盧盼玲， 郭世榮， 楊學(xué)東， 馮 巖， 季維維， 張 輝， 田守波， 朱為民，①

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院， 江蘇 南京 210095； 2. 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院設(shè)施園藝研究所 上海市設(shè)施園藝技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 上海 201403；3. 上海星輝種苗有限公司， 上海 201403)

表觀遺傳機(jī)制可調(diào)控植物對逆境脅迫的應(yīng)答，組蛋白變體H2A.Z 為重要的表觀修飾因子，參與多種非生物脅迫[1-3]，并且，其基因家族成員較多[4-5]。hta9hta11雙突變體植株具有多效性表型，且H2A.Z基因家族其他成員的表達(dá)不能補(bǔ)償HTA9 和HTA11 蛋白功能缺失[6]。

番茄(LycopersiconesculentumMill.)為重要的設(shè)施蔬菜和常用的模式植物，對低溫敏感[7]。 亞低溫條件下番茄hta9hta11雙突變體生長明顯遲緩[8]。 為了探明亞低溫條件下番茄組蛋白變體H2A.Z 對光合碳同化表觀遺傳機(jī)制的作用，作者就亞低溫對番茄野生型和hta9hta11雙突變體光合碳同化相關(guān)指標(biāo)的影響進(jìn)行了研究，以期進(jìn)一步探明番茄組蛋白變體H2A.Z 的功能，并為利用表觀遺傳修飾提高番茄對亞低溫的耐受能力進(jìn)而提高番茄產(chǎn)量和品質(zhì)提供研究基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

以上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院設(shè)施園藝研究所上海市設(shè)施園藝技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存的番茄品種‘1479’的野生型和hta9hta11雙突變體幼苗為研究對象。

1.2 方法

1.2.1 亞低溫處理方法 選取3 葉1 心期長勢良好且基本一致的野生型和hta9hta11雙突變體幼苗，移入人工氣候箱中，培養(yǎng)1 d 后進(jìn)行亞低溫處理。 設(shè)置對照組(晝溫和夜溫分別為25 ℃和20 ℃)和處理組(晝溫和夜溫分別為15 ℃和10 ℃)。 其他培養(yǎng)條件相同，光照時(shí)間14 h·d-1、光照強(qiáng)度500 μmol·m-2·s-1，空氣相對濕度70%。 栽培基質(zhì)為V(泥炭)∶V(蛭石)= 2 ∶1的混合基質(zhì)。 采用隨機(jī)區(qū)組排列，每組野生型和hta9hta11雙突變體幼苗各50 株，均3 個(gè)重復(fù)。 處理20 d 后取樣檢測各指標(biāo)。

1.2.2 指標(biāo)測定 在晴天9：00 至11：00，每組取3 株苗，用GFS-3000 便攜式高級(jí)光合作用-熒光測量系統(tǒng) (德國Walz公司)測定苗頂端向下第3 枚葉的凈光合速率，重復(fù)測定3 次。 測定時(shí)，開放氣路，光照強(qiáng)度800 μmol·m-2·s-1，CO2濃度500 μmol·mol-1，葉室溫度(25±2) ℃，空氣相對濕度60%～70%。

每組取9 株苗，采集頂端向下第2 和第3 枚葉，測定葉綠素含量[9]以及淀粉和蔗糖含量[10]，并測定果糖-1，6-二磷酸醛縮酶活性[11]以及核酮糖-1，5-二磷酸羧化/加氧酶和果糖-1，6-二磷酸酯酶活性[12]。 每個(gè)指標(biāo)重復(fù)測定3 次。

每組取9 株苗，采集頂端向下第2 和第3 枚葉，每3 株為1 組，視為1 個(gè)重復(fù)。 將葉剪碎后混合，稱取0.1 g，在液氮中研磨成粉，用RNA 提取試劑盒〔寶生物工程(大連)有限公司〕提取總RNA，用PrimeScriptTMRT Master Mix 反轉(zhuǎn)錄試劑盒〔寶生物工程(大連)有限公司〕合成cDNA 第1 條鏈，用TBTMGreenPremixDimerEraser 試劑盒〔寶生物工程(大連)有限 公司〕在AppliedBiosystemsQuantStudio5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國ABI 公司)上完成擴(kuò)增反應(yīng)，并采用2-ΔΔCt法[13]計(jì)算基因的相對表達(dá)量。 供試基因引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列見表1。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用EXCEL 2016 軟件處理數(shù)據(jù)，采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果和討論

亞低溫對番茄野生型和hta9hta11雙突變體光合碳同化相關(guān)指標(biāo)的影響見表2。 由表2 可見：對照組(晝溫25 ℃和夜溫20 ℃)野生型和hta9hta11雙突變體的凈光合速率(Pn)，葉綠素(Chl)和蔗糖(Suc)含量，果糖-1，6-二磷酸醛縮酶(FBA)、果糖-1，6-二磷酸酶(FBPase)和核酮糖-1，5-二磷酸羧化/加氧酶(Rubisco)活性以及PRK、RbcS、RbcL、FBPase和FBA基因的相對表達(dá)量無顯著差異；hta9hta11雙突變體的淀粉(Sta)含量和TK基因的相對表達(dá)量顯著(P＜0.05)低于野生型，而其GAPDH、SBPase和RCA基因的相對表達(dá)量顯著高于野生型。 處理組(晝溫15 ℃和夜溫10 ℃)，hta9hta11雙突變體的Chl 含量略低于野生型；其Pn 值，Suc 和Sta 含量，F(xiàn)BA和FBPase 活性以及TK、GAPDH、SBPase、PRK、RbcL、RCA、FBPase和FBA基因的相對表達(dá)量顯著低于野生型；而其Rubisco 活性和RbcS基因的相對表達(dá)量顯著高于野生型。

