楊洋 王先宏 楊清輝

摘? 要? 本研究對不同采集地割手密無性系進行耐寒性綜合評價，探究割手密耐寒性與其生長地海拔、緯度的關系，篩選耐寒性種質資源。以40份割手密無性系為試驗材料，在苗期低溫脅迫后測定各無性系材料的7項生理指標，利用相關性分析、聚類分析和模糊隸屬函數分析法對其耐寒性差異進行綜合評價。低溫脅迫處理后，割手密的脯氨酸（Pro）、丙二醛（MDA）、電導率（PMP）、可溶性蛋含量（SP）均呈上升趨勢，其中脯氨酸含量上升最大，升高了43.81%，而葉綠素（Chl）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）均呈下降趨勢，其中葉綠素含量減少35.01%，下降程度最大;葉綠素、脯氨酸、超氧化物歧化酶的變異系數較對照有不同程度的增加，其中增長最大的是葉綠素，是對照的1.76倍;相關性分析顯示，40份割手密無性系耐寒性與其生長地的海拔、緯度呈極顯著正相關，相關系數分別為0.867、0.686;模糊隸屬函數和聚類分析將40份割手密無性系的耐寒性分為三類，其中高耐寒類型有10份材料，中耐寒性有19份，不耐寒性11份。研究結果表明，不同采集地割手密材料之間耐寒性指標存在明顯差異;耐寒隸屬函數與海拔、緯度呈極顯著正相關，即高海拔和高緯度的割手密耐寒性強、低海拔和低緯度的割手密耐寒性弱，表明在相近海拔范圍內決定耐寒性的主要因素是緯度，在相近緯度范圍內決定耐寒性的主要因素是海拔。該結果為割手密種質資源在甘蔗耐寒育種中的進一步利用提供依據。

關鍵詞? 割手密;耐寒性;模糊隸屬函數法;海拔;緯度中圖分類號? S566.1? ? ? 文獻標識碼? A

Abstract? To screen cold tolerance of wild sugarcane germplasms， and to explore the relationship between cold tolerance with original altitude and latitude， the comprehensive evaluation of cold tolerance of clones of Saccharum spontaneum L. from different habitats were performed. After low temperature stress at seedling stage， seven physiological indexes of 40 S. spontaneum clones samples were evaluated using cluster analysis， fuzzy membership function analysis and correlation analysis. Compared with the control group， the contents of Pro， MDA， PMP and SP in the stressed clones increased， in which the content of Pro was the highest by increasing 43.81%. The contents of Chl， SOD and POD decreased， moreover the content of Chl decreased the greatest by 35.01%. The coefficients of variation of Chl， Pro and SOD increased in different degrees， and the biggest increase was found in Chl， which was 1.76 times of the control. The result of correlation analysis showed that the cold tolerance of the 40 S. spontaneum clones was significantly positively correlated with the altitude and latitude of the habitats by correlation coefficients， which was 0.867 and 0.686， respectively. All the 40 S. spontaneum clones were divided into three categories according to the cold tolerance using fuzzy membership function and cluster analysis， in which 10 clones showed high cold tolerance， 19 clones showed medium cold tolerance and 11 clones were cold sensitive. The results showed that there were significant differences in cold tolerance among S. spontaneum clones collected from different habitats， and the membership function of cold tolerance was positively correlated with altitude and latitude， namely the clones collected from high altitude and high latitude had stronger cold tolerance than that collected from low altitude and low latitude habitats. It indicated that latitude is the main factor for the cold tolerance of S. spontaneum clones collected from the same altitude， and altitude is the main factor for the cold tolerance of S. spontaneum clones collected from the same latitude. This work would provide the scientific basis for the further utilization of S. spontaneum clones in sugarcane cold tolerance breeding.

