吉訓(xùn)志 李煥苓 王果 高兆銀 孫進(jìn)華 王家保

摘? 要? 為研究糖代謝在荔枝體胚發(fā)生過(guò)程中的作用，將‘大丁香和‘新球蜜荔胚性愈傷組織接種在TD培養(yǎng)基上，并將‘新球蜜荔接種在TX培養(yǎng)基上，對(duì)比體胚誘導(dǎo)過(guò)程中3種胚性培養(yǎng)物之間淀粉、蔗糖等糖組分及其代謝相關(guān)酶活性變化，以期從糖代謝方面找出影響荔枝體胚發(fā)生效率差異的關(guān)鍵因素。結(jié)果表明：在體胚發(fā)生過(guò)程中，‘新球蜜荔在2種培養(yǎng)基上的淀粉含量都低于‘大丁香;三者的葡萄糖與果糖含量變化相似，但‘大丁香都高于‘新球蜜荔，而‘新球蜜荔的蔗糖含量則高于‘大丁香;‘新球蜜荔的淀粉酶、β-淀粉酶活性都高于‘大丁香，而α-淀粉酶活性相似?！虑蛎劾蟮恼崽呛厦讣霸赥D培養(yǎng)基上的酸性轉(zhuǎn)化酶活性高于‘大丁香，但中性轉(zhuǎn)化酶活性是以‘大丁香偏高，且‘新球蜜荔在TX培養(yǎng)基上也以中性轉(zhuǎn)化酶為主。由此‘新球蜜荔通過(guò)淀粉酶、蔗糖合酶及轉(zhuǎn)化酶將淀粉轉(zhuǎn)化成蔗糖為體胚發(fā)生提供物質(zhì)能量，而高活性的中性轉(zhuǎn)化酶與低活性的淀粉酶，使‘大丁香的蔗糖沒(méi)有得到積累，使其體胚發(fā)生效率低于‘新球蜜荔。

關(guān)鍵詞? 荔枝;體胚發(fā)生;糖代謝;酶活性中圖分類號(hào)? S667.1? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? A

Abstract? In order to investigate the effect of sugar metabolism on the somatic embryogenesis of litchi， embryonic callus of ‘Dadingxiang and ‘Xinqiumili were inoculated on TD medium， respectively， and the embryonic callus of ‘Xinqiumili was inoculated on TX medium. Contents of starch， sucrose and other sugar components and activities of the metabolism-related enzymes were compared among the three embryonic cultures. The results showed that starch content on TD and TX medium in ‘Xinqiumili were lower than that in ‘Dadingxiang during somatic embryogenesis. All the glucose and fructose content were similar， but glucose and fructose contents in ‘Dadingxiang was higher than that in ‘Xinqiumili， while sucrose content in ‘Xinqiumili was higher than that in ‘Dadingxiang. The activity of amylase and β-amylase in ‘Xinqiumili were higher than that in ‘Dadingxiang， but the α-amylase activity in ‘Xinqiumili and ‘Dadingxiang were similar. The activity of sucrose synthase and acid invertase on TD medium in ‘Xinqiumili were higher than that in ‘Dadingxiang， but neutral invertase activity in ‘Dadingxiang was higher than that in ‘Xinqiumili， and also the dominant by neutral invertase on TX medium in ‘Xinqiumili. Through converted the starch into the sucrose by amylase， sucrose synthase and invertase in ‘Xinqiumili was provided material energy for somatic embryogenesis， while high neutral invertase activity and low amylase activity in ‘Dadingxiang can not accumulation of sucrose， maked the efficiency of somatic embryogenesis in ‘Dadingxiang was lower than that in ‘Xinqiumili.

