陳芳芳，韓 嵐，彭代銀，汪蒙蒙，胡壽山，夏文文

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 安徽省中藥復(fù)方重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230012)

桃紅四物湯(Tao Hong Si Wu Decoction, THSWD)出自《醫(yī)宗金鑒》，近年來越來越多的研究表明THSWD對(duì)腦損傷模型具有顯著的神經(jīng)保護(hù)作用[1-3]。課題組前期研究表明，THSWD治療顯著減少了由缺糖缺氧再灌注(oxygen-glucose deprivation/recovery, OGD/R)損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。THSWD發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，其機(jī)制可能與促進(jìn)腦血管生長和抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)[4]。細(xì)胞療法具有潛在的多效性，通過不同的方式對(duì)微環(huán)境作出反應(yīng)從而發(fā)揮作用。文獻(xiàn)證明這種由氧和葡萄糖雙重耗盡導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞損傷模型可以更好地模擬臨時(shí)動(dòng)脈閉塞期間發(fā)生的損傷[5]。有研究報(bào)道腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(brain microvascular endothelial cells, BMECs)在神經(jīng)細(xì)胞損傷中起關(guān)鍵作用[6]?；赑C12細(xì)胞的神經(jīng)細(xì)胞特性，也被通常用于神經(jīng)學(xué)研究[7]。因此本研究建立了BMECs和PC12細(xì)胞共培養(yǎng)模型，進(jìn)一步研究THSWD對(duì)腦缺血再灌注損傷模型的氧化應(yīng)激保護(hù)作用，為THSWD的臨床研究提供更多理論依據(jù)和指導(dǎo)。

1 材料

1.1 細(xì)胞株 PC12細(xì)胞株和BMECs均購自于賽齊(上海)生物工程有限公司。

1.2 材料與試劑 桃仁(批號(hào) 1702181)、紅花(批號(hào) 17072135)、川芎(批號(hào) 17010335)、熟地黃(批號(hào) 1705312)、當(dāng)歸(批號(hào) 1611085)和白芍(批號(hào) 17110114)均購自安徽普仁中藥飲片有限公司，并經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源教研室鑒定；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)檢測試劑盒：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；transwell小室(孔徑：0.4 μm)：美國Corning公司；Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡試劑盒：上海BestBio貝博生物；二氫羅丹明(dihydrorhodamine，DHR)：美國Sigma公司；β-actin：北京中山金橋生物技術(shù)有限公司；蛋白標(biāo)準(zhǔn)品Marker：美國Sigma公司；小鼠單克隆抗體缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)、兔多克隆抗體Bcl-2、兔單克隆抗體Bax：美國Abcam公司；山羊抗鼠IgG二抗：武漢博士德生物工程有限公司；一抗稀釋液：江蘇碧云天生物技術(shù)研究所。

1.3 主要儀器 MCO-175型CO2培養(yǎng)箱：日本SANYO公司；Proox C21型三氣培養(yǎng)箱：美國Biospherix公司；MSS全波長酶標(biāo)儀：美國Thermo公司。

2 方法

2.1 THSWD藥液的制備 參照第7版《藥劑學(xué)》[8]中THSWD的配伍比例(桃仁、紅花、熟地黃、當(dāng)歸、白芍、川芎的質(zhì)量比為3∶2∶4∶3∶3∶2)，加入上述中藥飲片總質(zhì)量10倍的75%乙醇冷凝回流提取2 h，過濾，濾渣加入上述中藥飲片總質(zhì)量8倍的75%乙醇冷凝回流提取2 h后過濾；將兩次濾液合并，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮成1.0 g/mL的濃縮液備用。

