唐婧紅，陳 雪*，代園鳳，李 祝，楊佩斯，張 素，吉玉玉，張欽語，趙妗頤

（1.貴州省煙草公司畢節(jié)市公司，貴州 畢節(jié) 551700；2.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025；3.貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

煙草青枯病是由青枯雷爾氏菌（Ralstoniasolanacearum）引起的一種維管束細(xì)菌性土傳細(xì)菌性病害[1-2]，最典型的癥狀是枯萎。發(fā)病初期往往出現(xiàn)煙株一側(cè)葉片枯萎，另一側(cè)葉片正常?？菸粋?cè)莖上有黑色條斑，根系變黑腐爛。發(fā)病后期，整株枯死[3]，是制約煙草生產(chǎn)的主要病害[4]。

煙草青枯病的防治方法有農(nóng)業(yè)防治、選育和栽培高抗品種、化學(xué)防治、生物防治等[5]。在我國(guó)，煙草青枯病的防治方法主要是化學(xué)防治，但是化學(xué)藥物的長(zhǎng)期使用不僅使病原菌產(chǎn)生抗藥性而且會(huì)引起土壤、水體污染等[6]。因此，生物防治顯得尤為重要[7]。近些年對(duì)于土傳病害主要研究領(lǐng)域是利用植物根際促生細(xì)菌[8-9]和內(nèi)生細(xì)菌[10]等方法來防治。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的防治煙草青枯病的拮抗細(xì)菌有芽孢桿菌（如枯草芽孢桿菌、短芽孢桿菌[11]、多粘類芽孢桿菌等）、假單胞菌（如銅綠假單胞菌[12]、熒光假單胞菌等）、放線菌（如灰白鏈霉菌、檸檬熒光鏈霉菌、極美鏈霉菌）等[13]。由于拮抗細(xì)菌容易受環(huán)境影響，所以局限于盆栽或小區(qū)試驗(yàn)，進(jìn)入實(shí)際生產(chǎn)的很少[14-15]。目前，對(duì)于防治植物青枯病的真菌鮮有報(bào)道，主要停留在叢枝菌根真菌和煙曲霉方面[16]。劉先良等[17]發(fā)現(xiàn)，叢枝菌根真菌可促進(jìn)煙草植株生長(zhǎng)，煙株地上部和根系的干質(zhì)量和磷含量以及地上部的氮含量顯著增加，同時(shí)煙草青枯病的病情指數(shù)及發(fā)病率降低。周曉見等[18-19]從煙田分離出一株對(duì)青枯雷爾氏菌有穩(wěn)定拮抗效果的真菌，鑒定為煙曲霉。

黑曲霉（Aspergillusniger）作為美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局認(rèn)定的安全發(fā)酵菌種，其適宜在酸性環(huán)境下生長(zhǎng)繁殖，菌體及發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)人畜無害，不影響環(huán)境[20]。目前，有報(bào)道利用黑曲霉孢子粉粗提物對(duì)青枯雷爾氏菌、根癌農(nóng)桿菌植物病菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)[21]和一種黑曲霉微丸對(duì)魔芋白絹病和軟腐病進(jìn)行防治[22]。黑曲霉泡騰片是一種新型的生防菌劑，它具有在水中快速崩解、攜帶方便、省時(shí)省力等特點(diǎn)[23]。本試驗(yàn)研究了黑曲霉泡騰片對(duì)煙草青枯病的防治效果和對(duì)煙草農(nóng)藝性狀的影響，以期為生防菌在煙草田間的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)菌株

煙草青枯雷爾氏病菌（Ralstoniasolanacearum）CQ11-2：分離自貴州省畢節(jié)地區(qū)大方縣煙草青枯病株，保存于貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室。黑曲霉（Aspergillusniger xj）：由貴州大學(xué)真菌資源研究所分離，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（武漢大學(xué)），保藏號(hào)：CCTCCNO：M206021。

二甲基亞砜（分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；氯霉素（分析純）：北京索寶來科技有限公司；氯化鈉（分析純）：重慶川東化工集團(tuán)有限公司；牛肉膏、蛋白胨（均為生化試劑）：上海盛思生化科技有限公司。