Keywords? litchi （Litchi chinensis Sonn.）; somatic embryogenesis; carbohydrate metabolism; enzyme activity

DOI? 10.3969/j.issn.1000-2561.2019.04.008

在植物體胚發(fā)生過(guò)程中，糖既作為能量物質(zhì)提供碳源，也作為一種滲透調(diào)節(jié)劑，加大細(xì)胞內(nèi)滲透壓，促進(jìn)細(xì)胞吸收營(yíng)養(yǎng)用于生長(zhǎng)代謝。糖代謝相關(guān)酶通過(guò)對(duì)糖組分進(jìn)行調(diào)控，能夠影響植物體胚發(fā)生[1]。蔗糖還作為一種信號(hào)分子在植物體胚發(fā)生過(guò)程中起調(diào)控作用。在培養(yǎng)基中通過(guò)添加不同濃度的蔗糖，可以調(diào)節(jié)體胚發(fā)生的能力與質(zhì)量[2-3]。在植物發(fā)育的過(guò)程中，植物組織中淀粉及各種糖組分變化不同，與糖代謝相關(guān)的酶如中性轉(zhuǎn)化酶、酸性轉(zhuǎn)化酶、蔗糖合酶與淀粉酶等，其活性也是多種變化，表明糖代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在植物發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[4]。在人參[5]、棕櫚[6]、桫欏[7]、沙地云杉[8]和楸樹[9]對(duì)其體胚發(fā)生的研究中，發(fā)現(xiàn)淀粉與糖含量變化與其體胚發(fā)生密切相關(guān)，但是未從糖代謝方面進(jìn)一步揭示其對(duì)于體胚發(fā)生的影響，并且尚未有研究糖代謝與荔枝體胚發(fā)生關(guān)系的報(bào)道。本研究旨在通過(guò)研究糖代謝相關(guān)生理變化機(jī)制，弄清糖代謝相關(guān)酶與糖組分含量變化對(duì)荔枝體胚發(fā)生的影響，為從糖代謝方面調(diào)控荔枝體胚發(fā)生效率提供理論基礎(chǔ)。

筆者們前期在對(duì)2個(gè)荔枝品種胚性愈傷組織進(jìn)行體胚誘導(dǎo)的研究中發(fā)現(xiàn)，‘新球蜜荔荔枝品種在TD培養(yǎng)基上培養(yǎng)第9天開始出現(xiàn)球形胚，在TD與TX培養(yǎng)基上培養(yǎng)第12天開始出現(xiàn)心形胚，兩者都在培養(yǎng)15～18 d中出現(xiàn)魚雷形胚，并且體胚大量出現(xiàn)，而‘大丁香荔枝品種在TD培養(yǎng)基上培養(yǎng)第15天出現(xiàn)心形胚，培養(yǎng)第18天出現(xiàn)畸形胚，但未見體胚大量出現(xiàn)[10]。本研究擬對(duì)比2個(gè)荔枝品種上述體胚發(fā)生過(guò)程中培養(yǎng)物的糖組分及糖代謝相關(guān)酶類變化，探討這些變化與體胚發(fā)生的關(guān)系，以期為荔枝體胚發(fā)生機(jī)制研究提供基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

挑取事先培養(yǎng)在含2，4-D和KT的MS培養(yǎng)基上的‘新球蜜荔和‘大丁香2個(gè)荔枝品種胚性愈傷組織，接種在TD培養(yǎng)基（MS+0.1 mg/L NAA+0.5 mg/L TDZ+0.1 g/L肌醇+0.4 g/L水解乳蛋白（LH）+100 mL/L椰汁+60 g/L蔗糖+10 g/L瓊脂）上，再將同樣的‘新球蜜荔胚性愈傷組織接種在TX培養(yǎng)基（MS+0.1 mg/L NAA+5 mg/L ZT+0.1 g/L肌醇+0.4 g/L水解乳蛋白（LH）+100 mL/L椰汁+60 g/L蔗糖+10 g/L瓊脂）上，詳見表1。從開始接種在TD和TX培養(yǎng)基上為0 d，此后培養(yǎng)第6、9、12、15、18天進(jìn)行取樣并進(jìn)行凍存[11]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3批次。

