周亞琴，李夢(mèng)云，夏效東*

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

阪崎克羅諾腸桿菌（Cronobacter sakazakii）周身鞭毛，為革蘭氏陰性菌，其無(wú)芽孢，多寄生于腸道內(nèi)[1]。作為食源性條件致病菌，阪崎克羅諾腸桿菌可致使嬰幼兒以及免疫力低下者感染腦膜炎、小腸結(jié)腸炎等疾病，致死率極高，達(dá)50%～80%[2-4]。盡管臨床上已用一些抗生素治療這些疾病，但部分康復(fù)的患者仍舊會(huì)伴有嚴(yán)重的后遺癥例如發(fā)育障礙等[5]。該菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求量不大，對(duì)環(huán)境的耐受能力卻極強(qiáng)，眾多研究結(jié)果表明，致病菌能否感染宿主取決于其對(duì)外界環(huán)境的感知和應(yīng)對(duì)能力。2000—2016年期間，阪崎克羅諾腸桿菌對(duì)于我國(guó)嬰幼兒食品的污染現(xiàn)象并不罕見(jiàn)，檢出率高達(dá)21.62%，可見(jiàn)對(duì)于克羅諾腸桿菌的控制遠(yuǎn)不能達(dá)到實(shí)際生產(chǎn)要求[6]。

阪崎克羅諾腸桿菌存在于自然界各處[7-8]，已有研究表明，能夠從糞便、谷作物、食材、水、泥土等處分離出阪崎克羅諾腸桿菌。雖然迄今為止，對(duì)于阪崎克羅諾腸桿菌的傳播方式以及宿主仍舊不明，但是由其引發(fā)的疾病已證實(shí)只與嬰幼兒配方奶粉有關(guān)，所以嬰幼兒配方奶粉被認(rèn)定為是阪崎克羅諾腸桿菌感染嬰幼兒人群的主要傳播媒介[5,9]。從最初污染嬰幼兒奶粉一直到進(jìn)入嬰幼兒體內(nèi)引發(fā)疾病，阪崎克羅諾腸桿菌需要克服多種環(huán)境壓力才能夠存活以引發(fā)人體疾病，例如溫度、酸度、滲透壓等，已有研究表明阪崎克羅諾腸桿菌能夠存活于多種極端環(huán)境，對(duì)滲透壓和溫度具有強(qiáng)耐受力[10]。

PhoP是一種胞內(nèi)效應(yīng)蛋白，與胞外感應(yīng)蛋白PhoQ組成PhoP/PhoQ二元調(diào)控系統(tǒng)，該調(diào)控系統(tǒng)普遍存在于腸道桿菌之中，在腸道桿菌應(yīng)對(duì)宿主環(huán)境的過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，能夠調(diào)節(jié)毒力，調(diào)節(jié)多種革蘭氏陰性菌的活性。位于細(xì)菌外膜上的PhoQ蛋白感應(yīng)外界環(huán)境后，將磷酸基團(tuán)傳至PhoP蛋白從而將其激活，被激活的PhoP蛋白作為調(diào)節(jié)子直接或間接調(diào)控一系列靶基因。phoP基因的缺失會(huì)導(dǎo)致PhoP/PhoQ二元調(diào)控系統(tǒng)的轉(zhuǎn)磷酸化過(guò)程的失衡，使得致病菌的毒力降低。PhoP蛋白最早發(fā)現(xiàn)于鼠傷寒沙門氏菌中，具有調(diào)控非特異性酸性磷酸酶表達(dá)的功能，其中包含的字母pho有表示參與磷酸的代謝調(diào)節(jié)的含義[11]。Perez等[12]通過(guò)破壞結(jié)核分歧桿菌中的phoP基因進(jìn)行研究，結(jié)果表明，phoP基因是結(jié)核分歧桿菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活生長(zhǎng)的必要條件。