1.1.2 供試煙草品種

煙草品種云煙87：由貴州省煙草公司畢節(jié)市公司田壩鎮(zhèn)煙草基地提供。

1.2 儀器與設(shè)備

BIOMATE 3S紫外分光光度計(jì)：賽默飛世爾科技有限公司；HPD-68A恒溫?fù)u床：常州市華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-1FD單人單面凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液制備

將青枯雷爾氏病菌接種在牛肉膏蛋白胨斜面上于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，用無菌水沖洗斜面并稀釋成1×108CFU/mL，備用。

1.3.2 黑曲霉泡騰片抑菌試驗(yàn)

將黑曲霉孢子粉泡騰片、泡騰片輔料溶于二甲基亞砜，配制成質(zhì)量濃度為500 mg/mL的溶液。在無菌條件下，分別向1 mL的液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中加入10 μL上述溶液，使培養(yǎng)體系終質(zhì)量濃度為5 mg/mL。按20%的接種量接入菌懸液，以二甲基亞砜為溶劑對(duì)照、氯霉素為藥物對(duì)照。每個(gè)處理組3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，在37℃、150 r/min的條件下進(jìn)行搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)12 h，最大吸收波長(zhǎng)420 nm處測(cè)定其OD420nm值，進(jìn)而計(jì)算其抑菌率。抑菌率計(jì)算公式為：

1.3.3 育苗試驗(yàn)

黑曲霉泡騰片生防菌劑對(duì)煙苗生長(zhǎng)試驗(yàn)于2018年2月28日至4月20日在畢節(jié)市七星關(guān)區(qū)田壩鎮(zhèn)試驗(yàn)苗棚進(jìn)行。參照黑曲霉泡騰片制備工藝優(yōu)化的方法[23]，制備黑曲霉泡騰片。將黑曲霉泡騰片與水按1∶1 000（g∶mL）的比例投入育苗池中，將育苗盤置于帶水的育苗池內(nèi)，以清水培育的煙苗作對(duì)照，煙苗移栽前隨機(jī)抽取10株煙苗，測(cè)量并記錄其葉片數(shù)、株高、根長(zhǎng)、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量、最大葉長(zhǎng)、葉寬。

1.3.4 盆栽試驗(yàn)

選取長(zhǎng)勢(shì)一致的煙苗（4片真葉）移栽至盆中。分成6組，每組4個(gè)重復(fù)。移栽后分別澆灌清水、稀釋800倍、1 000倍、1 200倍的泡騰片和稀釋800倍、1 000倍和1 200倍的多粘類芽孢桿菌的定根水，一天一次，一次50 mL，一周后全部統(tǒng)一澆清水，煙草長(zhǎng)至6～8葉，備用。

（1）農(nóng)藝性狀

參照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YC/T 142—2010《煙草農(nóng)藝性狀調(diào)查方法》調(diào)查其葉片數(shù)、株高、最大葉長(zhǎng)、葉寬等農(nóng)藝性狀。

（2）病情調(diào)查

注射器抽取30 μL濃度為108CFU/mL的菌懸液，用針頭在葉片主脈兩側(cè)不完全對(duì)稱的位置上各刺2～3下，取下針頭，用注射器注孔抵壓住已刺孔部位，將菌懸液注射至上下表皮之間。每處理接種3片葉，重復(fù)4次，清水作對(duì)照，每天觀察記載葉片注射區(qū)癥狀的變化。10 d后以葉片為單位進(jìn)行病情分級(jí)[24]，分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)見表1[25]。

表1 葉片病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Grading standards of leaf disease

病情指數(shù)和防治效果計(jì)算公式如下：

1.3.5 大田試驗(yàn)

大田試驗(yàn)在貴州省畢節(jié)市七星關(guān)區(qū)田壩鎮(zhèn)煙草試驗(yàn)基地進(jìn)行。分別設(shè)2個(gè)處理，即稀釋1 000倍黑曲霉泡騰片和清水（對(duì)照）作定根水，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)區(qū)組，每區(qū)組60株煙株，行距1.2 m，株距0.5 m，隨機(jī)區(qū)組排列。參照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YC/T 142—2010《煙草農(nóng)藝性狀調(diào)查方法》[26]，采用5點(diǎn)法取樣，每點(diǎn)調(diào)查5株，分別在團(tuán)棵期、旺長(zhǎng)期調(diào)查煙草株高、葉片數(shù)、莖圍和最大葉長(zhǎng)、葉寬等主要農(nóng)藝性狀。

