陳 政， 董天宇， 葛孟清， 王 晨

(南京農業(yè)大學園藝學院， 江蘇 南京 210095)

目前對梅樹(PrunusmumeSieb. et Zucc.)花期預測主要基于開花物候期與氣象因子的相關性研究，通過分析其開花物候期的變化規(guī)律及其與氣象因子的相關性，得出影響梅樹花期的關鍵氣象因子[1]；也有研究者通過觀察花芽外觀形態(tài)的動態(tài)變化，建立梅樹花期需冷量等計算模型[2-4]，作為預測梅樹花期的依據。 梅樹花期預測多采用形態(tài)測量法以及建立地區(qū)預報模型法等[5]。

植物表型性狀的形成是基因與環(huán)境共同作用的結果，但表型性狀具有滯后性，針對外界條件的改變，基因表達的響應早于表型性狀，因而，在基因水平上及早判斷，可提升對植物真實生長狀態(tài)的預見性和采取措施的目的性[6-7]。 植物從營養(yǎng)生長向生殖生長的轉變受基因調控，通過基因啟動花發(fā)育和開花過程[8]；基因表達信息可以精確反映植物的生長發(fā)育以及營養(yǎng)代謝狀態(tài)[9]。 梅樹成花基因pm-FD、pm-AP2和pm-LFY是梅樹花發(fā)育的關鍵基因；其看家基因S3a、homol、hsc、somX2、FRIGIDA-like和Subunit37e是葡萄(VitisviniferaLinn.)花發(fā)育期表達量波動相對較大的看家基因，通過NCBI(https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)比對獲得[10]。 梅樹花芽中成花基因和看家基因的表達狀況基本可以反映其花芽的發(fā)育情況?；诖耍赏ㄟ^檢測梅樹開花基因的表達狀況預測其花期。

為了驗證利用基因表達狀況預測梅樹花期的可行性，作者以不同花期的6 個梅樹品種為研究對象，觀察花芽發(fā)育過程中其外部形態(tài)和縱剖面結構的變化，同時采用RT-qPCR 技術分析了花芽中3 個成花基因和6 個看家基因的相對表達量變化，探討成花基因和看家基因相對表達量與開花日期的關系，以期為梅樹的花期預測和管理提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

供試6 個梅樹品種均栽植于南京市紫金山南麓的梅花山景區(qū)。 該景區(qū)面積約102.2 hm2；氣候類型屬亞熱帶季風氣候，年均降水量1 106.5 mm，空氣相對濕度76%，無霜期237 d；土壤類型為壤土。

供試6 個梅樹品種為‘粉紅朱砂’(‘Fenhong Zhusha’)、‘淡妝宮粉’(‘Danzhuang Gongfen’)、‘淡粉’(‘Dan Fen’)、‘寒紅’(‘Han Hong’)、‘南京紅’(‘Nanjing Hong’)和‘晚跳枝’(‘Wantiao Zhi’)，其中，‘粉紅朱砂’和‘淡妝宮粉’為早花品種，‘淡粉’和‘寒紅’為中花品種，‘南京紅’和‘晚跳枝’為晚花品種。 每個品種選取株齡20 ～30 a 的樣樹5 株，共30 株樣樹，分別進行掛牌編號。

1.2 方法

1.2.1 采樣時間和采樣方法 從2017 年11 月20日開始采樣，至2018 年1 月19 日(花芽萌動期)結束，每4 d 取樣1 次，共取樣16 次，取樣日期分別為2017 年的11 月20 日、11 月24 日、11 月28 日、12 月2 日、12 月6 日、12 月10 日、12 月14 日、12 月18 日、12 月22 日、12 月26 日和12 月30 日，2018 年的1 月3 日、1 月7 日、1 月11 日、1 月15 日和1 月19 日。

分別在各樣樹的南向選擇10 根1 年生枝條，在上、中、下節(jié)位隨機采集花芽，每個品種采集30 枚，用于花芽縱徑和橫徑的測量；其中10 枚花芽用于外部形態(tài)和縱剖面結構觀察，其余20 枚花芽在液氮中冷凍，-80 ℃保存，用于RNA 提取。

1.2.2 花芽形態(tài)觀察和測定 用游標卡尺(精度0.01 mm，北京新諾立華儀器有限公司)分別測量花芽縱徑和橫徑，結果取平均值。

取5 枚完整花芽，用DM1000 Leica 體式顯微鏡(德國Leica 公司)觀察花芽的外部形態(tài)，并拍照；另取5 枚花芽，用解剖刀縱向剖開，同法觀察花芽的縱剖面結構，并拍照。

