王凌琴，李浩然，閆苗苗，鄭煜黌，陳 明，劉紅娜*

（西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030）

奶啤又稱“奶香檳”，是以鮮牛奶作為原料，利用二次生物發(fā)酵技術(shù)釀制的一種高附加值、低醇（0.5%vol～2.5%vol）、含二氧化碳的高級(jí)乳制飲品[1-3]。奶啤口感酸甜，有機(jī)地將酸奶和啤酒的香氣糅合在了一起，形成了奶啤特有的香氣[4]。同時(shí)具有維持腸道內(nèi)益生菌群多樣性[5]，調(diào)整腸道運(yùn)動(dòng)[6]改善便秘[7]、提高人體免疫力[8]、低酒精度、泡沫豐富、適度的二氧化碳、酸甜可口、營養(yǎng)全面的特點(diǎn)[9]。

隨著我國乳品工業(yè)的快速發(fā)展，奶啤的開發(fā)研究也不斷深化。奶啤在口感、風(fēng)味、保健、營養(yǎng)方面獲得了廣大消費(fèi)者的認(rèn)同，市場前景廣闊[10]。但是目前奶啤仍存在一些問題，國內(nèi)奶啤生產(chǎn)商大多采用市售的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）進(jìn)行奶啤發(fā)酵，造成產(chǎn)品的口味雷同，品種單一，酵母餿味較重[11]；生產(chǎn)過程中由于需要添加大量酒花、麥芽等原料，造成生產(chǎn)工藝復(fù)雜，成本偏高，不能很好的適應(yīng)市場的要求[12]。為解決上述問題，許多專家學(xué)者對(duì)奶啤的工藝進(jìn)行了多方面的試驗(yàn)，研究主要集中在配方[13-16]、發(fā)酵菌種[17-19]等方面的改善。目前，生產(chǎn)奶啤使用的乳酸菌主要是嗜熱鏈球菌（Streptococcusthermophilus）、保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus），鮮少使用干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）作為奶啤的發(fā)酵劑。干酪乳桿菌發(fā)酵乳飲料能避免沉淀的產(chǎn)生，保持酒體泡沫豐富[20]，增強(qiáng)奶香和醇香風(fēng)味，更好地改善口感。

本試驗(yàn)以奶啤感官評(píng)定、酒精度、酸度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，以鮮牛奶、麥芽和酒花為主要原料，通過從益生菌飲料養(yǎng)樂多中分離純化的干酪乳桿菌與啤酒酵母進(jìn)行二次發(fā)酵研制新型奶啤，通過單因素及正交試驗(yàn)，對(duì)酵母菌接種量、啤酒原漿與原發(fā)酵乳的體積比、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間等工藝參數(shù)進(jìn)行研究，確定其最佳工藝條件，并對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行分析，旨在為奶啤工業(yè)化生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮牛奶（水分86.5%、脂肪3.5%、蛋白質(zhì)3.2%、灰分1.3%、乳糖4.5%）：西北民族大學(xué)養(yǎng)殖場；脫脂奶粉：新西蘭恒天然集團(tuán)；麥芽汁及酒花：大連杰菲食品有限公司；蔗糖：市售；干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）：本實(shí)驗(yàn)室從養(yǎng)樂多中分離得到；啤酒酵母M54：英國Imake公司；蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物、吐溫-80、瓊脂、硫酸鎂、葡萄糖、檸檬酸二胺、鄰苯二甲酸氫鉀、乳糖、乙酸鈉、磷酸氫二鉀、硫酸錳、碳酸鈣、氫氧化鈉、體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純或生化試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

JA2003N型電子天平：上海精密儀器有限公司；TGL16M型離心機(jī)：長沙市易達(dá)科貿(mào)公司；MC-3032S高壓蒸汽滅菌鍋：Midorigaoka公司；PB-10酸度計(jì)：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；DHP-9272恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；DHG-9241A型電熱恒溫干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；酒精計(jì)：河北省河間市黎民居儀表廠。

1.3 方法

1.3.1 奶啤加工工藝流程[13]

鮮牛奶→預(yù)處理→離心脫脂→加糖→殺菌→均質(zhì)→冷卻→接種→發(fā)酵→冷卻后熟→原發(fā)酵乳液→后發(fā)酵（二次發(fā)酵）→過濾→殺菌→成品（奶?。?/p>

1.3.2 操作要點(diǎn)