2.2 THSWD對(duì)BMECs和PC12細(xì)胞安全濃度的篩選 取對(duì)數(shù)生長期的BMECs和PC12細(xì)胞分別用胰酶消化并計(jì)數(shù)。對(duì)于BMECs和PC12組THSWD濃度設(shè)置為0、0.02、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mg/mL。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每孔加5 mg/mL的MTT 20 μL，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育4 h，棄上清，用150 μL DMSO溶解藍(lán)紫色甲瓚，室溫避光振蕩10 min。計(jì)算細(xì)胞存活率(缺糖缺氧再灌注組OD值/空白對(duì)照組OD值×100%)。

2.3 BMECs和PC12細(xì)胞OGD/R時(shí)間篩選 取對(duì)數(shù)生長期的BMECs和PC12細(xì)胞，分別用胰酶消化并計(jì)數(shù)。對(duì)于BMECs和PC12 OGD/R組設(shè)置為缺糖缺氧0、2、4、6、8、12 h，缺糖缺氧條件為95%高純N2、5% CO2，復(fù)糖復(fù)氧24 h，MTT法檢測細(xì)胞存活率。

2.4 BMECs和PC12共培養(yǎng)模型建立 借助Transwell小室建立共培養(yǎng)體系，無菌條件下，將BMECs(1×106/mL)接種于6孔板底部，另取空白孔放上Transwell小室，將PC12(1×106/mL)接種在Transwell小室中，待兩種細(xì)胞均貼壁生長后，吸棄原培養(yǎng)基，將Transwell小室移到種有BMECs的孔中，建立起共培養(yǎng)體系。

2.5 實(shí)驗(yàn)分組和給藥 對(duì)照組：無血清高糖培養(yǎng)基在正常CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；OGD/R組：無血清無糖培養(yǎng)基在缺氧小室中先培養(yǎng)4 h，再更換為無血清高糖培養(yǎng)基在正常CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h；THSWD低、中、高劑量組：終濃度為0.2、0.4、0.8 mg/mL的THSWD無血清高糖培養(yǎng)基分別預(yù)處理BMECs 24 h，吸去培養(yǎng)液，共培養(yǎng)體系用無血清無糖培養(yǎng)基在缺氧小室中先培養(yǎng)4 h，再更換為無血清高糖培養(yǎng)基在正常CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。

2.6 指標(biāo)檢測

2.6.1 細(xì)胞活力及形態(tài)檢測 取對(duì)數(shù)生長期的BMECs和PC12細(xì)胞。另取空白孔放上Transwell小室，將PC12(1×106/mL)接種在Transwell小室中，待細(xì)胞貼壁生長至80%左右，吸棄原培養(yǎng)基，將Transwell小室移至種有BMECs的孔中，建立起共培養(yǎng)體系，進(jìn)行分組干預(yù)。細(xì)胞處理完成后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，并拍照。然后每孔加入5 mg/mL MTT 280 μL，反應(yīng)4 h后，吸去上清，再加DMSO溶解甲瓚結(jié)晶，在490 nm波長下檢測，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

2.6.2 Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染法測定OGD/R誘導(dǎo)的共培養(yǎng)體系中PC12細(xì)胞凋亡率 細(xì)胞處理完成后，用不含EDTA的胰酶消化Transwell小室內(nèi)PC12細(xì)胞，離心，取上清。加入400 μL 1×Annexin Ⅴ結(jié)合液懸浮細(xì)胞，5 μL Annexin-FITC染色液，輕輕混勻后避光保存15 min，溫度為2～8 ℃。然后加入10 μL PI染色液避光孵育5 min，溫度為2～8 ℃，流式細(xì)胞儀檢測，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

2.6.3 DHR檢測OGD/R誘導(dǎo)的共培養(yǎng)體系中PC12細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平 細(xì)胞處理完成后，吸去Transwell內(nèi)原培養(yǎng)基，用不含血清的培養(yǎng)基清洗2次，加入5 μmol/L的DHR溶液1 mL，避光孵育1 h，然后用胰酶消化細(xì)胞并離心收集，1 000 r/min離心5 min，離心后PBS吹打，用PBS重懸制成細(xì)胞懸液。處理完后用流式細(xì)胞儀檢測，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。結(jié)果用平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescent intensity ，MFI)值表示。