1.2.3 開花情況調查和統(tǒng)計 于2018 年1 月4 日至1 月24 日，即從花芽出現小面積鱗片開裂至花芽鱗片完全開裂，對各品種的花芽鱗片開裂和開花情況進行調查，每4 d 調查1 次，共調查6 次，調查日期分別為2018 年的1 月4 日、1 月8 日、1 月12 日、1 月16 日、1 月20 日和1 月24 日。

分別在各樣株的南向選擇10 根1 年生枝條，定株、定時觀測和記錄枝條上的花芽鱗片開裂總數和花芽總數，同時觀測并記錄開花數。 按照公式“花芽鱗片開裂率=(花芽鱗片開裂總數/花芽總數)×100%”計算花芽鱗片開裂率；以“花蕾露瓣50%以上且有少許花朵開放”為標準確定可觀賞期(花期)[11]。

1.2.4 總RNA 提取及RT-qPCR 反應 將花芽于液氮中研磨，稱取80 μg，采用改良的CTAB 法[12]分別提取總RNA；以總RNA 為模板，并參考PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)反轉錄試劑盒〔寶生物工程(大連)有限公司〕說明書合成cDNA。

表1 用于梅樹花芽中成花基因和看家基因RT-qPCR 反應的引物序列Table 1 Primer sequences used for RT-qPCR reaction of flowering and house-keeping genes in flower bud of Prunus mume Sieb. et Zucc.

以cDNA 為 模 板， 用 Primer3 Input (version 0.4.0)軟件分別設計成花基因pm-FD、pm-AP2和pm-LFY以 及 看 家 基 因S3a、homol、hsc、somX2、FRIGIDA-like和Subunit37e的正向引物和反向引物(表1)，并由南京金斯瑞生物科技股份有限公司合成引物。 以梅樹花芽蛋白延伸因子EF-1a為內參基因進行RT-qPCR 反應，擴增體系及程序根據SYBR?PremixExTaqTMⅡ試劑盒〔寶生物工程(大連)有限公司〕說明書完成。 PCR 反應體系包括SYBR?Premix ExTaqTMⅡ 10.0 μL、cDNA 1.0 μL、10.0 mol·L-1正向引物和反向引物各0.4 μL，雙蒸水補足至20.0 μL。反應程序為：95 ℃預變性60 s；95 ℃變性5 s、60 ℃退火15 s、72 ℃延伸20 s，40 個循環(huán)；最后于72 ℃延伸10 min。 每個樣品3 次重復，采用2-ΔΔCt計算各基因的相對表達量[13]。

1.3 數據統(tǒng)計和分析

采用EXCEL 2007 和Origin 2017 軟件對數據進行統(tǒng)計和分析。

2 結果和分析

2.1 不同梅樹品種花芽生長發(fā)育的動態(tài)變化

不同時期，供試6 個梅樹品種花芽縱徑和橫徑的變化見圖1，花芽外部形態(tài)和縱剖面結構的變化分別見圖2 和圖3。

由圖1 可見：在整個花芽發(fā)育過程中，供試6 個梅樹品種花芽的縱徑和橫徑總體呈增大趨勢；其中，2017 年11 月20 日至12 月6 日期間花芽的縱徑和橫徑增長速率較快。 總體上看，供試6 個品種中，早花品種的花芽生長速率最快，而晚花品種的花芽生長速率較慢。

由圖2 和圖3 可見：品種‘粉紅朱砂’和‘淡妝宮粉’花芽鱗片開裂時間為2017 年12 月22 日，之后，品種‘粉紅朱砂’花芽鱗片開裂程度明顯大于品種‘淡妝宮粉’；品種‘淡粉’花芽鱗片開裂時間為2017年12 月26 日，品種‘南京紅’花芽鱗片開裂時間為2018 年1 月7 日，而品種‘寒紅’和‘晚跳枝’花芽的鱗片開裂時間均為2018 年1 月15 日。 總體上看，早花品種花芽鱗片開裂時間最早。

圖1 供試6 個梅樹品種花芽縱徑和橫徑的變化Fig. 1 Changes in vertical and horizontal diameters of flower bud of six cultivars of Prunus mume Sieb. et Zucc. tested

圖2 供試6 個梅樹品種花芽外部形態(tài)的變化Fig. 2 Changes in external morphology of flower bud of six cultivars of Prunus mume Sieb. et Zucc. tested

圖3 供試6 個梅樹品種花芽縱剖面結構的變化Fig. 3 Changes in structure of longitudinal section of flower bud of six cultivars of Prunus mume Sieb. et Zucc. tested