1.2? 方法

1.2.1? 淀粉及蔗糖、葡萄糖與果糖含量測(cè)定? 淀粉提取與測(cè)定參照賴鐘雄等[12]的方法，取待測(cè)材料0.1 g，用碘-淀粉比色法測(cè)定樣品中的淀粉含量，重復(fù)3次。

蔗糖等糖組分提取參照楊俊等[13]的方法并稍做改動(dòng)：取待測(cè)材料0.5 g，加入1 mL的80%乙醇，參照上述研磨步驟，將上清液進(jìn)行冷凍高壓抽干后，用0.5 mL的超純水重新溶解，于0.45 μm微孔濾膜進(jìn)行過(guò)濾，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

色譜分離條件：色譜柱為Waters色譜柱（Xbridge Amide 3.5 mm 250 mm×4.6 mm），柱溫為30 ℃，進(jìn)樣體積為10 μL。流動(dòng)相：乙腈（色譜純）與超純水（含0.2%濃氨水）的體積比為75∶25，流速為1.0 mL/min，進(jìn)行洗脫。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（3300，美國(guó)Alltech）溫度設(shè)置為80 ℃，氮?dú)饬魉贋?.0 L/min，增益為2。運(yùn)用empower2軟件進(jìn)行儀器控制，數(shù)據(jù)收集與處理。將樣品測(cè)定出各種糖的峰面積，分別參照對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，推算出樣品中各種糖含量。

1.2.2? 淀粉代謝相關(guān)酶活性的測(cè)定? 參照黃淺[14]的方法并改動(dòng)。取待測(cè)材料0.1 g，加入1 mL蒸餾水，參照上述步驟研磨，制取粗酶液備用。通過(guò)測(cè)定淀粉分解成還原糖含量來(lái)表示淀粉酶活性，α-淀粉酶是事先在70 ℃水浴保溫15 min后，進(jìn)行測(cè)定得到結(jié)果。β-淀粉酶活性以淀粉酶活性減去α-淀粉酶活性表示。

1.2.3? 蔗糖代謝相關(guān)酶活性的測(cè)定? 糖代謝相關(guān)酶測(cè)定參照武紅霞等[4]的方法，取待測(cè)材料0.1 g，通過(guò)測(cè)定蔗糖轉(zhuǎn)化成還原糖的含量來(lái)表示酸性轉(zhuǎn)化酶與中性轉(zhuǎn)化酶的活性，而將單糖底物反應(yīng)30 min再消解后測(cè)定總糖含量來(lái)表示蔗糖合成酶的活性。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用IBM SPSS statistics 25.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），采用LSD（least significant difference）和Duncan法對(duì)處理之間以及同一處理隨時(shí)間變化的差異顯著性進(jìn)行比較，并用Microsoft Excel 2010軟件制作圖表。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 淀粉及蔗糖、葡萄糖與果糖含量變化

XQTD和XQTX的淀粉含量變化都呈不斷下降的趨勢(shì)，DDXTD的淀粉含量變化呈先下降后上升再下降的趨勢(shì)（圖1A）。XQTD的淀粉含量稍微高于XQTX，但在第18天，XQTX高于XQTD，而DDXTD在第0～6天期間低于XQTD，但從第9天開始，DDXTD急劇上升并高于XQTD。

XQTX、XQTD及DDXTD的蔗糖含量變化都呈先升后降的趨勢(shì)（圖1B）。XQTX在第6天到達(dá)峰值，而XQTD在第9天到達(dá)峰值，但XQTX高于XQTD。DDXTD在第9天到達(dá)最高，并在第6～12天的培養(yǎng)中均低于XQTD，但在第18天，DDXTD上升，并超過(guò)XQTD。