在使用時(shí)，通過設(shè)置橫桿2，當(dāng)需要清理白板1的版面時(shí)，通過移動(dòng)橫桿2到適當(dāng)?shù)奈恢?，下壓把?6，帶動(dòng)橫桿2向下運(yùn)動(dòng)，可使圓筒擦8和方擦15與白板1接觸，通過設(shè)置圓筒擦8兩側(cè)的方擦15，可三重清理白板1的表面，從而達(dá)到清理白板1表面更加干凈的目的，通過設(shè)置固定塊3和滑塊4，使橫桿2的移動(dòng)更加穩(wěn)定、快速和方便，通過設(shè)置固定桿9底部的滾輪11與滾槽10，不僅可支撐橫桿2，且使橫桿2的移動(dòng)更加穩(wěn)定，且通過設(shè)置限位彈簧7，在不需要清理時(shí)，圓筒擦8與白板1不接觸。

2.6.4 OGD/R誘導(dǎo)的共培養(yǎng)體系中PC12細(xì)胞內(nèi)MDA含量及SOD、GSH-Px活性檢測 細(xì)胞處理完成后，按照試劑盒說明書測定其中MDA含量、SOD及GSH-Px活力。

2.6.5 Western blot法檢測OGD/R誘導(dǎo)的共培養(yǎng)體系中PC12細(xì)胞內(nèi)Bax、Bcl-2及HIF-1α蛋白表達(dá)水平 細(xì)胞處理完成后，棄去培養(yǎng)液，用細(xì)胞刮輕輕刮下Transwell內(nèi)細(xì)胞并收集。1 500 r/min離心5 min，去上清，加入含PMSF的蛋白裂解液150 μL，在冰上裂解30 min后，4 ℃、15 000 r/min離心15 min。取10 μL作蛋白定量，其余蛋白溶液加入上樣緩沖液，沸水煮5 min，-20 ℃冰箱保存。之后電泳，轉(zhuǎn)膜，室溫下封閉，4 ℃孵育過夜，加二抗孵育，搖床振搖洗膜4次。

3 結(jié)果

3.1 THSWD安全濃度及缺糖缺氧再灌注時(shí)間的篩選

3.1.1 THSWD對(duì)BMECs和PC12細(xì)胞安全濃度的篩選 采用MTT法檢測THSWD對(duì)正常培養(yǎng)的BMECs細(xì)胞的作用。結(jié)果表明，在一定濃度范圍內(nèi)THSWD可以促進(jìn)BMECs的增殖，其中0.2、0.4 mg/mL THSWD對(duì)BMECs細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用最明顯，而0.2、0.4、0.8 mg/mL THSWD對(duì)PC12細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用最為明顯。見表1。

3.1.2 BMECs和PC12細(xì)胞OGD/R時(shí)間篩選 結(jié)果表明，OGD/R時(shí)間對(duì)BMECs增殖的抑制作用在缺糖缺氧4、6、8 h時(shí)明顯，復(fù)糖復(fù)氧24 h后，OD值分別為(0.308±0.037)、(0.200±0.020)和(0.158±0.065)。而對(duì)PC12細(xì)胞增殖的抑制作用最大，在缺糖缺氧4、6、8 h和復(fù)糖復(fù)氧24 h的OD值依次是(0.168±0.037)、(0.120±0.019)、(0.110±0.046)。因此，OGD/R誘導(dǎo)的BMECs和PC12共培養(yǎng)體系損傷的最佳時(shí)間為缺糖缺氧4 h，復(fù)糖復(fù)氧24 h。

表1 MTT法檢測THSWD對(duì)BMECs和PC12細(xì)胞存活率的影響

3.2 THSWD對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的共培養(yǎng)體系中PC12細(xì)胞活力的影響 與對(duì)照組比較，OGD/R組OD值顯著降低(P<0.05)。與OGD/R組比較，0.2、0.4、0.8 mg/mL THSWD組OD值均顯著增高(P<0.05)。見圖1。