1.3.6 分析測(cè)定

抽取對(duì)照與施用黑曲霉泡騰片的初烤煙葉中部混合樣品，送至貴州省煙草科學(xué)研究院分析檢測(cè)研究中心進(jìn)行感官質(zhì)量檢測(cè)，貴州省煙草科學(xué)研究院評(píng)煙委員會(huì)進(jìn)行評(píng)吸，感官評(píng)吸標(biāo)準(zhǔn)見表2[27]。

表2 煙葉感官評(píng)吸標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Smoking sensory evaluation standard of tobacco leaf

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑曲霉泡騰片抑菌效果

黑曲霉泡騰片、輔料、二甲基亞砜、氯霉素對(duì)青枯雷爾氏菌的抑菌效果表明，黑曲霉泡騰片與氯霉素對(duì)青枯雷爾氏菌有較好的抑制作用，抑菌率達(dá)分別82.88%和93.23%，而輔料和二甲基亞砜對(duì)青枯雷爾氏菌無抑菌作用。為后續(xù)的防治煙草青枯病提供了良好的依據(jù)。

2.2 黑曲霉泡騰片對(duì)煙草育苗的影響

黑曲霉泡騰片對(duì)煙草育苗的影響結(jié)果見表3。

由表3可以看出施用黑曲霉泡騰片的煙草的農(nóng)藝性狀優(yōu)于對(duì)照組。其中葉片數(shù)、葉長(zhǎng)、葉寬、株高、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量較對(duì)照分別增加了6.70%、42.09%、29.28%、9.42%、105.16%、70.07%。葉長(zhǎng)、葉寬和鮮質(zhì)量與對(duì)照間差異顯著（P＜0.05）。

表3 黑曲霉泡騰片對(duì)煙草育苗的影響Table 3 Effect of Aspergillus niger effervescent tablets on tobacco seedling growth

2.3 黑曲霉泡騰片對(duì)煙草盆栽生長(zhǎng)的影響

2.3.1 不同稀釋倍數(shù)泡騰片與多粘類芽孢桿菌對(duì)煙草生長(zhǎng)的影響

將黑曲霉泡騰片分別稀釋800倍、1 000倍、1 200倍，多粘類芽孢桿菌稀釋1 000倍、1 200倍為生物對(duì)照藥，清水為對(duì)照，測(cè)量其葉片數(shù)、葉長(zhǎng)、葉寬、直徑和株高，結(jié)果見表4。

表4 不同稀釋倍數(shù)對(duì)煙草生長(zhǎng)的影響Table 4 Effect of different dilution times on tobacco growth

由表4可知，黑曲霉泡騰片稀釋800倍的處理組的農(nóng)藝性狀優(yōu)于清水對(duì)照和其他濃度處理，多粘類芽孢桿菌稀釋1 200倍（除株高）的農(nóng)藝性狀優(yōu)于同種藥物的其他稀釋倍數(shù)的農(nóng)藝性狀。通過方差分析，不同處理均與對(duì)照間差異顯著（P＜0.05）。其中黑曲霉泡騰片施用效果最佳為稀釋800倍，株高比對(duì)照增加80%，葉長(zhǎng)比對(duì)照增加37.8%、葉寬比對(duì)照增加40.37%、直徑比對(duì)照增加25%、葉片數(shù)比對(duì)照增加60%。而多粘類芽孢桿菌處理組中，稀釋1 200倍效果最佳，株高比對(duì)照增加37.8%、葉長(zhǎng)比對(duì)照增加23.8%、葉寬比對(duì)照增加15.12%、直徑比對(duì)照增加25%、葉片數(shù)比對(duì)照增加55%。綜上，施用稀釋800倍黑曲霉泡騰片的煙株農(nóng)藝性狀最優(yōu)。