XQTX、XQTD及DDXTD的葡萄糖與果糖含量變化都整體呈上升的趨勢(shì)（圖1C，圖1D）。在第18天，XQTD的葡萄糖與果糖含量都高于XQTX。DDXTD是從第6天開始增長(zhǎng)幅度變大，并且在前15 d的培養(yǎng)時(shí)間里都高于XQTD，但在第18天，DDXTD與XQTD差異不顯著。

2.2? 糖代謝相關(guān)酶活性變化

2.2.1? 淀粉代謝相關(guān)酶活性變化? DDXTD與XQTD的淀粉酶（AMY）與β-淀粉酶（β-AMY）活性變化都呈先升后降的趨勢(shì)，XQTX的淀粉酶（AMY）及β-淀粉酶（β-AMY）活性呈先上升后平緩的趨勢(shì)（圖2A，圖2B）。XQTX的這2種酶活性都從第9天開始高于XQTD。DDXTD與XQTD的AMY活性都在第15天達(dá)到最高，DDXTD的β-AMY則是在第12天達(dá)到最高，不過(guò)XQTD的這2種酶活性都比DDXTD高。

XQTD的α-淀粉酶（α-AMY）活性呈不斷上升的趨勢(shì)，XQTX的α-AMY活性有2個(gè)峰，

DDXTD的α-AMY活性變化呈先降后升再降的趨勢(shì)（圖2C）。在第15天，XQTX高于XQTD，而在第18天時(shí)，XQTD高于XQTX。并在第6天時(shí)，DDXTD低于XQTD，隨后DDXTD上升，并從第9天開始高于XQTD，并達(dá)到峰值，在第12～18天期間下降，第18天時(shí)，兩者的α-AMY活性差異不顯著。

2.2.2? 蔗糖代謝相關(guān)酶活性變化? XQTD的蔗糖合成酶（SS）活性變化呈先升后降的趨勢(shì)，XQTX的SS活性呈先升后降再升的趨勢(shì)，DDXTD的SS活性變化呈先升后降再升的趨勢(shì)（圖2D）。三者都在第6天到達(dá)最高點(diǎn)，不過(guò)XQTD的SS活性高于XQTX及DDXTD，但在第18天時(shí)，三者的SS活性差異不顯著。

XQTD的酸性轉(zhuǎn)化酶（AI）活性變化呈不斷上升的趨勢(shì)，而XQTX的AI活性有2個(gè)峰值，DDXTD的AI活性變化呈先下降后上升的趨勢(shì)（圖2E）。從第9天開始，XQTD就一直高于XQTX。在第0天時(shí)，DDXTD遠(yuǎn)高于XQTD，但隨后DDXTD急劇下降，并低于XQTD，第15天時(shí)DDXTD的AI活性又上升，與XQTD差異不顯著。

XQTD的中性轉(zhuǎn)化酶（NI）活性變化呈先降后升的趨勢(shì)，而XQTX的NI活性呈先升后降，DDXTD的NI活性變化呈下降趨勢(shì)（圖2F）。在第9天時(shí)，XQTD的NI活性達(dá)到最低，而XQTX則是第15天出現(xiàn)單峰。DDXTD一直都高于XQTD。

3? 討論

糖與淀粉是植物細(xì)胞在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中供能與儲(chǔ)能的重要碳水化合物，體胚發(fā)生是植物細(xì)胞脫分化和再分化的過(guò)程，而糖代謝途徑在這過(guò)程中起著為體胚發(fā)生提供物質(zhì)能量的作用[15-16]。糖代謝的基本途徑是植物細(xì)胞在淀粉酶的作用下將淀粉轉(zhuǎn)化為蔗糖，蔗糖在轉(zhuǎn)化酶與蔗糖合酶的作用下進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為葡萄糖和果糖供給細(xì)胞用于生命活動(dòng)，葡萄糖和果糖也能在蔗糖合酶的作用下合成蔗糖儲(chǔ)存起來(lái)。