注：A.對(duì)照組；B. OGD/R組；C. 0.2 g/mL THSWD組；D. 0.4 g/mL THSWD組；E. 0.8 g/mL THSWD組；與對(duì)照組比較，*P<0.05；與OGD/R組比較，#P<0.05

3.4 THSWD對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的共培養(yǎng)體系中PC12細(xì)胞凋亡率的影響 與對(duì)照組比較，OGD/R組PC12細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.05)；與OGD/R組比較，0.2、0.4、0.8 mg/mL THSWD組PC12細(xì)胞凋亡率均顯著下降(P<0.05)。見圖3、圖4。

3.5 THSWD對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的共培養(yǎng)體系中PC12細(xì)胞ROS的影響 與對(duì)照組比較，OGD/R組PC12細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高(P<0.05)；與OGD/R組比較，0.2、0.4、0.8 mg/mL THSWD組共培養(yǎng)體系中PC12細(xì)胞ROS水平均顯著降低(P<0.05)。見圖5。

注:A.對(duì)照組;B. OGD/R組;C. 0.2 g/mL THSWD組;D. 0.4 g/mL THSWD組;E. 0.8 g/mL THSWD組

圖2倒置顯微鏡下觀察THSWD對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的

共培養(yǎng)體系中PC12細(xì)胞形態(tài)的影響(10×10倍)

注:A.對(duì)照組;B. OGD/R組;C. 0.2 g/mL THSWD組;D. 0.4 g/mL THSWD組;E. 0.8 g/mL THSWD組

圖3流式細(xì)胞儀檢測各組共培養(yǎng)體系中PC12細(xì)胞凋亡率

3.6 THSWD對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的共培養(yǎng)體系中PC12中MDA含量及SOD、GSH-Px活性的影響 與對(duì)照組比較，OGD/R組PC12細(xì)胞中MDA含量顯著升高(P<0.05)，SOD和GSH-Px活性顯著降低(P<0.05)；與OGD/R組比較，0.2、0.4 mg/mL THSWD組MDA含量顯著降低(P<0.05)，SOD和GSH-Px活性顯著升高(P<0.05)。0.8 mg/mL THSWD組GSH-Px活性也顯著升高(P<0.05)。見圖6。

注：A.對(duì)照組；B.OGD/R組；C. 0.2 g/mL THSWD組；D. 0.4 g/mL THSWD組；E. 0.8 g/mL THSWD組；與對(duì)照組比較，*P<0.05；與OGD/R組比較，#P<0.05

注：A.對(duì)照組；B.OGD/R組；C. 0.2 g/mL THSWD組；D. 0.4 g/mL THSWD組；E. 0.8 g/mL THSWD組；與對(duì)照組比較，*P<0.05；與OGD/R組比較，#P<0.05

3.7 THSWD對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的共培養(yǎng)體系PC12細(xì)胞中Bcl-2、Bax和HIF-1α蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，OGD/R組HIF-1α蛋白表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)；與OGD/R組比較，0.2、0.4 mg/mL THSWD組HIF-1α蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)；與對(duì)照組比較，OGD/R組Bax蛋白表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著減少(P<0.05)，Bcl-2/Bax比值顯著下調(diào)(P<0.05)；與模型組比較，0.2、0.4 mg/mL THSWD組Bax蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)，Bcl-2/Bax比值顯著上調(diào)(P<0.05)，0.8 mg/mL THSWD組Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見圖7、圖8。

注：A.對(duì)照組；B.OGD/R組；C. 0.2 g/mL THSWD組；D. 0.4 g/mL THSWD組；E. 0.8 g/mL THSWD組；與對(duì)照組比較，*P<0.05；與OGD/R組比較，#P<0.05