原料預(yù)處理：新鮮牛奶用100目紗布過濾，以除去雜質(zhì)。

離心脫脂：將過濾后的鮮奶放入離心機(jī)中以4500r/min的轉(zhuǎn)速離心20 min，進(jìn)行乳脂分離，得到脫脂牛奶。

加糖、殺菌、冷卻：在脫脂牛奶中加入8%的蔗糖，并攪拌均勻，在65℃、15 min條件下殺菌，并冷卻至45℃。

均質(zhì)：將殺菌后的脫脂牛奶在15～20MPa壓力下均質(zhì)，使產(chǎn)品口感細(xì)膩，提高穩(wěn)定性[21]。

生產(chǎn)發(fā)酵劑的制備[22]：將干酪乳桿菌接入滅菌的12%脫脂乳粉培養(yǎng)基中，在37℃恒溫培養(yǎng)至凝固，即為母發(fā)酵劑，再進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，直至凝固時(shí)間均在8 h，即制得生產(chǎn)發(fā)酵劑，冷藏備用。

接種、發(fā)酵[22]：脫脂處理后的牛奶中接入5%的生產(chǎn)發(fā)酵劑，在37℃條件下發(fā)酵18 h。

冷卻后熟[23]：將發(fā)酵好的酸乳放入4℃條件下進(jìn)行后熟發(fā)酵12 h，使發(fā)酵乳形成良好風(fēng)味，得到原發(fā)酵乳液。

啤酒酵母活化[13]：取8°P煮沸麥芽汁50 mL，加等量的無菌水，迅速冷卻至18～20℃，加入2 g啤酒酵母，進(jìn)行保溫活化。在活化過程中搖床轉(zhuǎn)速應(yīng)控制在200 r/min，使得麥芽汁和酵母均勻接觸，活化2 h后備用。

啤酒原漿的制備[24]：將麥芽汁（含酒花）進(jìn)行高壓滅菌（121℃，20 min），取300 mL冷卻后的麥芽汁接入一定量的活化酵母液。發(fā)酵溫度為20℃，發(fā)酵48h后，殘?zhí)墙抵?°Bx，降溫至10℃排渣，即得到啤酒原漿。

二次發(fā)酵：將啤酒原漿與原發(fā)酵乳液按照一定比例加入混合后進(jìn)行二次發(fā)酵（后發(fā)酵），發(fā)酵溫度28℃，發(fā)酵時(shí)間16 h，酒精度為2.0%vol～2.5%vol時(shí)后發(fā)酵完成，然后降溫至0℃。

過濾、殺菌：貯酒4 d后進(jìn)行過濾（8層紗布），再以70℃、15 min條件進(jìn)行后殺菌，即得奶啤成品。

1.3.3 奶啤發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

活化酵母接種量分別為3%、4%、5%、6%、7%，蔗糖添加量分別為6%、7%、8%、9%、10%，將啤酒原漿與原發(fā)酵乳按9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、1∶1體積比混合，二次發(fā)酵溫度24 ℃、26 ℃、28 ℃、30℃、32℃，發(fā)酵時(shí)間8 h、12 h、16 h、20 h、24 h的條件下進(jìn)行二次發(fā)酵。殺菌后取樣測定各發(fā)酵液酒精度、酸度，并進(jìn)行感官評(píng)定，考察不同酵母接種量、蔗糖添加量、啤酒原漿與原發(fā)酵乳體積比、二次發(fā)酵溫度及二次發(fā)酵時(shí)間對(duì)奶啤品質(zhì)的影響。

1.3.4 奶啤發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

以奶啤酒精度、滴定酸度和感官評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，以酵母接種量（A）、啤酒原漿與原發(fā)酵乳的體積比（B）、二次發(fā)酵溫度（C）和二次發(fā)酵時(shí)間（D）為主要影響因素，進(jìn)行4因素3水平L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素與水平見表1。

表1 奶啤工藝條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for process conditions optimization of milk beer

1.3.5 感官評(píng)定

采用感官鑒定評(píng)分法[25]選評(píng)價(jià)員20人，按照酸甜比、氣味、酒味、口感及組織狀態(tài)、綜合風(fēng)味在奶啤感官中的重要程度，確定相應(yīng)評(píng)分比例，總分100分，奶啤的感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 奶啤的感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of milk beer