Keywords? Saccharum spontaneum L.; cold tolerance; fuzz membership function; altitude; latitude

DOI? 10.3969/j.issn.1000-2561.2019.04.003

甘蔗（Saccharum officinarum）為禾本科（Gramineae）甘蔗屬（Saccharum）植物[1]，是典型的C4作物，對自然條件有一定的要求，特別是對溫度要求比較嚴格，需要適宜的溫度才能正常的生長[2]，一般在溫度低于20 ℃時，就會對甘蔗的發(fā)育及產量造成一定的影響[3]。甘蔗在我國熱帶和亞熱帶地區(qū)具有廣泛的種植面積，種植面積最大的省份是廣西，其次是云南[4]。低溫寒害對農作物造成的危害及導致的經濟損失已引起世界廣泛關注，低溫寒害也是我國農業(yè)生產中最主要的自然災害之一[5-6]。割手密（Saccharum spontaneum L.）即甘蔗細莖野生種，又名甜根子草、小巴茅，為禾本科（Gramineae）蜀黍族 甘蔗屬（Saccharum）多年生草本植物。該種的特征是抗逆能力強、宿根性能好、生長勢旺盛、地域適應性廣，是拓寬甘蔗抗逆育種遺傳基礎的重要資源[7-8]。割手密在我國分布范圍廣，海拔在1～2700 m，遍及多個氣候區(qū)，是甘蔗屬中地理分布最廣、類型最豐富的種群[9-11]，以云南割手密群體多樣性最為豐富[12]。近年來，國內外對于割手密的抗逆性研究多側重于其抗旱性方面，對于其耐寒性研究頗少。

植物長期生長在低溫的環(huán)境中，通過形態(tài)特征、生理生化的變化，并經歷長期的自然選擇和協同進化對低溫產生了較強的適應性。在低溫脅迫下，甘蔗葉片的丙二醛（MDA）含量、脯氨酸（Pro）含量、質膜透性升高[13-15]，而葉綠素（Chl）含量、過氧化氫酶活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性、過氧化物酶（POD）活性均下降[16-19]，因此上述指標均可作為鑒定割手密耐寒能力較可靠的依據。本研究對40份不同采集地的割手密無性系通過測定低溫脅迫條件下生理生化的變化，以抗寒隸屬函數為依據，采用綜合抗寒性評價的方法進行耐寒性篩選和評價，篩選耐寒性強的種質，同時分析割手密無性系的耐寒性與原生長地緯度、海拔的關系，以期為割手密資源在甘蔗耐寒育種中的進一步利用提供科學依據。

1? 材料與方法

1.1? 材料

從云南農業(yè)大學甘蔗研究所資源圃中選取40份割手密無性系，所選材料的海拔跨度在10～2300 m，從中國云南、四川、西藏、貴州，以及尼泊爾、緬甸等地收集來，集中保育在云南農業(yè)大學甘蔗資源圃（昆明），具體信息見表1。

1.2? 方法

1.2.1? 材料種植與管理? 材料種植在云南農業(yè)大學甘蔗研究所大棚內，采用盆栽的方法，2017年5月初將40份割手密材料均勻分兜，每個無性系種植6盆，其中3盆作為處理組（低溫脅迫），另外3盆作為對照組。每盆加入同樣重量的營養(yǎng)土和水，定期田間管理。

1.2.2? 低溫脅迫? 參試材料生長至苗期，參照曹哲群等[19]的方法將處理組移至低溫光照培養(yǎng)箱內進行低溫（3 ℃）脅迫處理，設置光照時間為13 h/d，在處理3 d后對所有供試材料（對照組和處理組）同時取樣;剪取+1葉迅速帶回實驗室進行各項指標測定。

1.2.3? 生理指標測定? 對葉片進行生理生化指標測定：以電導率儀法[20]測定細胞膜透性，硫代巴比妥酸法[21]測定MDA含量，酸性茚三酮法[22]測定游離Pro含量，考馬斯亮藍G-250染色法[23]測定可溶性蛋白含量，氮藍四唑法[24]測定SOD活性，分光光度法[25]測定Chl含量，愈創(chuàng)木酚法[26]測定POD活性。

1.3? 數據分析

各參試材料的7項生理指標的測定數據整理后用SPSS 17.0軟件進行統計和聚類分析[27]。

式中A為各材料指標的隸屬函數值，Hmin為各材料指標的最小值，Hmax為各材料指標的最大值，B為材料的模糊隸屬函數均值，n為指標數，模糊隸屬函數值的區(qū)間為[0，1];若指標與耐寒性呈正相關，用公式（1）計算模糊隸屬函數值，若指標與耐寒性呈負相關，選用公式（2）計算模糊隸屬函數值，最后用公式（3）計算模糊隸屬函數均值，B值越大，表明該材料耐寒性越強。