注：A.對(duì)照組；B. OGD/R組；C. 0.2 g/mL THSWD組；D. 0.4 g/mL THSWD組；E. 0.8 g/mL THSWD組

圖7Westernblot法檢測各組共培養(yǎng)體系PC12細(xì)胞中Bcl-2、Bax和HIF-1α蛋白表達(dá)水平

4 討論

缺血/再灌注損傷具有高病死率和高致殘率。由于氧氣的高消耗，氧化還原穩(wěn)態(tài)在大腦中起重要作用[9]。許多臨床和實(shí)驗(yàn)研究觀察表明氧化應(yīng)激在發(fā)病機(jī)制和發(fā)展中的作用。研究發(fā)現(xiàn)，ROS和MDA的含量以及SOD和GSH-Px的活性在缺血再灌注損傷中起著非常重要的作用。過量的細(xì)胞內(nèi)ROS可能會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡[10]，ROS導(dǎo)致分子受損，這有助于直接與DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)發(fā)生反應(yīng)。MDA水平升高也與自由基損傷有關(guān)。SOD和GSH-Px是抗氧化應(yīng)激生理防御的一部分[11]。

注：A.對(duì)照組；B.OGD/R組；C. 0.2 g/mL THSWD組；D. 0.4 g/mL THSWD組；E. 0.8 g/mL THSWD組；與對(duì)照組比較，*P<0.05；與OGD/R組比較，#P<0.05

在課題組前期研究中，已經(jīng)證明THSWD治療可顯著改善OGD/R損傷，降低MDA和ROS水平，并促進(jìn)SOD和GSH-Px的活性。

在缺血性腦卒中的生物學(xué)過程中，HIF-1α在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著重要的作用，與Bax蛋白的表達(dá)之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，而與Bcl-2蛋白的表達(dá)之間存在正相關(guān)關(guān)系，從而可以起到抑制細(xì)胞凋亡的作用[12]。Bax/Bcl-2比值代表了細(xì)胞凋亡和增殖之間的平衡[13]。本研究表明，THSWD通過上調(diào)HIF-1α和Bcl-2表達(dá)水平和下調(diào)Bax表達(dá)水平保護(hù)PC12細(xì)胞免受OGD/R誘導(dǎo)的損傷。

神經(jīng)血管單元構(gòu)成復(fù)雜的通訊網(wǎng)絡(luò)[14]。據(jù)報(bào)道，BMECs分泌許多與OGD/R相關(guān)的細(xì)胞因子。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)證實(shí)BMECs對(duì)神經(jīng)細(xì)胞損傷和神經(jīng)退行性疾病的保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)與間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)共培養(yǎng)時(shí)，內(nèi)源性IL-6可減少細(xì)胞凋亡并保護(hù)OGD損傷的PC12細(xì)胞[15]。與MSC共培養(yǎng)可以保護(hù)PC12免受缺氧誘導(dǎo)的損傷，這可能與MSC中促紅細(xì)胞生成素基因表達(dá)增加有關(guān)[16]。研究表明，THSWD中羥基紅花黃色素A和阿魏酸對(duì)OGD/R模型中BMECs具有保護(hù)作用[17-18]。

氧化應(yīng)激在腦缺血/再灌注損傷發(fā)病機(jī)制中的作用日益受到重視。THSWD作為活血化瘀的經(jīng)典方，具有保護(hù)內(nèi)皮損傷、抗氧化、抗血小板活化等作用[19-21]。課題組前期相關(guān)研究已經(jīng)表明，THSWD對(duì)擬缺血損傷人BMECs具有保護(hù)作用，其機(jī)制與增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力有關(guān)[22]。總之，本研究結(jié)果表明，THSWD在BMECs-PC12共培養(yǎng)體系中被證實(shí)具有抗氧化作用。THSWD可顯著增強(qiáng)共培養(yǎng)體系中PC12細(xì)胞的活性，增強(qiáng)PC12細(xì)胞抗氧化和清除氧自由基的能力，改善細(xì)胞損傷，抑制細(xì)胞凋亡。