在本研究中，‘新球蜜荔從9 d開始出現(xiàn)體胚，蔗糖合酶活性在第6天出現(xiàn)峰值，蔗糖含量在第9天達(dá)到峰值，而‘大丁香的蔗糖合酶與蔗糖含量都低于‘新球蜜荔，表明蔗糖含量的積累是荔枝體胚發(fā)生的前提。在12 d時(shí)，‘新球蜜荔出現(xiàn)心形胚結(jié)構(gòu)，淀粉酶活性達(dá)到峰值，酸性轉(zhuǎn)化酶活性高于‘大丁香，蔗糖含量下降，果糖與葡萄糖含量上升，表明隨著荔枝體胚發(fā)生并進(jìn)一步分化，果糖與葡萄糖作為碳骨架物質(zhì)，參與了體胚結(jié)構(gòu)的發(fā)育。此后‘新球蜜荔的體胚進(jìn)一步發(fā)育成魚雷型胚結(jié)構(gòu)，果糖與葡萄糖含量不斷上升，并且‘大丁香也開始出現(xiàn)體胚，兩者的糖組分含量相似，不過(guò)‘大丁香仍保持高含量的淀粉，而這可能是抑制‘大丁香體胚發(fā)生的原因之一。

花生體胚發(fā)生中在胚性細(xì)胞時(shí)期有淀粉積累高峰[17]，在柑桔體胚發(fā)生的研究中也有類似現(xiàn)象出現(xiàn)[18]。在對(duì)龍眼體胚發(fā)生的研究中發(fā)現(xiàn)淀粉在體胚發(fā)生早期的胚性愈傷組織階段有累積高峰，并在體胚發(fā)生過(guò)程中含量減少為其他物質(zhì)合成提供物質(zhì)能量[19]。這些現(xiàn)象與本試驗(yàn)出現(xiàn)的情況一致，在體胚發(fā)生過(guò)程中淀粉含量，‘新球蜜荔在培養(yǎng)開始時(shí)就具備了高含量的淀粉，并隨著體胚發(fā)生而不斷下降，但‘大丁香的淀粉含量則是不斷上升，體胚發(fā)生少量且晚，表明淀粉在荔枝體胚發(fā)生過(guò)程中起著重要作用。在培養(yǎng)中，‘大丁香的蔗糖含量低于‘新球蜜荔，而果糖與葡萄糖的含量高于‘新球蜜荔，這可能與‘大丁香需要消耗大量蔗糖來(lái)增殖愈傷組織有關(guān)。而‘大丁香的淀粉酶活性低于‘新球蜜荔，中性轉(zhuǎn)化酶活性高于‘新球蜜荔，而酸性轉(zhuǎn)化酶與蔗糖合酶都低于‘新球蜜荔，表明在糖代謝過(guò)程中不同品種在體胚發(fā)生中主要起作用的糖代謝相關(guān)酶活類型不同，在轉(zhuǎn)化酶中‘新球蜜荔在TX培養(yǎng)基上與‘大丁香都以中性轉(zhuǎn)化酶為主，而‘新球蜜荔在TD培養(yǎng)基上則是以酸性轉(zhuǎn)化酶為主。這些酶造成‘大丁香與‘新球蜜荔的糖組分含量差異，可能與‘大丁香及‘新球蜜荔的體胚發(fā)生能力存在差異有關(guān)。

4? 結(jié)論

‘新球蜜荔以淀粉酶、蔗糖合酶及轉(zhuǎn)化酶的糖代謝系統(tǒng)，有序地對(duì)淀粉與糖組分進(jìn)行正常的調(diào)控，使‘新球蜜荔體胚發(fā)生早且大量。而‘大丁香的淀粉含量則不斷上升，淀粉酶及蔗糖合酶活性也低于‘新球蜜荔，使得‘大丁香以增殖愈傷組織為主，表明淀粉含量與糖代謝相關(guān)酶活變化對(duì)荔枝體胚發(fā)生密切相關(guān)。

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