2? 結果與分析

2.1? 低溫脅迫后割手密材料的相關生理指標測定

40份割手密無性系各自的7項生理指標的測定結果表明，在低溫脅迫下，割手密的Pro、電導率、MDA、可溶性蛋含量均值較對照均有不同程度的升高，其中Pro含量均值上升最大，較對照均值升高了43.81%，其次是MDA、電導率、可溶性蛋含量均值分別較對照升高了34.26%、33.33%、13.07%（表2）。其他指標在低溫脅迫下都有不同程度的降低，其中Chl含量均值較對照減少35.01%，下降程度最大;SOD與POD較對照分別下降16.55%、15.63%。可見，不同采集地的割手密在低溫脅迫下，對生理指標的影響存在差異，表明他們的耐寒性不同。

此外，低溫脅迫處理與對照相比，除Chl、Pro、SOD的變異系數有不同程度的增加，其他指標的變異系數有不同程度的降低，其中增長最大的是Chl，比對照增加了0.121，是對照的1.76倍;其次是Pro，比對照增加了0.039，是對照的1.16倍，表明Chl和Pro對低溫脅迫最敏感。綜上所述，不同采集地40份割手密無性系的耐寒性與多種指標有關。

2.2? 不同采集地割手密耐寒性綜合評定

2.2.1? 模糊隸屬函數? 本試驗檢測的7項指標在評價耐寒性中所起到的作用不同，利用其中任何單一指標來評價割手密耐寒性均有一定的片面性。綜合7項耐寒性生理指標，利用模糊隸屬函數法計算隸屬函數加權平均值，對不同采集地來源40份割手密的耐寒性進行綜合評價（表3），

使結果更加有說服力。結果顯示，低溫脅迫下40份不同采集地來源割手密的耐寒性由強到弱排序依次為：1982-25>1990-2>2012-28>2013-13> 1982-34>1988-283>I1991-10>2013-10>2012-51> 2012-25>82-125>2012-32>1988-277>1982-33>1988-301>2012-31>I1991-118>2012-44>1983-193>1982-132>I1991-7>1984-260>I1991-17>1984-251>2012-45>1982-112>1982-134>1984-261>1983-255>1984-249>1982-106>1988-269>I1991-65>2015-88>1982-127>2015-89>2015-4>2015-6>2015-33>2015-32。

2.2.2? 聚類分析? 對40份不同采集地割手密無性系的隸屬函數加權平均值進行排序，系統聚類分析結果表明（圖1），供試材料的耐寒性可劃分為3種類型，即高度耐寒、中度耐寒和不耐寒，82-25、1990-2、2012-28、2013-13、82-34、1988-283、I91-10、2013-10、2012-51和2012-25共10個材料聚類為高度耐寒材料，占供試材料的25%;82-125、2012-32、88-277、1982-33、1988-301、2012-31、I91-118、2012-44、83-193、82-132、I1991-7、84-260、I91-17、1984-251、2012-45、82-112、82-134、1984-261和83-255共19個材料聚類為中度耐寒材料，占供試材料的47.5%;84-249、82-106、88-269、I91-65、2015-88、82-127、2015-89、2015-4、2015-6、2015-33、2015-32共11個材料聚類為不耐寒材料，占供試材料的27.5%。

2.3? 割手密耐寒性與其采集地海拔和緯度的關系

各無性系的耐寒性與其生長地海拔的關系見圖2。表3為40份割手密無性系的耐寒性綜合評價表，結合圖2可直觀看出40份割手密無性系的耐寒性隨原生長地海拔高度的增加呈增大的趨勢，即高海拔地區(qū)生長的割手密耐寒性強、低海拔地區(qū)生長的耐寒性弱。整個曲線圖出現較大波動是因為在相近的海拔范圍內，緯度的高低成為影響割手密的耐寒性的主導因子，如在海拔1280 m的1984-261和海拔1320 m的2013-10兩個割手密材料，雖然海拔相差40 m，但是緯度相差4°13′N，表現出較大的耐寒性差異，所以出現了明顯的波動;海拔為300 m的I1991-118這份割手密無性系因來源高緯度，較相近海拔無性系表現出較好的耐寒性，曲線出現明顯的波動。表明海拔越高，則耐寒性越強;海拔相近，緯度越高，則耐寒性越強（圖2）。