表1 用于擴(kuò)增反應(yīng)的各基因的引物序列Table 1 Primer sequences of each gene used for amplification reaction

由表2 還可見：就野生型而言，對照組和處理組間的Chl和Suc 含量、Rubisco 活性和TK基因的相對表達(dá)量無顯著差異；處理組的Pn 值、Sta 含量和RbcS基因的相對表達(dá)量顯著低于對照組，而其FBA 和FBPase 活性以及GAPDH、SBPase、PRK、RbcL、RCA、FBPase和FBA基因的相對表達(dá)量顯著高于對照組。 就hta9hta11雙突變體而言，對照組和處理組間的Chl 和Suc 含量、Rubisco 活性以及FBPase和FBA基因的相對表達(dá)量無顯著差異；處理組的Pn 值，Sta 含量，F(xiàn)BA 活性以及TK、GAPDH和RCA基因的相對表達(dá)量顯著低于對照組，而其FBPase 活性以及SBPase、PRK、RbcS和RbcL基因的相對表達(dá)量顯著高于對照組。

表2 亞低溫對番茄野生型(WT)和hta9hta11 雙突變體(hta9hta11)光合碳同化相關(guān)指標(biāo)的影響(±SD)1)Table 2 Effect of mild hypothermia on photosynthetic carbon assimilation related indexes of wild type (WT) and hta9hta11 double mutant(hta9hta11) of Lycopersicon esculentum Mill. (±SD)1)

表2 亞低溫對番茄野生型(WT)和hta9hta11 雙突變體(hta9hta11)光合碳同化相關(guān)指標(biāo)的影響(±SD)1)Table 2 Effect of mild hypothermia on photosynthetic carbon assimilation related indexes of wild type (WT) and hta9hta11 double mutant(hta9hta11) of Lycopersicon esculentum Mill. (±SD)1)

處理2)Treatment2)Pn/(μmol·m-2·s-1)C1/(mg·g-1)C2/(mg·g-1)C3/(mg·g-1)WT hta9hta11 WT hta9hta11 WT hta9hta11 WT hta9hta11 CK 11.53±1.20Aa 11.84±1.41Aa 2.44±0.13Aa 2.57±0.22Aa 63.85±4.74Aa 58.69±5.66Aa 115.67±11.99Aa 100.24±9.81Ab T 8.59±1.57Ba 6.64±1.01Bb 2.32±0.14Aa 2.22±0.12Aa 70.46±5.90Aa 54.38±3.96Ab 73.03±7.62Ba 61.68±4.45Bb處理2)Treatment2)A1/(nmol·min-1·g-1)A2/(nmol·min-1·g-1)A3/(nmol·min-1·g-1)RE1 WT hta9hta11 WT hta9hta11 WT hta9hta11 WT hta9hta11 CK 80.79±0.50Ba 81.18±4.57Aa 34.83±2.35Ba 33.67±1.90Ba 83.59±6.43Aa 107.17±9.82Aa 0.50±0.05Aa 0.36±0.01Ab T 90.91±6.50Aa 52.46±7.42Bb 63.18±4.69Aa 47.08±3.98Ab 92.16±9.82Ab 130.74±13.39Aa 0.51±0.11Aa 0.18±0.01Bb

續(xù)表2 Table 2 (Continued)

本研究中，處理組番茄野生型和hta9hta11雙突變體的Pn值顯著低于對照組，處理組hta9hta11雙突變體的Pn 值顯著低于野生型，說明hta9hta11雙突變體對亞低溫更敏感。 處理組hta9hta11雙突變體的Suc 和Sta 含量顯著低于野生型；處理組hta9hta11雙突變體的FBA 和FBPase 活性顯著低于野生型，而其Rubisco 活性顯著高于野生型，據(jù)此推測在亞低溫條件下番茄組蛋白變體H2A. Z 可能對光合碳同化關(guān)鍵酶活性有調(diào)節(jié)作用。 與對照組相比，hta9hta11雙突變體TK、GAPDH和RCA基因的相對表達(dá)量顯著下降，而SBPase、PRK、RbcS和RbcL基因的相對表達(dá)量卻顯著上升，說明在亞低溫條件下番茄組蛋白變體H2A. Z 可能參與調(diào)控光合碳同化關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，但具體調(diào)控機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步研究。 綜合分析認(rèn)為，亞低溫條件下番茄hta9hta11雙突變體的光合碳同化能力低于野生型，組蛋白變體H2A.Z 可能在調(diào)控番茄光合碳同化途徑中起重要作用。