2.3.2 不同稀釋倍數(shù)對(duì)煙草青枯病的防治效果

不同稀釋倍數(shù)對(duì)煙草青枯病的防治結(jié)果見表5，通過盆栽試驗(yàn)，結(jié)果表明，黑曲霉泡騰片稀釋1200倍和稀釋1000倍，相對(duì)防效為71.4%，優(yōu)于生防農(nóng)藥多粘類芽孢桿菌稀釋1200倍的防效（42.9%），當(dāng)泡騰片稀釋800倍，相對(duì)防效高達(dá)92.9%。由此可見，黑曲霉泡騰片的防治效果突出?？紤]到成本問題，在進(jìn)行大田試驗(yàn)時(shí)，發(fā)病嚴(yán)重的地塊，采用800倍稀釋的藥劑進(jìn)行預(yù)防，而發(fā)病較輕的地塊采用1 000倍稀釋的藥劑進(jìn)行預(yù)防。

表5 黑曲霉泡騰片對(duì)煙草青枯病溫室防效Table 5 Effect of Aspergillus niger effervescent tablets on greenhouse control of tobacco bacterial wilt

2.4 大田試驗(yàn)結(jié)果

采用1 000倍稀釋的藥劑進(jìn)行預(yù)防，不同處理組煙葉的農(nóng)藝性狀見表6。

表6 不同處理各生育期農(nóng)藝性狀Table 6 Agronomic traits at different growth stages under different treatments

由表6可知，黑曲霉泡騰片處理煙葉團(tuán)棵期和旺長(zhǎng)期的農(nóng)藝性狀都優(yōu)于對(duì)照組，其中團(tuán)棵期的葉片數(shù)比對(duì)照增加47.3%、葉長(zhǎng)比對(duì)照增加38.21%、葉寬比對(duì)照增加65.31%、直徑比對(duì)照增加84.21%、株高比對(duì)照增加58.98%，葉片數(shù)、葉長(zhǎng)、葉寬、直徑和株高與對(duì)照間存在顯著差異（P＜0.05）。旺長(zhǎng)期的葉片數(shù)比對(duì)照增加58.98%、葉長(zhǎng)比對(duì)照增加8.62%、葉寬比對(duì)照增加19.24%、直徑比對(duì)照增加28.9%、株高比對(duì)照增加5.31%。葉片數(shù)、葉長(zhǎng)、葉寬、直徑與對(duì)照間有顯著差異（P＜0.05）；株高與對(duì)照間沒有顯著差異（P＞0.05）。總的來說，1000倍稀釋的黑曲霉泡騰片在團(tuán)棵期和旺長(zhǎng)期對(duì)煙草有明顯的促生效果。由于田間對(duì)照和施用黑曲霉泡騰片的田塊都未發(fā)生煙草青枯病，所以沒有采集到大田防效的數(shù)據(jù)。

2.5 煙葉評(píng)吸質(zhì)量

黑曲霉泡騰片處理的煙葉的感官評(píng)吸結(jié)果見表7。由表7可知，施用黑曲霉泡騰片的煙葉評(píng)吸結(jié)果均優(yōu)于對(duì)照。說明施用黑曲霉泡騰能改善煙葉香氣質(zhì)，增加煙葉香氣量，使余味更加舒適，減輕煙葉的雜氣和刺激性，提高煙葉的可用性。

表7 煙葉評(píng)吸結(jié)果Table 7 Smoking evaluation results of tobacco leaf

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以云煙87為試材，通過盆栽試驗(yàn)和大田試驗(yàn)對(duì)黑曲霉泡騰片的生防效果和促生效果進(jìn)行探究。盆栽試驗(yàn)表明，黑曲霉泡騰片稀釋800倍時(shí)，對(duì)煙草青枯病的防治效果可達(dá)92.9%，顯著高于多粘類芽孢桿菌（42.9%）的防效，且有良好的促生效果。對(duì)采集的團(tuán)棵期、旺長(zhǎng)期煙株農(nóng)藝性狀的大田數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，黑曲霉泡騰片對(duì)煙株的生長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)作用，而且可以改善煙葉香氣質(zhì)，增加煙葉香氣量，使余味更加舒適，減輕煙葉的雜氣和刺激性，提高煙葉的可用性。黑曲霉作為美國(guó)食品及藥物管理局認(rèn)定的安全發(fā)酵菌種，因而具有很強(qiáng)的應(yīng)用潛力，但是關(guān)于黑曲霉泡騰片的促生機(jī)理、定殖能力和對(duì)煙草的經(jīng)濟(jì)性狀的影響還需進(jìn)一步的研究。