傳統(tǒng)的基因敲除方法是借助RecA重組系統(tǒng)，通過(guò)分子質(zhì)量大的復(fù)合體RecBCD使得DNA鏈解開(kāi)，再通過(guò)RecA單鏈結(jié)合蛋白促進(jìn)各DNA片段進(jìn)行配對(duì)連接。然而，該方法有許多的不足之處。首先，該方法需要的靶基因同源臂較長(zhǎng)，其次復(fù)合體RecBCD能夠降解線性DNA故而需要構(gòu)建具有特定靶位點(diǎn)的靶質(zhì)粒，最后，依照該傳統(tǒng)方法制備基因缺失菌株的成功率低，耗時(shí)費(fèi)力[13-14]。Red同源重組技術(shù)不同于RecA重組系統(tǒng)，不需要酶切等操作步驟，其原理是將攜有與靶基因兩端（50 bp左右）序列同源的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）產(chǎn)物或人工合成的寡核苷酸片段，經(jīng)由電轉(zhuǎn)化的方式導(dǎo)入宿主體內(nèi)，在重組酶的作用下，與基因組的特定靶序列進(jìn)行高效重組替換，從而使得目的基因被敲除[15]。Red同源重組技術(shù)已成功運(yùn)用于多種細(xì)菌基因缺失菌株的構(gòu)建。

越來(lái)越多的研究表明，致病菌對(duì)外界環(huán)境的感知和應(yīng)對(duì)能力是決定其能否感染宿主的關(guān)鍵，在感染宿主時(shí)致病菌會(huì)遇到許多不同的環(huán)境壓力，而這些壓力對(duì)于細(xì)菌而言具有潛在的致命性。阪崎克羅諾腸桿菌污染嬰幼兒配方奶粉被制作以及被攝入體內(nèi)后，必須具有抵抗各種環(huán)境壓力的能力，才能最終存活以引發(fā)人體疾病。酸堿、溫度、膽鹽、滲透壓等是其必須克服的外界環(huán)境壓力。目前，關(guān)于阪崎克羅諾腸桿菌的研究大多集中于對(duì)其外膜蛋白的研究以及藥物對(duì)其抑制及生物膜的清除等情況，對(duì)其致病機(jī)制以及潛在毒力因子的研究還都處于初級(jí)階段，這就意味著在該領(lǐng)域仍舊存在著太多的未知。本實(shí)驗(yàn)旨在研究phoP基因?qū)嫫榭肆_諾腸桿菌環(huán)境耐受的影響，通過(guò)Red同源重組法構(gòu)建基因缺失菌株，從生長(zhǎng)曲線、酸堿、溫度、膽鹽、滲透壓方面測(cè)定了阪崎克羅諾腸桿菌phoP基因缺失前后對(duì)于環(huán)境的耐受能力的變化，分析phoP基因在阪崎克羅諾腸桿菌應(yīng)對(duì)外界環(huán)境壓力時(shí)所起的調(diào)節(jié)作用，對(duì)阪崎克洛諾腸桿菌的防控具有一定的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

阪崎克羅諾腸桿菌BAA894-NA由本實(shí)驗(yàn)室保存；質(zhì)粒PKD46、PKD3和PCP20 捷晶生物有限公司。

胰蛋白胨大豆瓊脂及肉湯培養(yǎng)基、LB瓊脂、LB肉湯北京路橋技術(shù)有限公司；L-阿拉伯糖、氯霉素（Cm）、羧芐青霉素（Carb）等抗生素 美國(guó)MP生化公司；EcoRI內(nèi)切酶及Buffer 美國(guó)Thermo公司；高保真酶及PCR體系 北京全式金生物科技有限公司；PCR引物江蘇奧科生物科技公司；膽鹽 美國(guó)Sigma公司；電擊杯（2 mm） 美國(guó)BTX公司。

1.2 儀器與設(shè)備

2216MK低溫高速離心機(jī) 德國(guó)Hermle公司；9600基因擴(kuò)增儀 珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司；iQ5實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、Smart SpecTMplus分光光度計(jì) 美國(guó)Bio-Rad公司；InfinitcTMM200PRO多功能酶標(biāo)儀 瑞士帝肯集團(tuán)公司；JS680B凝膠成像儀 上海培清科技有限公司；LMQ.C立式滅菌器 山東新華醫(yī)療機(jī)械股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 phoP基因缺失菌株的構(gòu)建

1.3.1.1 引物設(shè)計(jì)

