王麗媛，秦 文，霍軍生，卓 勤，楊 倬，王晶波，沈 葹，李 巖*

（中國疾病預(yù)防控制中心 營養(yǎng)與健康所，北京 100050）

黃酒作為中國傳統(tǒng)釀造酒的代表，最早可追溯到夏商時期，古人利用酒曲復(fù)式發(fā)酵法制作黃酒[1]。因此，黃酒與葡萄酒、啤酒并稱“世界三大古酒”，享有“國酒”的美譽[2]。黃酒在諸多史料和文學(xué)作品中都有記載，如書圣王羲之于曲水流觴之際醉書“天下第一行書”的《蘭亭集序》；南宋詩人陸游吟誦當(dāng)時的紹興釀酒業(yè)的“城中酒壚千百家”；近代魯迅筆下的咸亨酒店，呈現(xiàn)了諸多中國黃酒的傳統(tǒng)典故和傳統(tǒng)文化[3]。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，黃酒中含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、活性肽、酚類、低聚糖、維生素、礦物質(zhì)等基本營養(yǎng)成分以及γ-氨基丁酸、多酚類物質(zhì)、生物活性肽、功能性低聚糖、Monacolin K等具有特殊生物活性的功能性物質(zhì)，具有抗衰老、降血壓、降膽固醇和免疫調(diào)節(jié)的生理功效[4]。

肥胖已成為當(dāng)今全球性健康問題之一，易引發(fā)高血壓、冠心病、血脂異常等多種慢性疾病，成為危害大眾健康水平和生活狀態(tài)的重要原因。盡管黃酒有諸多保健功能，但黃酒同啤酒一樣，常被稱為“液體面包”[5]，飲用黃酒能否引起肥胖成為人們關(guān)注的問題。因此，本實驗進行了黃酒與健康大鼠肥胖相關(guān)指標(biāo)體質(zhì)量、血脂及腸道菌群的初步研究，揭示黃酒與機體肥胖的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

無特定病原體（species pathogen free，SPF）級SD雄性大鼠（共24只，體質(zhì)量（200±20）g）：斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司[生產(chǎn)許可證：SCXK（京）2014-0006]。

黃酒（紹興黃酒，三年陳釀，酒精度15%vol）：市售；食用酒精（普通級，酒精度95%vol）：市售。

腸道細(xì)菌脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：深圳華大基因科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

RV10V-C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國IKA公司；ME403E天平：瑞士梅特勒公司；AC2-4S1生物安全柜：新加坡ESCO公司；5427R高速冷凍離心機：德國EPPENDORF公司；全自動生化分析儀7600系列：日本HITACHI公司；Illumina HiSe2500測序儀：美國Illumina公司；NANO DROP紫外分光光度計：美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 動物實驗

動物飼養(yǎng)于中國疾病預(yù)防控制中心南緯路動物實驗室，許可證號SYXK（京）2009-0032，室溫20～26℃，相對濕度40%～70%，12 h光照，12 h黑暗。動物適應(yīng)3 d后根據(jù)體質(zhì)量隨機分為黃酒組、酒基對照組和空白對照組，每組動物各8只。黃酒組動物灌胃黃酒，酒基對照組動物灌胃15%酒基（95%食用酒精調(diào)配），空白對照組灌胃蒸餾水，灌胃量均為10 mL/kg體質(zhì)量，連續(xù)灌胃35 d。實驗期間動物自由進食和飲水，三組動物均給予基礎(chǔ)飼料，每周稱質(zhì)量一次，并調(diào)整灌胃量。實驗結(jié)束時，大鼠禁食24 h，眼眶采血，離心收集血清待測；解剖取肝臟稱質(zhì)量；取各組動物糞便-80℃冷凍保存待測。

動物實驗已通過中國疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與健康所倫理審查。

1.3.2 血液生化測定

采集的大鼠血液3000r/min離心15min，分離血清，采用全自動生化分析儀測定血清中總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high desity lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low desitylipoproteincholesterol，LDL-C）指標(biāo)。

1.3.3 腸道菌群高通量測序分析

采用華大基因研發(fā)的腸道細(xì)菌DNA提取試劑盒對各大鼠糞便樣品進行DNA提取，并使用通用引物515F（5"-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3"）和806R（5"-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3"）對16S rDNA的V4區(qū)進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增。

