對(duì)辣木多糖提取率的影響順序?yàn)椋豪w維素酶用量（X₁）>提取溫度（X₂）>料液比（X₄）>提取時(shí)間（X₃）。

2.2.4 ?單效應(yīng)分析??用降維法將任意3個(gè)因素固定在零水平，得到第4個(gè)因素與辣木多糖提取率的效應(yīng)方程分別為：

Y₁=18.6602+0.8134X₁–?0.5181X₁²

Y₂=18.6602+ 0.7572X₂–0.4935X₂²

Y₃=18.6602–0.4312X₃– 0.1914X₃²

Y₄=18.6602+0.6909X₄–0.6277X₄²

以辣木多糖提取率與各因素水平作圖，由圖6可知，4個(gè)因素與辣木多糖提取率的關(guān)系均為開口向下的拋物線關(guān)系，說明這4個(gè)因素對(duì)提取率的影響均存在一個(gè)合理的范圍，即對(duì)多糖提取率的影響均呈先上升后下降的變化趨勢(shì)。這均與單因素試驗(yàn)結(jié)果相吻合。纖維素酶用量、提取溫度、料液比的變化趨勢(shì)接近，但纖維素酶用量、提取溫度的斜率更大，說明其作用更大，隨著纖維素酶用量增加或提取溫度增加，多糖提取率不斷增加。

2.3辣木多糖提取最優(yōu)方案及驗(yàn)證

通過回歸模型預(yù)測(cè)的酶促提取辣木多糖的最優(yōu)提取工藝為：纖維素酶用量1.57%、提取溫度52.96?℃、提取時(shí)間67.69?min、液料比（mL∶g）52.09∶1，考慮到實(shí)際提取中的可操作性，最優(yōu)提取工藝優(yōu)化為：纖維素酶用量1.60%、提取溫度53?℃、提取時(shí)間68?min、液料比52∶1，辣木多糖提取率預(yù)測(cè)值為20.06%。在此條件下對(duì)模型預(yù)測(cè)條件進(jìn)行驗(yàn)證，經(jīng)過3次平行試驗(yàn)，實(shí)際多糖提取率為19.83%±1.35%，相對(duì)誤差為0.0145，實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值差異較小，說明此方法可以較好地對(duì)辣木多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，回歸模型可靠性高。

2.4辣木不同部位的多糖含量

利用回歸模型得到的最優(yōu)方案分別提取測(cè)定辣木嫩葉、成熟葉、老葉、梗、根、花、種子中的多糖含量，結(jié)果見圖7。由圖7可知，多糖含量部位依次為：根>花>嫩葉>莖>成熟葉>老葉>種子，辣木根中多糖的含量極顯著高于其他部位（p<0.01），可達(dá)18.83%;其次為花，也極顯著高于其他部位;多糖在種子中含量最低，僅為2.15%。由此可見，辣木根中的多糖含量極為豐富，且遠(yuǎn)高于種子，兩者相差8.22倍。

不同小寫字母表示在0.05水平下差異顯著，不同大寫字母表示在0.01水平下差異極顯著。

Different lowercase letters mean significant difference?at the 0.05 level;?different capital letters?mean?extremely significantdifference?at the 0.01 level.

3討論

本研究采用二次回歸旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)對(duì)纖維素酶輔助提取辣木多糖的主要影響因素進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，并建立回歸模型。結(jié)果表明，回歸模型擬合度較好，具科學(xué)性、可靠性;纖維素酶用量、提取溫度、料液比對(duì)辣木多糖的提取率有極顯著影響。

目前，有關(guān)辣木多糖的提取方法研究主要為水提法及超聲波提取法等^{[9， 12]}。水提法提取長(zhǎng)、能耗大，且提取率較低;超聲波提取法雖提取率較高，但因設(shè)備成本高，工業(yè)化生產(chǎn)難度較大。酶法輔助浸提是利用酶的高度專一性，在合適的條件下，使植物細(xì)胞壁破裂，溶劑充分進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)將活性成分溶出，從而達(dá)到提高提取率的目的;此外，酶法浸提反應(yīng)條件溫和，可有效保持多糖的生物活性。本研究利用纖維素酶對(duì)辣木細(xì)胞中的纖維素、半纖維素等的降解作用對(duì)多糖進(jìn)行提取，在纖維素酶用量1.60%、提取溫度53?℃、提取時(shí)間68?min、液料比52∶1條件下浸提，辣木多糖提取率平均值為19.83%，比梁鵬等^[9]水提法所需的提取溫度低、時(shí)間短且提取率高，比彭凌^[12]超聲波提取法所需提取溫度低但提取時(shí)間長(zhǎng)，與超聲波提取法中除蛋白后的多糖含量相差不大?？梢?，采用酶法輔助浸提辣木多糖具有提取溫度低、時(shí)間短、提取率高等優(yōu)點(diǎn)。

辣木多糖的含量在不同部位有較大差異。本研究研究結(jié)果與孫鳴燕^[17]的研究均表明，辣木根中多糖含量最高，顯著高于其他組織;但本研究中種子中多糖含量最低，與孫鳴燕^[17]的結(jié)果不同，這可能是多糖的構(gòu)成成分、種類復(fù)雜^[18]，且含量與品種、產(chǎn)地、栽培條件、生長(zhǎng)年限等有密切關(guān)系^[19-20]，推測(cè)這些因素是造成結(jié)果差異的原因。因此，不同品種、不同產(chǎn)地的辣木中多糖含量的差異，以及辣木根多糖的種類、結(jié)構(gòu)以及生物活性等還有待進(jìn)一步研究。

多糖存在于多種植物中，具有多種生物活性，目前已有大量關(guān)于石斛、靈芝、枸杞、銀杏等多種藥用或食用植物中多糖含量及功能的研究報(bào)?道^[21-24]。對(duì)比發(fā)現(xiàn)，辣木根多糖的含量高于靈芝子實(shí)體^[25]、枸杞葉與干枸杞^[26-27]、銀杏葉^[28]等，與細(xì)葉石斛根中多糖含量（11.74%～19.85%）相當(dāng)^[29]。由此可見，辣木根多糖具有較高的應(yīng)用價(jià)值和發(fā)展?jié)摿Α?/p>

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