各無性系的耐寒性與其生長地緯度的關系見圖3。從圖3可看出，40份割手密無性系的耐寒性隨原生長地緯度的增加沒有顯示出明顯增的加趨勢。生長在相近緯度25°01′N的1982-25和25°08′N的1984-261兩個無性系，雖然緯度很接近，但海拔相差1064 m，表現出較大的耐寒性差異，曲線出現較大的波動;生長在同一緯度25°01′N，海拔分別為2344 m（1982-25）和1700 m

（1988-283）的2個無性系，海拔相差640 m，由于類似情況較多，曲線出現明顯的波動，引起的曲線波動還可能與材料的染色體數目、耐寒性相關基因等有關。表明在相同緯度條件下，決定耐寒性強弱的是海拔，即海拔越高，耐寒性越強;海拔越低，耐寒性越弱（圖3）。

2.4? 割手密無性系的耐寒性與海拔和緯度的相關性分析

對40份割手密無性系耐寒性與其采集地海

拔和緯度的相關性進行分析，結果表明耐寒隸屬函數與海拔、緯度呈極顯著正相關，相關系數分別為0.867、0.686（表4）。即高海拔、高緯度的

0～25的標尺刻度表示類別之間的親疏距離。

材料序號與編號的對應關系見表1。

材料序號與編號的對應關系見表1。

割手密無性系耐寒性強;低海拔、低緯度的割手密無性系耐寒性弱。

3? 討論

3.1? 甘蔗及其野生資源植物的耐寒性評價指標及方法

植物在生長過程中受到環(huán)境等諸多因素的影響，其中溫度是作物生長發(fā)育過程中十分重要的生態(tài)因子，甘蔗是喜溫作物，不同甘蔗品種對低溫的抵抗能力是不同的。在自然降溫過程中，甘蔗受到低溫脅迫會發(fā)生形態(tài)及生理生化等方面的變化。Lyons和Raison在研究低溫脅迫對植物生理功能影響時發(fā)現，植物細胞膜的膜流動性與植物抗寒性密切相關，低溫脅迫后細胞膜發(fā)生相變，生物膜透性增大導致胞內離子滲漏，電導率增大[28];有研究表明葉片的相對電導率是鑒定作物抗寒性的指標之一[29]。低溫在改變葉片質膜透性的同時也導致細胞膜脂過氧化，而丙二醛是膜脂過氧化的產物之一，其含量可反映細胞膜脂過氧化程度及受低溫傷害的程度[30]。本研究通過對40份試驗材料在苗期進行低溫處理，結果表明在低溫脅迫后供試材料葉片相對電導率有不同程度的升高，細胞內膜脂過氧化加劇，MDA含量增加，可見低溫環(huán)境對甘蔗細胞膜系統穩(wěn)定性有一定程度的破環(huán)，而脯氨酸是重要的細胞滲透調節(jié)物，在低溫脅迫下可以增強細胞的持水力，維持細胞結構、細胞運輸和調節(jié)滲透壓等，使植株表現出一定的抗性，植物會大量積累脯氨酸來抵御各種環(huán)境脅迫[31]。本研究對照組中甘蔗葉片脯氨酸含量持較低水平，低溫脅迫導致脯氨酸含量有不同程度的增加，且其含量的增加數值比其他耐寒指標的增加數值都高;其均值較對照均值上升43.81%，其中82-25升高幅度最大，90-2次之，說明脯氨酸是甘蔗對寒冷適應的重要生理反應，其含量的增加有利于提高蔗株耐寒性，這與李茂枝等[13]和唐仕云等[15]的報道一致，表明蔗葉內脯氨酸含量可作為衡量甘蔗及其野生資源植物的耐寒性指標之一。