通過(guò)Primer Premier 5.0進(jìn)行同源重組的引物（phoP-F、phoP-R）的設(shè)計(jì)，5’端為實(shí)驗(yàn)菌株阪崎克羅諾腸桿菌的目的基因phoP兩端的同源臂（小寫表示），3’端為用以擴(kuò)增氯霉素抗性基因（其兩側(cè)各攜有1個(gè)FRT位點(diǎn)）的引物（大寫表示），通過(guò)該引物擴(kuò)增模板PKD3上的氯霉素抗性片段，最后通過(guò)DNA純化試劑盒獲得能夠與目的基因phoP發(fā)生同源重組的氯霉素抗性片段。鑒定引物（JD-F、JD-R）則設(shè)計(jì)在目的基因的上下游。引物見(jiàn)表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

1.3.1.2 電轉(zhuǎn)感受態(tài)的制備

將細(xì)菌劃線活化，挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基中（25 mL），置于37 ℃、180 r/min搖床中培養(yǎng)至OD600nm值為0.6，然后置于低溫高速離心機(jī)中5 000 r/min、4 ℃離心10 min，倒掉上清液后用事先預(yù)冷的無(wú)菌水洗滌一次，預(yù)冷的10%甘油洗滌2 次，最后濃縮250 倍為100 μL的感受態(tài)細(xì)胞，以每管50 μL的量分裝，置于－80 ℃冰箱備用[16]。

1.3.1.3 氯霉素抗性片段的制備

以PKD3為模板，phoP-F、phoP-R為引物，擴(kuò)增兩側(cè)攜有FRT位點(diǎn)的氯霉素抗性片段。擴(kuò)增反應(yīng)程序設(shè)計(jì)如下：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性20 s；60 ℃退火20 s；72 ℃延伸30 s；35個(gè)循環(huán)后，72 ℃延伸10 min。以JD-F、JD-R為引物進(jìn)行產(chǎn)物鑒定。

1.3.1.4 Red同源重組系統(tǒng)的構(gòu)建

將阪崎克羅諾腸桿菌BAA894-NA制備為感受態(tài)（1.3.1.2節(jié)方法制備），取PKD46質(zhì)粒約150 ng電轉(zhuǎn)入50 μL感受態(tài)。電轉(zhuǎn)化條件參數(shù)：電壓2.5 kV，頻率25 μF，電阻200 Ω，時(shí)間4～5 ms。電擊完成后加入1 mL SOB（super optimal broth）液體培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移至無(wú)菌試管中，于180 r/min、30 ℃條件下振蕩培養(yǎng)2 h后，涂布于Carb平板（50 μg/mL）上，30 ℃條件下培養(yǎng)過(guò)夜。挑選Carb平板上的陽(yáng)性重組子接種于25 mL含Carb（50 μg/mL）的SOB培養(yǎng)基中，加入2.5 mLL-阿拉伯糖（1 mol/L）溶液進(jìn)行誘導(dǎo)后，制備成感受態(tài)（按1.3.1.2節(jié)方法制備）。

1.3.1.5 目的基因替換

取氯霉素抗性基因片段約250 ng電轉(zhuǎn)入同源重組系統(tǒng)構(gòu)建成功的感受態(tài)中（電轉(zhuǎn)化條件參數(shù)同1.3.1.4節(jié)所述），電擊完成后加入1 mL SOB液體培養(yǎng)基，于30 ℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)2 h，涂布于Cm平板（20 μg/mL），42 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。用無(wú)菌牙簽挑取Cm平板上長(zhǎng)出的單菌落，分別點(diǎn)樣于Cm平板、Carb平板和LB平板上，42 ℃培養(yǎng)。挑取能夠在LB平板及Cm平板上生長(zhǎng)但在Carb平板上不能生長(zhǎng)的單菌落，以JD-F、JD-R為引物進(jìn)行產(chǎn)物鑒定。