續(xù)表

1.3.6 理化指標(biāo)測定

酒精含量、滴定酸度測定參考文獻(xiàn)[26]中的方法進(jìn)行；蛋白質(zhì)測定參考NY/T 799—2004《發(fā)酵型含乳飲料》[27]；可溶性固形物測定參考GB/T 23546—2009《奶酒》[28]。

1.3.7 統(tǒng)計(jì)分析方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Micorosoft Excel 2010和SPSS Statistics 17.0進(jìn)行分析處理。同時(shí)用Duncan"s法進(jìn)行顯著性分析和標(biāo)準(zhǔn)偏差（standard deviation，SD）的計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同單因素對(duì)奶啤品質(zhì)的影響

2.1.1 酵母接種量對(duì)奶啤品質(zhì)的影響

酵母菌接種量對(duì)奶啤滴定酸度、酒精度及感官品質(zhì)的影響結(jié)果分別見圖1和表3。

圖1 酵母接種量對(duì)奶啤酒精度和滴定酸度的影響Fig.1 Effect of yeast inoculum on alcohol content and titration acidity of milk beer

由圖1可知，隨著酵母接種量在3%～7%范圍內(nèi)的增大，酒精度和滴定酸度呈增大趨勢；5%接種量發(fā)酵的奶啤酒精度、滴定酸度分別為1.6%vol、76.9°T；接種量＞5%之后，奶啤酒精度、滴定酸度偏高。結(jié)果表明，接種量5%的奶啤酒精度、滴定酸度均較為適宜。

表3 酵母接種量對(duì)奶啤感官品質(zhì)的影響Table 3 Effect of yeast inoculum on sensory quality of milk beer

由表3可知，接種量＜5%之前，酸感較大，香味較差，味寡淡；接種量＞5%之后，酵母自溶數(shù)量會(huì)增多，使奶啤產(chǎn)生酵母味或其他異味[30]；5%接種量奶啤香味協(xié)調(diào)，飽滿，口感柔和，酸甜適中，感官評(píng)分達(dá)到最大值，為79分。

因此，綜合考慮，酵母接種量為5%時(shí)為宜。

2.1.2 啤酒原漿與原發(fā)酵乳體積比對(duì)奶啤品質(zhì)的影響

啤酒原漿和原發(fā)酵乳的體積比對(duì)奶啤滴定酸度、酒精度及感官品質(zhì)的影響結(jié)果分別見圖2和表4。

圖2 啤酒原漿與原發(fā)酵乳的體積比對(duì)奶啤酒精度和滴定酸度的影響Fig.2 Effect of volume ratio of beer raw pulp to raw fermented milk on alcohol content and titration acidity of milk beer

由圖2可知，隨著啤酒原漿與原發(fā)酵乳液體積比的減小，酒精度呈下降趨勢，滴定酸度呈增大趨勢。啤酒原漿與原發(fā)酵乳的體積比為9∶1～7∶3時(shí)，酒精度過高，滴定酸度過低；啤酒原漿與原發(fā)酵乳的體積比為7∶3時(shí)，酒精度和滴定酸度分別為2.2%vol、72.8°T；啤酒原漿與原發(fā)酵乳的體積比為7∶3～1∶1時(shí)，酒精度過低，僅為1.5%vol，而滴定酸度達(dá)到82°T。結(jié)果表明，啤酒原漿與原發(fā)酵乳的體積比為7∶3時(shí)，酒精酸度和滴定酸度均較為適宜。

由表4可知，啤酒原漿與原發(fā)酵乳的體積比為9∶1～7∶3時(shí)，奶啤均表現(xiàn)為酒味重，乳香淡，香味不協(xié)調(diào)并伴有酵母味；啤酒原漿與原發(fā)酵乳的體積比在7∶3時(shí)，奶啤口感好，感官評(píng)分最高，為76分，且風(fēng)味醇厚、酸甜適中。啤酒原漿與原發(fā)酵乳的體積比為7∶3～1∶1時(shí)，奶啤均表現(xiàn)為酒味較淡，奶香較濃，偏酸且有明顯絮片。

因此，綜合考慮，啤酒原漿與原發(fā)酵乳的體積比7∶3為宜。

表4 啤酒原漿與原發(fā)酵乳的體積比對(duì)奶啤感官品質(zhì)的影響Table 4 Effect of volume ratio of raw beer slurry to raw fermented milk on sensory quality of milk beer

