朱麗莎，張靜，張耀海，焦必寧*

1(西南大學 柑桔研究所，重慶，400712)2(農業(yè)部柑桔及苗木質量監(jiān)督檢測測試中心，重慶，400712)

柑橘果實富含酚類物質，主要以類黃酮和酚酸為主，具有廣泛的生物活性，包括抗動脈粥樣硬化[1-2]、抗炎和抗腫瘤活性[3]、抑制血液凝塊和較強的抗氧化性[4-6]。甜橙類是世界栽培最廣泛的柑橘種類，分為普通甜橙、臍橙、血橙等[7]，具有非常高的營養(yǎng)價值[8]。目前，對甜橙類品種類黃酮和酚酸含量差異研究主要集中于橙汁中：CLAUDIO等發(fā)現(xiàn)橙汁中主要含有橙皮苷和柚皮苷[9]；GATTUSO等對不同柑橘品種果汁中類黃酮進行了研究，其主要成分是黃烷酮-O-糖苷和黃酮-O-或-C-糖苷[10]。然而，對不同品種橙類及其不同部位(果皮、果肉和果汁)中酚類物質的系統(tǒng)研究報道較少。該研究以我國25個主要甜橙類品種為試材，采用超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatography，UPLC)法，檢測了不同甜橙類品種果皮、果肉、果汁中酚類物質的種類和含量，比較其差異性，探討甜橙類生物活性成分與品種之間的相互關系，旨在充實甜橙類功能成分數(shù)據(jù)庫，同時為甜橙類品種鑒定及分類、育種、產(chǎn)地溯源、質量控制和功能性成分的開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑和材料

1.1.1 儀器

Waters ACQUITY UPLC色譜儀(2996 PDA檢測器，version 4.1 Empour工作站)，美國Waters公司，配Waters ACQUITY UPLC BEH C18分析柱(2.1 mm×100 mm, 1.7 μm)；Milli-Q Advantage A10超純水器，美國Millpore公司； PB3002-S/FACT分析天平(感量0.01 g)，瑞士梅特勒-托利多公司；0.22 μm有機相針式濾器，上海安譜科學儀器有限公司；3K15高速冷凍離心機，美國Sigma-Aldrich公司。

1.1.2 試劑

橙皮苷(純度98.0%)、柚皮苷(純度99.0%)， 德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；柚皮素、橙皮素、枸橘苷、野漆樹苷、新橙皮苷、蕓香柚皮苷、圣草枸櫞苷、香風草苷、橘皮素、甜橙黃酮、川皮苷，美國Chroma Dex公司，純度均為95%以上。咖啡酸(純度99.8%)，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；p-香豆酸、芥子酸和阿魏酸，美國Chroma Dex公司，純度均為95%以上；對羥基苯甲酸，上海源葉生物科技有限公司，純度為97%以上；原兒茶酸，中國食品藥品檢定研究院，純度為95%以上；香草酸(純度98.0%)，中國藥品生物研制檢定所。甲醇、二甲基亞砜、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯，德國CNW Technologies有限公司，均為色譜純；丙酮、乙酸和甲酸，重慶川東化工(集團)有限公司，均為色譜純；NaOH和HCl，國藥集團化學試劑有限公司，均為分析純。

試驗材料：甜橙25個樣品于2018年1月10日在中國農業(yè)科學院柑桔研究所國家果樹種質資源(重慶)柑桔圃(National Citrus Germplasm in Chongqing，Citrus Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences)采集。試驗在中國農業(yè)科學院柑桔研究所農業(yè)部柑桔產(chǎn)品質量安全風險評估實驗室(重慶)進行。所有甜橙類的拉丁名均為Citrus sinensis (L.) Osbeck。其中，編號1～16為普通甜橙樣本，編號17～22 為臍橙樣本，編號23～25為血橙樣本。