1.3.1.6 耐藥基因的消除

挑選驗(yàn)證正確的氯霉素抗性重組子制備成感受態(tài)（按1.3.1.2節(jié)方法制備），電轉(zhuǎn)入PCP20質(zhì)粒（電轉(zhuǎn)化條件參數(shù)同1.3.1.4節(jié)所述），涂布于氨芐和Cm雙抗性平板，于30 ℃條件下培養(yǎng)，挑選出陽(yáng)性重組子轉(zhuǎn)至LB培養(yǎng)液中，42 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。熱誘導(dǎo)使FLP重組酶得以表達(dá)，從而刪除氯霉素片段以及一個(gè)FRT位點(diǎn)。取適量菌液涂布于LB平板，用無(wú)菌牙簽挑取平板上長(zhǎng)出的單菌落分別點(diǎn)樣于Cm平板、Carb平板和LB平板，最終所得無(wú)耐藥性菌株即為phoP基因缺失菌株。以JD-F、JD-R為引物進(jìn)行產(chǎn)物鑒定，并送樣測(cè)序。

1.3.2 菌種活化

取出保藏的實(shí)驗(yàn)菌株，在LB平板上劃線培養(yǎng)后，挑取單菌落于胰蛋白胨大豆肉湯液體培養(yǎng)基（tryptic soy broth，TSB）中進(jìn)行二次活化，培養(yǎng)18 h致使細(xì)菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期，將活化所得的菌懸液用新鮮的TSB培養(yǎng)液清洗一次（4 ℃，8 000×g，5 min）后，再添加新鮮的TSB培養(yǎng)液，調(diào)整其OD600nm值為0.5（此時(shí)菌液濃度約為108CFU/mL）[17]。

1.3.3 生長(zhǎng)曲線測(cè)定

將野生型菌株以及基因缺失菌株按1.3.2節(jié)方法制備成菌懸液后，稀釋100 倍備用。取出96 微孔板，每孔加入250 μL稀釋的菌液，每個(gè)菌株做6 個(gè)復(fù)孔，以無(wú)菌新鮮的TSB培養(yǎng)液為陰性對(duì)照，于37 ℃培養(yǎng)，每隔1 h測(cè)定一次培養(yǎng)液的OD600nm值。繪制菌株的生長(zhǎng)曲線圖。

1.3.4 對(duì)酸堿耐受的測(cè)定

將野生型菌株以及基因缺失菌株按1.3.2節(jié)方法制備成菌懸液后，取出96 微孔板，每孔按1∶1加入菌液和pH 4的新鮮培養(yǎng)基250 μL（125 μL的菌液和125 μL pH 4的新鮮培養(yǎng)基混合），每個(gè)菌株做6 個(gè)復(fù)孔，以相對(duì)應(yīng)的無(wú)菌新鮮TSB培養(yǎng)液為陰性對(duì)照，以測(cè)定菌對(duì)酸的耐受性；同樣的，每孔按1∶1加入菌液和pH 12的新鮮培養(yǎng)基250 μL（125 μL的菌液和125 μL pH 12的新鮮培養(yǎng)基混合），每個(gè)菌株做6 個(gè)復(fù)孔，以相對(duì)應(yīng)的無(wú)菌新鮮TSB培養(yǎng)液為陰性對(duì)照，以測(cè)定菌的堿耐受性。放置于37 ℃條件下培養(yǎng)，每隔1 h測(cè)定一次培養(yǎng)液的OD600nm值。繪制菌株的生長(zhǎng)曲線圖。

1.3.5 對(duì)溫度耐受的測(cè)定

將野生型菌株以及基因缺失菌株按1.3.2節(jié)方法制備成菌懸液后，分別以1%的菌濃度接種至新鮮培養(yǎng)液中分別置于55、65 ℃條件下培養(yǎng)，于1、2、5、8、10、20、30 min時(shí)，對(duì)菌液進(jìn)行10 倍稀釋從而形成不同梯度菌液，將菌液進(jìn)行涂布、點(diǎn)板，于37 ℃條件下過(guò)夜，計(jì)數(shù)測(cè)定活菌數(shù)。

1.3.6 對(duì)膽鹽耐受的測(cè)定

將野生型菌株以及基因缺失菌株按1.3.2節(jié)方法制備成菌懸液后，分別以1%的菌濃度接種至含不同膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)（4%、8%、12%）的培養(yǎng)液中，置于37 ℃條件下培養(yǎng)。分別在2 h時(shí)取樣進(jìn)行10 倍稀釋，進(jìn)行涂布、點(diǎn)板，于37 ℃條件下過(guò)夜，計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率。