2.1.3 二次發(fā)酵溫度對(duì)奶啤品質(zhì)的影響

二次發(fā)酵溫度對(duì)奶啤滴定酸度、酒精度及感官品質(zhì)的影響結(jié)果分別見圖3和表5。

圖3 二次發(fā)酵溫度對(duì)奶啤酒精度和滴定酸度的影響Fig.3 Effect of secondary fermentation temperature on alcohol content and titration acidity of milk beer

由圖3可知，隨著發(fā)酵溫度在24～32℃范圍內(nèi)升高，奶啤的酒精度和滴定酸度均呈增大趨勢。發(fā)酵溫度低于28℃之前，奶啤酒精度和滴定酸度偏低；發(fā)酵溫度為28℃時(shí)，奶啤酒精度和滴定酸度分別為2.1%vol、71.7°T；發(fā)酵溫度高于28℃之后，奶啤酒精度和滴定酸度均偏高。結(jié)果表明，發(fā)酵溫度28℃時(shí)，奶啤酒精度和滴定酸度均較為適宜。

表5 二次發(fā)酵溫度對(duì)奶啤感官品質(zhì)的影響Table 5 Effect of secondary fermentation temperature on sensory quality of milk beer

由表5可知，發(fā)酵溫度低于28℃之前，奶啤口感均較為細(xì)膩、香氣較為適宜，味偏甜；發(fā)酵溫度為28℃時(shí)，殺口感適中，口感細(xì)膩、風(fēng)味協(xié)調(diào)、柔和，酸甜適中感官評(píng)分最高，為78分。發(fā)酵溫度高于28℃之后，奶啤酒味均較重，口感粗糙且風(fēng)味較差。

因此，綜合考慮，二次發(fā)酵溫度28℃為宜。

2.1.4 二次發(fā)酵時(shí)間對(duì)奶啤品質(zhì)的影響

二次發(fā)酵時(shí)間對(duì)奶啤滴定酸度、酒精度及感官品質(zhì)的影響結(jié)果分別見圖4和表6。

圖4 二次發(fā)酵時(shí)間對(duì)奶啤發(fā)酵酒精度和滴定酸度的影響Fig.4 Effect of secondary fermentation time on alcohol content and titration acidity of milk beer

由圖4可知，隨著發(fā)酵時(shí)間在8～24 h范圍內(nèi)的增加，奶啤酒精度和滴定酸度均呈增大趨勢。發(fā)酵時(shí)間＜16 h之前，奶啤酒精度和滴定酸度偏低；發(fā)酵時(shí)間為16 h時(shí)，奶啤酒精度和滴定酸度分別為2.4%vol、71.7°T；發(fā)酵時(shí)間＞16 h之后，奶啤酒精度和滴定酸度均偏高。結(jié)果表明，發(fā)酵時(shí)間為16h時(shí)，奶啤酒精度和滴定酸度均較為適宜。

表6 二次發(fā)酵時(shí)間對(duì)奶啤感官品質(zhì)的影響Table 6 Effect of secondary fermentation time on sensory quality of milk beer

由表6可知，發(fā)酵時(shí)間＜16 h之前，酵母發(fā)酵程度低，酒味淡，酸味不足；發(fā)酵時(shí)間為16 h時(shí)，所得的奶啤有較好的風(fēng)味，酒香和奶香飽滿柔和，感官評(píng)分最高，為80分；發(fā)酵時(shí)間＞16 h之后，酵母發(fā)酵程度高，酒味濃，酵母味濃，風(fēng)味不協(xié)調(diào)且味偏酸。

因此，綜合考慮，二發(fā)酵時(shí)間16 h為宜。

2.1.5 蔗糖添加量對(duì)奶啤品質(zhì)的影響

不同蔗糖的添加量對(duì)奶啤滴定酸度、酒精度及感官品質(zhì)的影響結(jié)果分別見圖5和表7。

圖5 蔗糖添加量對(duì)奶啤發(fā)酵酒精度和滴定酸度的影響Fig.5 Effect of sugar addition on alcohol content and titration acidity of milk beer

由圖5可知，隨著蔗糖添加量在6%～10%范圍內(nèi)增加，奶啤酒精度和滴定酸度基本呈增大趨勢。蔗糖添加量＜8%之前，奶啤酒精度和滴定酸度均偏低；蔗糖添加量8%時(shí)，奶啤酒精度和滴定酸度為2.1%vol、76.6°T；蔗糖添加量＞8%之后，奶啤酒精度和滴定酸度均偏高。結(jié)果表明，蔗糖添加量為8%時(shí)，奶啤酒精度和滴定酸度均較為適宜。