應(yīng)用IlluminaHiSe2500平臺對PCR產(chǎn)物進行測序，測序類型為PE250。下機數(shù)據(jù)濾除低質(zhì)量的reads，獲得cleandata。使用軟件FLASH（Fast Length Adjustment of Short reads，v1.2.11），將雙末端測序得到的reads拼接成Tags，利用軟件USEARCH（v7.0.1090）將優(yōu)化好的Tags在97%的相似度下聚類為分類操作單元（operational taxonomic units，OTU），用于物種注釋、物種復(fù)雜度分析以及組間物種α-多樣性分析。

1.3.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用軟件SPSS 16.0處理，各組以變異數(shù)進行方差分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)方差（xˉ±s）表示，P≥0.05無顯著差異，0.01≤P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃酒對大鼠體質(zhì)量的影響

由表1可知，灌胃35 d后的黃酒組大鼠與空白對照組相比，體質(zhì)量增量未見顯著差異（P≥0.05）。有文獻表明[6]，50.0 mL/kg體質(zhì)量劑量的黃酒在維持動物體質(zhì)量方面具有一定作用。本研究中動物直接灌胃黃酒，濃度較低，并未見明顯作用，但黃酒組大鼠體質(zhì)量增量較空白對照組有下降的趨勢。在實驗過程中，各組大鼠均保持正常飲水進食，精神狀態(tài)良好。

表1 各組大鼠體質(zhì)量檢測結(jié)果Table 1 Determination results of body mass of different groups of rats g

2.2 黃酒對大鼠血脂的影響

由表2可知，實驗結(jié)束時，黃酒組大鼠血清中TC、TG、HDL-C和LDL-C的含量與空白對照組相比差異均不顯著（P≥0.05），TG含量較空白對照組有升高的趨勢，但該值在0.77～2.10 mmol/L正常監(jiān)測范圍內(nèi)，酒基對照組動物結(jié)果同黃酒組。說明限量飲酒不會對血脂產(chǎn)生不良影響，但長期飲酒可能會引起TG水平上升。

表2 各組大鼠血脂指標(biāo)檢測結(jié)果Table 2 Determination results of blood lipid indexes of different groups of rats mmol/L

2.3 黃酒對大鼠腸道菌群的影響

2.3.1 黃酒對大鼠腸道微生物菌群α-多樣性的影響

腸道微生物多樣性是促進營養(yǎng)物質(zhì)吸收、維持機體免疫和新陳代謝的基礎(chǔ)，多樣性降低極易對宿主免疫產(chǎn)生影響，進而影響健康[7]。各組樣品所有序列按照97%的相似度進行OTU聚類，利用程序運算得到評價微生物Alpha多樣性（Alpha diversity）豐度。Alpha多樣性是對單個樣品中物種多樣性的分析[8]，包括Observed-species指數(shù)、Chao指數(shù)、Ace指數(shù)、Shannon指數(shù)及Simpson指數(shù)，前面4個指數(shù)越大，最后一個指數(shù)越小，說明樣品中的物種越豐富。物種豐富度相同的情況下，群落中各物種均勻度越大，群落多樣性越大[9]。表3結(jié)果表明，黃酒組Observed-species指數(shù)、Chao指數(shù)、Ace指數(shù)與空白對照組相比差異顯著（P＜0.05），Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)沒有顯著差異（P≥0.05）。由此推斷，黃酒對大鼠腸道菌群α-多樣性沒有顯著影響（P≥0.05）。

表3 大鼠腸道菌群α-多樣性統(tǒng)計分析Table 3 Alpha diversity statistical analysis of gut microbiota in rats

2.3.2 黃酒對大鼠腸道菌群門水平豐度的影響

各組樣品共產(chǎn)生938個OTU，被注釋到7個細(xì)菌門類，分別為厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）、柔膜菌門（Tenericutes）、放線菌門（Actinobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）和迷蹤菌門（Elusimicrobia），各組菌群組成和比例如圖1所示。

圖1 各組大鼠腸道菌群在門水平上的注釋結(jié)果Fig.1 Annotation results of gut microbiota in different groups of rats based on phylum-level