1.3.7 對(duì)滲透壓耐受的測(cè)定

將野生型菌株以及基因缺失菌株按1.3.2節(jié)方法制備成菌懸液后，分別以1%的菌濃度接種至NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)不同（1.5%、3%、6%）的培養(yǎng)液（模擬不同滲透壓環(huán)境）中，放置于37 ℃條件下培養(yǎng)。分別在2、4 h取樣進(jìn)行10 倍稀釋，進(jìn)行涂布、點(diǎn)板，于37 ℃條件下過(guò)夜，計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率。

1.3.8 存活率的計(jì)算

式中：N0為t時(shí)刻純培養(yǎng)液中活菌數(shù)；Nt為t時(shí)刻不同條件溶液中活菌數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SPSS軟件22.0版本進(jìn)行分析，采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)法進(jìn)行分析。P＜0.05，差異顯著；P＜0.01，差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 phoP基因缺失菌株的構(gòu)建

圖1 PCR鑒定重組子Fig. 1 PCR amplification of positive clones

通過(guò)Red同源重組方法成功構(gòu)建阪崎克羅諾腸桿菌phoP基因缺失菌株，通過(guò)引物JD-F、JD-R進(jìn)行產(chǎn)物驗(yàn)證。理論上，野生型菌株C. sakazakii BAA894-NA的PCR產(chǎn)物大小為872 bp，目的基因被成功替換的菌株P(guān)CR產(chǎn)物大小為1 378 bp，而最終的基因缺失菌株的PCR產(chǎn)物大小為448 bp。如圖1所示，顯然，phoP基因缺失菌株的條帶接近500 bp，符合預(yù)期。送樣測(cè)序的結(jié)果如下：CGCTTATGCCTTTAGTATAATTGGCGTTAAACTATTTA TATATTTGATGGATAAGGGGACCCCGGATGCGCGTG CTGGTCGTCGAGGATAACGCCTTACTGCGGCATCAC CTGAAAGTGCAGCTCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC GAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTC GGAATAGGAACTAAGGAGGATATTCATATGGACCAT GGCTAATTCCCATGTCAGCCGTTAAGTGTTCCTGTG TCACTGCTGGCGAGGCGATCACGACAGTGCGCGGC CAGGGTTACCGGTTCGATCTGCGCTAAATGAAAAA AAACGTCCTGCGCCACTTTCTCCCGCTCTCGCTGCG GGTGCGCTTTTTACTCGCGACCGCGGCGGTGGTGCT GGTGCTCTCGCTCGCCTACGAGGGGG（下劃線部分為同源臂，框住部分為殘留的一個(gè)FRT位點(diǎn)，可見(jiàn)phoP基因被成功敲除）。

2.2 phoP基因?qū)嫫榭肆_諾腸桿菌生長(zhǎng)曲線的影響

圖2 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定Fig. 2 Growth curves

借助酶標(biāo)儀每隔1 h測(cè)定一次阪崎克羅諾腸桿菌BAA894-NA以及phoP基因缺失菌株培養(yǎng)液的OD600nm值評(píng)估菌的生長(zhǎng)，如圖2所示，phoP基因的缺失明顯延緩了阪崎克羅諾腸桿菌的生長(zhǎng)速率，在指數(shù)期的尤其是第3、4小時(shí)，phoP基因缺失菌株培養(yǎng)液的OD600nm值僅為野生型菌株OD600nm值的41.79%、45.77%。

2.3 phoP基因?qū)嫫榭肆_諾腸桿菌酸堿耐受的影響

測(cè)定阪崎克羅諾腸桿菌野生型菌株以及phoP基因缺失菌株對(duì)酸（pH 4）、堿（pH 12）的耐受，如圖3所示，比較阪崎克羅諾腸桿菌在應(yīng)對(duì)酸、堿外界刺激培養(yǎng)相同時(shí)間時(shí)的OD600nm值可以發(fā)現(xiàn)，堿性情況下阪崎克羅諾腸桿菌達(dá)到平緩期的OD600nm值明顯低于在酸性條件下的OD600nm值，由此推測(cè)阪崎克羅諾腸桿菌耐酸不耐堿。無(wú)論是在酸性或是堿性環(huán)境中，phoP基因缺失菌株在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)的生長(zhǎng)情況均劣于野生型菌株，可見(jiàn)phoP基因在阪崎克羅諾腸桿菌應(yīng)對(duì)外界酸堿刺激變化的過(guò)程中，確實(shí)起到了作用。