低溫環(huán)境不僅對甘蔗膜細胞系統有影響，對甘蔗葉片葉綠素含量也有一定的影響。有研究報道，葉片葉綠素的穩(wěn)定指數是鑒定甘蔗耐寒性的指標之一[19]。葉綠素含量是反映植物光合能力的一個重要指標，葉綠體是植物細胞內冷敏感性很強的一個細胞器，低溫脅迫會使得植物葉片細胞膜透性增加，并使葉綠素合成受到抑制，還會導致葉綠素的分解加快，葉綠素含量隨之降低[31]。通過對40份試驗材料在苗期進行低溫處理，甘蔗葉片葉綠素含量出現不同程度的下降，變異系數較其他耐寒指標相比葉綠素含量變異系數增長最大，增長0.121，表明葉綠素對低溫脅迫最為敏感。綜上所述甘蔗葉片相對電導率、丙二醛、脯氨酸、葉綠素含量等都可作為鑒定甘蔗耐寒性的重要指標。本研究由于供試材料是不同生境的割手密無性系，有著非常大的地域性差異，對低溫的適應能力各異。因此，在進行甘蔗資源進行抗寒性鑒定時，使用單一的生理生化指標進行評價較為片面，而應以多個耐寒指標進行綜合評價。隸屬函數法已經應用于甘蔗種質資源抗旱性評價中[27]，同時在其他作物如葡萄[32]、玉米[33]、小麥[34]、苜蓿[35]等作物的抗逆性評價也有成功的應用研究，并證明其對抗性篩選的可靠性。本研究結合前人經驗將模糊隸屬函數分析法應用于甘蔗耐寒性研究中，綜合分析其耐寒性，消除單一指標直接判斷帶來的誤差，使試驗結果更加準確、可靠。

聚類分析方法在種質資源研究中已廣泛應用，黃忠興等[12]采用聚類分析的方法將國內外割手密資源聚成三大不同類群，各類群在植株生長特性及錘度方面具有極顯著差異;周會等[36]在評價甘蔗種質資源自然條件下耐寒性研究中通過系統聚類方法將參試材料分為耐寒性強、耐寒性較強、耐寒性一般、耐寒性較差、耐寒性差等5個耐寒性表現類群。本研究利用聚類分析法將供試材料聚類為高度耐寒材料、中度耐寒材料、不耐寒材料3類，研究結果可為割手密資源在甘蔗抗寒育種中的進一步利用提供依據。

3.2? 原生地海拔和緯度與割手密耐寒性之間的關系

在自然條件下，氣溫會隨海拔、緯度的升高而降低。李紳崇等[37]的研究結果揭示由海拔和緯度引起的溫度變化是形成水稻不同的耐寒性生態(tài)類群的關鍵因素;戴獻英[38]的研究結果表明割手密的電解質滲漏率隨原生長地海拔的上升而下降、隨原生長地點緯度增高而降低，即高海拔、高緯度的材料耐寒性較強。

本研究對不同采集地來源的40份割手密無性系進行耐寒性評估，低溫脅迫下對其七項耐寒性生理指標進行測定，利用相關性分析無性系的耐寒隸屬函數均值與海拔緯度的相關關系，結果顯示耐寒隸屬函數值與海拔、緯度呈極顯著正相關，即高海拔、高緯度的割手密耐寒性強，低海拔、低緯度的割手密耐寒性弱。表明在相近海拔范圍內決定耐寒性的主要因素是緯度，在相近緯度范圍內決定耐寒性的主要因素是海拔。例如海拔為300 m的I1991-118這份割手密無性系使曲線出現較強的波動;生長在相近緯度25°01′N的1982-25和25°08?N的1984-261兩個無性系，雖然緯度很接近，但海拔相差1064 m，表現出較大的耐寒性差異，曲線出現較大的波動。因為甘蔗的耐寒性不僅與各無性系生長地的海拔、緯度有關;同時，耐寒性也是多基因控制的數量性狀，涉及的基因和代謝眾多，對甘蔗耐寒性評估產生一定的影響。

4? 結論

不同采集地40份割手密無性系的耐寒性可聚類為高抗、中抗和不抗3種類型，鑒定出10個高度耐寒材料、19個中度耐寒材料、11個不耐寒材料;對不同割手密無性系的耐寒性與其采集地海拔和緯度的相關性分析結果表明耐寒隸屬函數值與海拔、緯度呈極顯著正相關，相關系數分別為0.867、0.689;即高海拔、高緯度的割手密耐寒性強，低海拔、低緯度的割手密耐寒性弱;在相近海拔范圍內決定耐寒性的主要因素是緯度，在相近緯度范圍內決定耐寒性的主要因素是海拔。

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