2.2 不同梅樹品種開花指標分析

供試6 個梅樹品種花芽鱗片開裂率的變化見圖4。 結果顯示：品種‘粉紅朱砂’花芽鱗片開裂率最大，在2018 年1 月16 日即超過50%，此時單株開花數量達到85；之后1 月20 日和1 月24 日花芽鱗片開裂率增長速率較快，分別達到58%和65%，單株開花數量也分別增加至175 和205，表明該品種在2018 年1 月16 日進入花期。 其余5 個品種的花芽鱗片開裂率均明顯小于品種‘粉紅朱砂’，且在2018 年1 月16日至1 月24 日的20 d 內花芽鱗片開裂率均未超過50%，單株開花數量也均在10 以下，說明這5 個品種的花期均晚于品種‘粉紅朱砂’，且均在1 月24 日以后進入花期。

通過比較分析可見：在供試6 個梅樹品種中，早花品種花芽鱗片開裂率總體上最高，而晚花品種花芽鱗片開裂率總體上最低，表明梅樹花芽鱗片開裂率與該品種的花期早晚特性相對應。

圖4 供試6 個梅樹品種花芽鱗片開裂率的變化Fig. 4 Changes in scale cracking ratio of flower bud of six cultivars of Prunus mume Sieb. et Zucc. tested

2.3 不同梅樹品種花芽中成花基因和看家基因的表達差異

2.3.1 成花基因的表達差異 在花芽發(fā)育過程中供試6 個梅樹品種花芽中成花基因的相對表達量變化見表2。 結果顯示：在不同梅樹品種的花芽發(fā)育過程中，3 個成花基因的相對表達量呈現不同的變化趨勢。

由表2 可見：從基因的表達過程看，pm-FD基因在品種‘粉紅朱砂’和‘淡妝宮粉’花芽發(fā)育的多數時期均沒有表達(相對表達量為0.000)，但在中花和晚花品種的花芽發(fā)育過程中均不同程度表達，僅相對表達量存在差異；pm-AP2基因在6 個品種的花芽發(fā)育過程中均間斷表達，特別是在品種‘淡粉’、‘南京紅’和‘晚跳枝’花芽發(fā)育的多數時期均沒有表達；而pm-LFY基因在6 個品種的花芽發(fā)育過程中均持續(xù)表達，但相對表達量存在較大差異。

表2 供試6 個梅樹品種花芽中成花基因的相對表達量變化Table 2 Changes in relative expression level of flowering gene in flower bud of six cultivars of Prunus mume Sieb. et Zucc. tested

從相對表達量看，pm-FD基因在品種‘粉紅朱砂’、‘淡妝宮粉’、‘淡粉’、‘寒紅’、‘南京紅’和‘晚跳枝’花芽中的最高表達日期分別為2017 年的11 月24 日、12 月6 日、12 月14 日、12 月14、12 月18 日和12 月22 日；pm-AP2基因在上述6 個品種花芽中的最高表達日期分別為2017 年的11 月28 日、12 月14日、12 月22 日、12 月18 日、12 月26 日和12 月26日；pm-LFY基因在上述6 個品種花芽中的最高表達日期分別為2017 年的11 月20 日、12 月10 日、11 月24 日、12 月10 日、12 月26 日和12 月26 日。 除早花品種‘粉紅朱砂’外，其余5 個品種的pm-FD、pm-AP2和pm-LFY基因的最高表達日期多出現在12 月中下旬。 總體上看，3 個成花基因最高表達日期與其花期的早晚基本對應。

續(xù)表2 Table 2 (Continued)

2.3.2 看家基因的表達差異 在花芽發(fā)育過程中供試6 個梅樹品種花芽中看家基因的相對表達量變化見表3。 結果顯示：在不同梅樹品種的花芽發(fā)育過程中，與成花基因類似，6 個看家基因的相對表達量也呈現不同的變化趨勢。

表3 供試6 個梅樹品種花芽中看家基因的相對表達量變化Table 3 Changes in relative expression level of house-keeping gene in flower bud of six cultivars of Prunus mume Sieb. et Zucc. tested