圖3 3 phoPphoP基因?qū)嫫榭肆_諾腸桿菌耐酸（a）及a耐堿（b）能力的影響Fig. 3 Effect of phoP on acid (a) and alkaline (b) tolerance of C. sakazakii

2.4 phoP基因?qū)嫫榭肆_諾腸桿菌溫度耐受的影響

圖 4 pphhooPP基因?qū)嫫榭肆_諾腸桿菌耐受溫度55 ℃（a）和65 ℃（b）的影響Fig. 4 Effect of phoP on temperature tolerance of C. sakazakii at 55 ℃ (a) and 65 ℃ (b)

阪崎克羅諾腸桿菌對(duì)溫度（55、65 ℃）的耐受結(jié)果如圖4 所示，55 ℃條件下，30 min時(shí)phoP基因缺失菌株已完全被殺滅，低于檢測(cè)線，而野生型菌株在30 min時(shí)仍然有存活；65 ℃條件下，phoP基因缺失菌株完全滅活只需5 min，而野生型菌株在該溫度下經(jīng)過(guò)8 min時(shí)才失去活性。

2.5 phoP基因?qū)嫫榭肆_諾腸桿菌膽鹽耐受的影響

圖5 5 phoPphoP基因?qū)嫫榭肆_諾腸桿菌耐膽鹽能力的影響Fig. 5 Effect of phoP on bile salt tolerance of C. sakazakii

如圖5所示，phoP基因的缺失減弱了阪崎克羅諾腸桿菌對(duì)于膽鹽的耐受力。隨著膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，阪崎克羅諾腸桿菌的存活率呈現(xiàn)出遞減趨勢(shì)，并且phoP基因缺失菌株在不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)膽鹽溶液中的生長(zhǎng)狀況均劣于野生型菌株。培養(yǎng)2 h時(shí)，在含4%的膽鹽溶液中培養(yǎng)后，阪崎克羅諾腸桿菌的phoP基因缺失菌株的存活率比野生型菌株的顯著降低了19.93%（P＜0.05），在含8%、12%膽鹽溶液中培養(yǎng)后的阪崎克羅諾腸桿菌，phoP基因缺失菌株的存活率與野生型菌株相比極顯著降低了40.73%和45.84%（P＜0.01）。

2.6 phoP基因?qū)嫫榭肆_諾腸桿菌滲透壓耐受的影響

圖6 6 phoPphoP基因?qū)嫫榭肆_諾腸桿菌滲透壓耐受力的影響Fig. 6 Effect of phoP on osmotic pressure tolerance of C. sakazakii

利用不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)NaCl溶液模擬不同滲透壓環(huán)境，如圖6所示，phoP基因缺失后，阪崎克羅諾腸桿菌對(duì)于滲透壓的耐受力降低，基因缺失菌株與野生型菌株相比均顯著降低（P＜0.05）。且隨著滲透壓環(huán)境壓力的增大，阪崎克羅諾腸桿菌的活性呈遞減趨勢(shì)。