表7 蔗糖添加量對(duì)奶啤感官品質(zhì)的影響Table 7 Effect of sugar addition on sensory quality of milk beer

由表7可知，蔗糖添加量＜8%之前，奶啤均表現(xiàn)為香氣單淡薄，味偏酸；蔗糖添加量為8%時(shí)，奶啤酒香、乳香協(xié)調(diào)，口感細(xì)膩，酸甜適中，感官評(píng)分最高，為80分；蔗糖添加量＞8%之后，奶啤香味濃郁，味偏甜。

因此，綜合考慮，蔗糖添加量8%為宜。

2.2 奶啤發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

以奶啤酒精度、滴定酸度和感官評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，以酵母接種量（A）、啤酒原漿與原發(fā)酵乳的體積比（B）、二次發(fā)酵溫度（C）和二次發(fā)酵時(shí)間（D）為主要影響因素，進(jìn)行4因素3水平L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)果與分析見表8，方差分析結(jié)果見表9～表11。

由表9可知，以奶啤酒精度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)結(jié)果影響大小順序?yàn)锽＞A＞D＞C，即啤酒原漿與原發(fā)酵乳的體積比＞酵母接種量＞二次發(fā)酵時(shí)間＞二次發(fā)酵溫度；酵母接種量、啤酒原漿與原發(fā)酵乳的體積比、二次發(fā)酵時(shí)間、二次發(fā)酵溫度差異均極顯著（P＜0.01），所以選擇A2B2C2D2作為奶啤發(fā)酵工藝的最優(yōu)組合。由表10可知，以酸度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)結(jié)果影響大小順序?yàn)锽＞C＞D＞A，即啤酒原漿與原發(fā)酵乳體積比是奶啤酸度產(chǎn)生的主要因素，二次發(fā)酵溫度、二次發(fā)酵時(shí)間、酵母接種量對(duì)奶啤酸度的影響依次減小，接種量未對(duì)奶啤酸度產(chǎn)生顯著性影響。由表11可知，以感官評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，啤酒原漿與原發(fā)酵乳的體積比、二次發(fā)酵時(shí)間、二次發(fā)酵溫度差異均極顯著（P＜0.01），以A2B2C2D2最佳奶啤發(fā)酵條件組合。

表8 奶啤工藝條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 8 Results and analysis of orthogonal tests for process conditions optimization of milk beer

表9 以酒精度為評(píng)價(jià)指標(biāo)的正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 9 Variance analysis of orthogonal tests results using alcohol content as evaluation index

表10 以滴定酸度為評(píng)價(jià)指標(biāo)的正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 10 Variance analysis of orthogonal tests results using titration acidity as evaluation index

表11 以感官評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)的正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 11 Variance analysis of orthogonal tests results using sensory scores as evaluation index

結(jié)果表明，啤酒原漿與原發(fā)酵乳的體積比是影響奶啤發(fā)酵質(zhì)量和風(fēng)味的主要因素，奶啤以A2B2C2D2為最佳生產(chǎn)工藝條件組合，即酵母接種量5%，啤酒原漿與原發(fā)酵乳體積比7∶3，二次發(fā)酵溫度28℃，二次發(fā)酵時(shí)間16 h。在此優(yōu)化工藝條件下，酒精度為2.176%vol，酸度為81.356°T，蛋白質(zhì)含量為0.974%，可溶性固形物含量為13.4%，感官評(píng)分為89分。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以鮮牛奶、麥芽和酒花為主要原料，從益生菌飲料養(yǎng)樂多中分離純化的干酪乳桿菌與啤酒酵母進(jìn)行二次發(fā)酵制成新型含乳飲料。通過單因素及正交試驗(yàn)確定奶啤最佳生產(chǎn)工藝條件為：酵母接種量5%，啤酒原漿與原發(fā)酵乳的體積比7∶3，二次發(fā)酵溫度28℃，二次發(fā)酵時(shí)間16 h。在最佳工藝條件下制得的奶啤各項(xiàng)指標(biāo)分別為：酒精度2.176%vol，酸度81.356 °T，蛋白質(zhì)含量0.974%，可溶性固形物含量13.4%，感官評(píng)分為89分，酒香和乳香和諧，風(fēng)味飽滿，殺口感較適中，口感細(xì)膩、清爽，酸甜適中。