由表3 可見：從基因的表達過程看，S3a基因在品種‘粉紅朱砂’、‘南京紅’和‘晚跳枝’的花芽發(fā)育過程中均持續(xù)表達，而在其余3 個品種的花芽發(fā)育過程中則間斷表達；homol基因在6 個品種的花芽發(fā)育過程中均間斷表達，特別是在品種‘晚跳枝’花芽發(fā)育的多數時期均沒有表達；hsc基因在品種‘粉紅朱砂’、‘寒紅’和‘晚跳枝’的花芽發(fā)育過程中均持續(xù)表達，但在其余3 個品種的花芽發(fā)育過程中均間斷表達，特別是在品種‘淡妝宮粉’花芽發(fā)育的多數時期均無表達；somX2基因在品種 ‘寒紅’和‘晚跳枝’的花芽發(fā)育過程中均持續(xù)表達，但在其余4 個品種的發(fā)芽發(fā)育過程中均間斷表達，特別是在品種‘淡妝宮粉’花芽發(fā)育的多數時期均無表達；FRIGIDA-like基因在中花和晚花品種的花芽發(fā)育過程中總體上均持續(xù)表達，但在早花品種的發(fā)芽發(fā)育過程中間斷表達，特別是在品種‘淡妝宮粉’花芽發(fā)育的多數時期均無表達；Subunit37e基因在6 個品種的花芽發(fā)育過程中基本上均持續(xù)表達，但相對表達量均在一定差異。 總體上看，除homol基因外，其余5 個看家基因在品種‘晚跳枝’的花芽發(fā)育過程中均可持續(xù)表達，且相對表達量也較高。

續(xù)表3 Table 3 (Continued)

從相對表達量看，S3a基因在品種‘粉紅朱砂’、‘淡妝宮粉’、‘淡粉’、‘寒紅’、‘南京紅’和‘晚跳枝’花芽中的最高表達日期分別為2017 年的11 月24日、12 月6 日、12 月26 日、12 月18 日、12 月6 日和2018 年1 月7 日；homol基因在上述6 個品種花芽中的最高表達日期分別為2017 年的11 月24 日、12 月6 日、12 月14 日、12 月14 日、12 月18 日和12 月26日；hsc基因在上述6 個品種花芽中的最高表達日期分別為2017 年12 月2 日、2018 年1 月19 日、2017年的11 月28 日和12 月10 日以及2018 年的1 月19日和1 月7 日；somX2基因在上述6 個品種花芽中的最高表達日期分別為2017 年的11 月24 日、12 月6日、12 月22 日、12 月14 日、12 月22 日和12 月18日；FRIGIDA-like基因在上述6 個品種花芽中的最高表達日期分別為2017 年的12 月18 日、12 月6 日、12月22 日、12 月14 日、12 月22 日和12 月10 日；Subunit37e基因在上述6 個品種花芽中的最高表達日期分別為2017 年12 月30 日和2018 年1 月19 日以及2017 年的12 月22 日、12 月14 日、12 月6 日和12月6 日。

2.4 不同梅樹品種花期與花芽中成花基因和看家基因表達量的關系

從供試6 個梅樹品種花芽中成花基因和看家基因的最高表達日期到各品種開花日期的間隔天數見表4。

結果顯示：各品種花芽中成花基因和看家基因的最高表達日期及開花日期均存在差異，導致間隔天數差異明顯。 其中，間隔天數最短的是品種‘粉紅朱砂’的看家基因Subunit37e，僅17 d；間隔天數最長的是品種‘晚跳枝’的看家基因Subunit37e，達到88 d。早花品種的成花基因和看家基因最高表達日期與開花日期的間隔天數平均值分別為58 和51 d，中花品種的平均值分別為69 和65 d，晚花品種的平均值分別為68 和70 d。 從成花基因最高表達日期與開花日期的間隔天數看，早花品種短于中花和晚花品種，但中花和晚花品種間差異不大；而從看家基因最高表達日期與開花日期的間隔天數看，早花和中花品種間差異不大，但均明顯短于晚花品種。

表4 供試6 個梅樹品種花芽中成花基因和看家基因的最高表達日期到開花日期的間隔天數Table 4 Interval days from date of the highest expression level to flowering date of flowering and house-keeping genes in flower bud of six cultivars of Prunus mume Sieb. et Zucc. tested