3 討 論

Red同源重組技術(shù)不需要酶切連接等復(fù)雜過(guò)程，已經(jīng)被應(yīng)用于大腸桿菌、克羅諾氏菌、假單胞菌、沙門氏菌等[18-19]。楊汐靜等[20]通過(guò)Red同源重組技術(shù)成功構(gòu)建大腸桿菌膜外蛋白A的缺失菌株以探究OmpA基因?qū)Υ竽c桿菌的生長(zhǎng)影響。陶明新[21]依據(jù)此同源重組技術(shù)構(gòu)建了腸炎沙門菌的sipA基因缺失菌株以探究其致病性。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Red同源重組技術(shù)成功構(gòu)建獲得阪崎克羅諾腸桿菌的phoP基因缺失菌株，為探究該基因?qū)嫫榭肆_諾腸桿菌環(huán)境耐受力的影響提供了研究依據(jù)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，就阪崎克羅諾腸桿菌的生長(zhǎng)狀態(tài)而言，phoP基因的缺失明顯延緩了菌的生長(zhǎng)速率。在第3、4小時(shí)時(shí)，phoP基因缺失菌株培養(yǎng)液的OD600nm值僅為野生型菌株OD600nm值的41.79%、45.77%，可見(jiàn)phoP基因?qū)嫫榭肆_諾腸桿菌的生長(zhǎng)狀況具有一定的調(diào)節(jié)作用。這與Lin Zhiwei等[22]在志賀氏桿菌中發(fā)現(xiàn)的結(jié)論相符合。

酸堿耐受能力測(cè)定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，phoP基因在阪崎克羅諾腸桿菌應(yīng)對(duì)外界酸堿刺激變化的過(guò)程中，確實(shí)起到作用。就體內(nèi)而言，胃酸因其強(qiáng)酸性在很大程度上阻礙了致病菌的致病性。Bearson等[23]研究表明PhoP本身就是一種酸休克蛋白，phoP基因的缺失可能會(huì)略微增加有機(jī)酸的滲透性進(jìn)而影響細(xì)菌。Lin Zhiwei等[22]報(bào)道中指出PhoP/PhoQ系統(tǒng)調(diào)控了志賀氏桿菌對(duì)pH值的應(yīng)激反應(yīng)，其存在使得志賀氏桿菌能夠耐受低酸環(huán)境，促使該菌更快適應(yīng)環(huán)境生長(zhǎng)，這點(diǎn)與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符合，即phoP基因使得阪崎克羅諾腸桿菌在一定程度上更耐酸堿。相對(duì)成人而言，嬰幼兒的胃酸pH值要高一些，由母乳喂養(yǎng)的嬰兒胃酸值約2.7，而由奶粉喂養(yǎng)的嬰兒胃酸值更高為3.6左右，加上進(jìn)食之后胃酸被稀釋，pH值隨之升高，這也是嬰幼兒更容易被阪崎克羅諾腸桿菌感染致病的原因。柴云雷等[24]研究發(fā)現(xiàn)，阪崎克羅諾腸桿菌對(duì)酸的耐受力較強(qiáng)，但對(duì)堿耐受力弱，究其原因可能因?yàn)橼嫫榭肆_諾腸桿菌為革蘭氏陰性菌，細(xì)胞壁富含脂類物質(zhì)從而易與堿發(fā)生反應(yīng)，致使細(xì)胞膜破裂引發(fā)菌死亡。

阪崎克羅諾腸桿菌在6～45 ℃條件下均能生長(zhǎng)，最佳生長(zhǎng)溫度為25～37 ℃[25]。通過(guò)熱壓能力測(cè)定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，隨著溫度的升高，阪崎克羅諾腸桿菌的存活時(shí)間變短，而phoP基因的缺失會(huì)導(dǎo)致菌的滅活時(shí)間進(jìn)一步被縮短，由此可見(jiàn)，phoP基因起到了輔助阪崎克羅諾腸桿菌抵御外界熱壓的作用。對(duì)于阪崎克羅諾腸桿菌的防治與殺滅多體現(xiàn)應(yīng)用于奶粉中，為避免奶粉中其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)因高溫而被破壞，溫度不能過(guò)高。有關(guān)研究表明，巴斯德滅菌的溫度能夠殺滅阪崎克羅諾腸桿菌使其不得存活，故該菌的感染可能來(lái)自后續(xù)加工，猜測(cè)奶粉中的蛋白質(zhì)、糖類等成分可能在一定程度上增加了阪崎克羅諾腸桿菌的耐熱能力[24]。