在腸道菌群中影響能量代謝平衡的兩個主要群落是擬桿菌門和厚壁菌門，已經(jīng)有研究表明，該兩種菌的含量和比例可作為判定肥胖潛在可能的依據(jù)[10-12]。XIE W等[13-14]研究發(fā)現(xiàn)，瘦的動物或者人與肥胖的對照組相比，具有更多的擬桿菌門和較少的厚壁菌門。由圖1可知，與空白對照組相比，黃酒組擬桿菌門上升了15%，厚壁菌門下降了16%，而酒基對照組與空白對照組相比，擬桿菌門下降了27%，厚壁菌門上升36%。結(jié)合2.1中的結(jié)果分析推測，健康大鼠體質(zhì)量增加緩慢的趨勢可能與黃酒改變了厚壁菌門和擬桿菌門含量有關(guān)。

2.3.3 黃酒對大鼠腸道菌群屬水平豐度的影響

在屬的水平上各組樣品主要注釋到21種菌，分別是不動桿菌屬（Acinetobacter）、嗜粘蛋白-艾克曼菌屬（Akkermansia）、Anoxybacillus屬，擬桿菌屬（Bacteroides）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、梭菌屬（Clostridium）、糞球菌屬（Coprococcus）、Corynebacterium屬、Geobacillus屬、乳桿菌屬（Lactobacillus）、甲烷短桿菌屬（Methanobrevibacter）、顫螺旋菌屬（Oscillospira）、考拉桿菌屬（Phascolarctobacterium）、普雷沃氏菌（Prevotella）、氏菌（Roseburia）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、八聯(lián)球菌屬（Sarcina）、Sutterella屬、Turicibacter屬、02d06菌屬及rc4_4菌屬。各組菌群組成及比例如圖2所示。

圖2 各組大鼠腸道菌群在屬水平上的注釋結(jié)果Fig.2 Annotation results of gut microbiota in different groups of rats based on genus-level

由圖2可知，黃酒組、酒基對照組和空白對照組中，普雷沃氏菌（Prevotella）豐度相對較高，其次是乳桿菌屬（Lactobacillus）和瘤胃球菌（Ruminococcus）。與空白對照組相比，黃酒組中雙歧桿菌屬、嗜粘蛋白-艾克曼菌屬和擬桿菌屬含量分別上升122%、76%、123%。黃酒組與酒基對照組相比，上述3個菌屬含量分別上升79%、126%、38%。黃酒中含有的功能性低聚糖可以被腸道內(nèi)的雙歧桿菌利用，促進雙歧桿菌增殖，增強機體免疫力[15]。雙歧桿菌是構(gòu)成腸道定殖抗力的主要細(xì)菌之一，其代謝產(chǎn)物主要是有機酸，引起腸道pH值下降，抑制了腸道致病菌如金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、痢疾桿菌、艱難梭菌及沙門氏菌等的生長繁殖，而自身的生長不受抑制，維持了腸道菌群的相對平衡[16-17]。DAO M C等[18-20]研究表明，嗜粘蛋白-艾克曼菌（Akkermansia muciniphila）是腸道中的一種黏蛋白降解菌，在肥胖及相關(guān)代謝疾?。ㄈ缣悄虿。┲芯哂嘘P(guān)鍵作用，可以調(diào)節(jié)人體能量平衡及脂代謝水平，其組成比例與宿主的健康之間存在正相關(guān)。有研究表明，擬桿菌在幫助宿主分解多糖、加快腸粘膜血管形成以及提高宿主免疫力、維持腸道微生態(tài)平衡等方面起到了重要作用[21-22]。結(jié)合2.1中的結(jié)果推測，黃酒組動物體質(zhì)量增量緩慢的趨勢可能與艾克曼菌屬和擬桿菌屬組成比例呈正相關(guān)。

3 結(jié)論

黃酒對健康大鼠體質(zhì)量沒有明顯降低的作用（P≥0.05），但對大鼠體質(zhì)量增加有減緩的趨勢。在實驗周期內(nèi)，黃酒對健康大鼠血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C含量沒有顯著影響（P≥0.05）。在門水平上，黃酒能夠上調(diào)厚壁菌門并下調(diào)擬桿菌門的組成比例；在屬的水平上，黃酒能夠上調(diào)雙歧桿菌屬、嗜粘蛋白-艾克曼菌屬和擬桿菌屬的組成比例，推測黃酒能夠改變與體質(zhì)量有關(guān)的大鼠腸道菌群組成比例，并對改善宿主腸道菌群結(jié)構(gòu)有促進作用。