3 討論和結論

在梅樹的花發(fā)育過程中，pm-FD基因與pm-FT基因相互作用，促進花的轉變以及誘導花的發(fā)育[14]；pm-AP2基因則對萼片和花瓣的發(fā)育有控制作用[15]；pm-LFY基因是成花過程中最早表達的花分生組織特異性基因，其影響效應幾乎貫穿花序和花發(fā)育的整個過程，在維持花分生組織的正常功能、啟動花器官基因的活化以及防止花分生組織逆轉等方面具有重要作用[16]。 在供試6 個梅樹品種的花芽發(fā)育過程中，pm-LFY基因在各品種的花芽發(fā)育過程中均持續(xù)表達，僅相對表達量存在一定差異，佐證了該基因對梅樹花芽發(fā)育的全過程均有控制作用；而pm-AP2基因在6 個品種的花芽發(fā)育過程中均間斷表達，說明pm-AP2基因僅對梅樹花芽發(fā)育的部分過程(花萼和花瓣的發(fā)育)有控制作用。 此外，早花品種(‘粉紅朱砂’和‘淡妝宮粉’)的pm-FD、pm-AP2和pm-LFY基因的最高表達日期總體上早于中花品種(‘淡粉’和‘寒紅’)和晚花品種(‘南京紅’和‘晚跳枝’)，而晚花品種的pm-FD、pm-AP2和pm-LFY基因的最高表達日期最晚，顯示梅樹花芽中pm-FD、pm-AP2和pm-LFY基因的表達規(guī)律與其花期早晚基本對應。值得注意的是，成花基因pm-FD在早花品種花芽發(fā)育的多數時期均沒有活躍表達，但在中花和晚花品種的花芽發(fā)育過程中均持續(xù)表達，其原因有待進一步的研究和探索。

張積森等[17]和王瑛等[18]的研究結果表明：看家基因是在所有類型細胞中都能表達的一類基因，其產物對維持細胞的基本結構和各種代謝活動是必需的；相較于成花基因，看家基因在植物生長發(fā)育過程中的表達更穩(wěn)定。 本研究選擇的6 個看家基因S3a、homol、hsc、somX2、FRIGIDA-like和Subunit37e在梅樹的花芽生長發(fā)育過程中多次出現高表達，其中，有些看家基因與成花基因的最高表達日期相近，如品種‘粉紅朱砂’、‘淡妝宮粉’、‘淡粉’、‘寒紅’和‘南京紅’的看家基因homol與其成花基因pm-FD的最高表達日期一致，因此，研究此類看家基因的最高表達日期與開花日期的間隔規(guī)律，有助于梅樹花期的預測。 此外，在不同品種梅樹花芽發(fā)育過程中，各看家基因的表達規(guī)律及相對表達量存在明顯差異，例如：在6 個品種的花芽發(fā)育過程中，homol基因均間斷表達，而Subunit37e基因基本上持續(xù)表達，FRIGIDA-like基因則在中花和晚花品種的花芽中基本上持續(xù)表達，但在早花品種中卻間斷表達，表明在不同品種的花芽發(fā)育過程中，有些看家基因的影響效應貫穿于花芽發(fā)育的全過程，而有些看家基因的影響效應則在品種間存在差異或與花期特性相關，但這些看家基因在梅樹花芽發(fā)育過程中的作用靶點以及與開花日期的相關性還需進一步研究。 此外，除homol基因外，其余5個看家基因在品種‘晚跳枝’的花芽發(fā)育過程中均可持續(xù)表達，且相對表達量也較高，說明這些看家基因對品種‘晚跳枝’花芽發(fā)育的作用較為穩(wěn)定，但這些看家基因在梅樹晚花品種的花芽發(fā)育過程中是否有相似的作用規(guī)律及其對花期的具體推遲作用，均有待深入研究。

根據花芽縱徑和橫徑的變化規(guī)律、花芽外部形態(tài)的變化以及花芽鱗片開裂率，確定品種‘粉紅朱砂’、‘淡妝宮粉’、‘淡粉’、‘寒紅’、‘南京紅’和‘晚跳枝’的開花日期分別為2018 年的1 月16 日、2 月11 日、2 月15 日、2 月23 日、2 月28 日和3 月4 日，各品種的開花日期與其花期特性相對應。 而從各基因的最高表達日期看，早花品種的成花基因pm-FD和pm-AP2以及看家基因S3a、homol和somX2均最早進入最高表達日期，而且，早花品種的成花基因和看家基因的最高表達日期距開花日期最近；說明早花品種的“早開花”特性與其花芽發(fā)育過程中成花基因和看家基因的快速啟動有關。 因此，對梅樹花芽發(fā)育過程中成花基因和部分看家基因的表達規(guī)律進行分析，對于梅樹花期的預測有一定的參考意義。

由于本研究并未進行不同年份間的重復觀察和研究，且涉及的梅樹品種較少，研究結果具有一定的局限性。 而植物的花期除受遺傳和生理代謝等內因控制外，還受到氣溫、水分、光照以及栽培管理措施等多種外因的影響，因而，對不同梅樹品種花期與基因表達的相關性還有待深入研究。

致謝：中山陵園管理局孫琴園林高級工程師和李長偉園林工程師等對梅樹花期觀察提供了幫助，在此表示感謝!