膽汁是在消化系統(tǒng)中被發(fā)現(xiàn)的，另一種殺菌物質(zhì)膽鹽作為膽汁的重要構(gòu)成成分，已經(jīng)被證實(shí)具有殺菌作用，是阪崎克羅諾腸桿菌在胃腸道內(nèi)存活必須克服的一個(gè)主要壓力因素[26]。近年來(lái)，很多學(xué)者都致力于研究膽鹽在抑菌過(guò)程中起的作用，特別是對(duì)腸道內(nèi)細(xì)菌的作用，據(jù)推測(cè)，膽鹽的分泌能力與細(xì)菌的致病力直接相關(guān)[27]。Velkinburgh等[28]研究顯示，缺少PhoP/PhoQ調(diào)控系統(tǒng)的傷寒沙門氏菌突變株對(duì)膽汁的耐受濃度顯著低于野生型菌株，證實(shí)鼠傷寒沙門氏菌對(duì)膽汁的高水平抗性依賴于PhoP/PhoQ二元調(diào)控系統(tǒng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，phoP基因缺失菌株在不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)膽鹽溶液中的生長(zhǎng)狀況均劣于野生型菌株，由此推測(cè)，phoP基因能促使阪崎克羅諾腸桿菌更快適應(yīng)膽鹽應(yīng)激反應(yīng)。

滲透壓是威脅阪崎克羅諾腸桿菌在奶粉中存活的另一大阻礙，奶粉的水分活度低至0.2，這意味著阪崎克羅諾腸桿菌要 存活下來(lái)則必須克服高滲透壓環(huán)境。álvarez-Ordó?ez等[29]研究表明，在滲透壓作用下，蛋白質(zhì)的再生、大分子的損傷修復(fù)、細(xì)胞 膜結(jié)構(gòu)的維護(hù)及完整性以及一些代謝活動(dòng)對(duì)細(xì)菌的存活至關(guān)重要。Yuan Jing等[30]將PhoP/PhoQ二元調(diào)控系統(tǒng)與滲透?jìng)鞲新?lián)系起來(lái)，其研究表明缺乏phoP基因的菌株面臨高滲情況時(shí)，與野生型菌株相比表現(xiàn)出明顯的生長(zhǎng)滯后，證明了PhoP/PhoQ在高滲透壓環(huán)境中能夠加速細(xì)胞的修復(fù)。本研究結(jié)果顯示，phoP基因缺失導(dǎo)致阪崎克羅諾腸桿菌對(duì)于滲透壓的耐受力降低，與前人有關(guān)的研究結(jié)果相符合。

4 結(jié) 論

探究phoP基因?qū)嫫榭肆_諾腸桿菌環(huán)境耐受的影響，通過(guò)Red同源重組基因敲除手段，成功構(gòu)建出阪崎克羅諾腸桿菌的phoP基因缺失菌株。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)測(cè)定并繪制阪崎克羅諾腸桿菌野生型菌株和phoP基因缺失菌株的生長(zhǎng)曲線發(fā)現(xiàn)，phoP基因的缺失在一定程度上降低了阪崎克羅諾腸桿菌的生長(zhǎng)速率。從酸堿環(huán)境耐受實(shí)驗(yàn)看，阪崎克羅諾腸桿菌表現(xiàn)出耐酸不耐堿的性質(zhì)，野生型菌株對(duì)酸堿的耐受力優(yōu)于phoP基因缺失菌株。其次，對(duì)于溫度耐受能力測(cè)定的結(jié)果表明，phoP基因的缺失使得細(xì)菌的熱致死時(shí)間變短，phoP基因起到了輔助阪崎克羅諾腸桿菌抵御外界熱壓的作用；再者，選取4%、8%、12%膽鹽溶液對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌的膽鹽耐受力進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明隨膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，阪崎克羅諾腸桿菌的存活率呈遞減趨勢(shì)，phoP基因有利于阪崎克羅諾腸桿菌在膽鹽溶液中存活；最后，對(duì)于滲透壓環(huán)境的耐受實(shí)驗(yàn)表明，phoP基因也有助于阪崎克羅諾腸桿菌應(yīng)對(duì)高滲環(huán)境以存活。綜上所述，phoP基因有利于阪崎克羅諾腸桿菌的生長(zhǎng)以適應(yīng)外界環(huán)境壓力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步研究阪崎克羅諾腸桿菌的生長(zhǎng)特性及致病力提供一定理論依據(jù)。