1.2 實驗方法

1.2.1 類黃酮的色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18分析柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流動相：0.2%(體積分數(shù))乙酸水溶液(A)和甲醇(B)，梯度洗脫；流速：0.30 mL/min，柱溫：35 ℃；進樣量為3.0 μL；波長掃描200～400 nm，定量波長為283 nm和330 nm。283 nm(橙皮苷、柚皮苷、蕓香柚皮苷、柚皮素、橙皮素、圣草枸櫞苷、枸橘苷、新橙皮苷、香風草苷、野漆樹苷)，330 nm(甜橙黃酮、川皮苷、橘皮素)。根據(jù)保留時間和紫外可見光譜定性，外標法定量。

1.2.2 酚酸的色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18分析柱(2.1 mm ×100 mm, 1.7 μm)；流動相：3.0%(體積分數(shù))甲酸水溶液(A)和甲醇溶液(B)，梯度洗脫；流速：0.30 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量為3.0 μL；波長掃描210～400 nm；定量波長為320 nm和260 nm。320 nm (咖啡酸、p-香豆酸、芥子酸和阿魏酸)；260 nm(原兒茶酸、對羥基苯甲酸和香草酸)，外標法定量。

1.2.3 標準溶液的配制

參照相關文獻[11]，準確稱取13種類黃酮標準物質各10 mg于10 mL容量瓶中，分別用甲醇溶解并定容至刻度，配制成1 000 mg/L的標準品母液。以上標準品母液均存放于棕色瓶中，-80 ℃保存?zhèn)溆?。準確稱取7種酚酸標準物質各10 mg于10 mL容量瓶中，分別用甲醇溶解并定容至刻度，配制成1 000 mg/L的標準品母液。以上標準品母液均存放于棕色瓶中，-80 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

類黃酮的上機標準溶液用甲醇稀釋，酚酸的上機標準溶液用50%甲醇水(體積分數(shù))溶液稀釋。

1.2.4 樣品前處理

參照GB/T 8210—2011，取混合樣品果10～20個，用干凈紗布輕輕擦去甜橙樣品表面附著物，采用對角線分割法，取對角部分，將果皮和果肉分開，甜橙的果肉保留囊衣，剔除種子。將其切碎、混勻，放入食品加工器中徹底粉碎，制成待測樣，放入分裝容器中備用。用榨汁器榨出果汁，經(jīng)兩層干凈紗布過濾盛于燒杯中，將榨汁后的囊瓣從果皮扯下，取出種籽，然后放于潔凈紗布中，再將果汁全部壓出，合并于燒杯中。

類黃酮的前處理：稱取樣品5 g于離心管中，加入10 mL甲醇和二甲基亞砜(V(甲醇)∶V(二甲基亞砜)=1∶1)，超聲提取30 min，10 000 r/min離心10 min， 收集上清液，再重復上述操作1次(果肉和果汁)或2次(果皮)，合并提取的上清液，甲醇定容至25 mL(果肉和果汁)或50 mL(果皮)，經(jīng)0.22 μm微孔有機濾膜過濾后上機檢測。

酚酸前處理：稱取樣品5 g于離心管中，加入10 mL NaOH溶液(4 mol/L)，渦旋或振蕩反應2 h；調節(jié)pH至2.0(6 mol/L鹽酸)，10 000 r/min離心10 min(調酸時，有明顯的顏色變化)；取上清液，用乙酸乙酯和甲基叔丁基醚(V(乙酸乙酯)∶V(甲基叔丁基醚)=1∶1)萃取2～3次；合并萃取液，氮吹濃縮至干，用50%甲醇(體積分數(shù))定容至5 mL，經(jīng)0.22 μm微孔有機濾膜過濾后上機檢測。

1.3 數(shù)據(jù)分析

Excel 2016統(tǒng)計分析所有數(shù)據(jù)，計算標準誤差并制圖；應用Origin 9.1進行制圖；應用SAS V8軟件進行方差分析(ANOVA)，利用鄧肯式多重比較對差異顯著性進行分析(P<0.05)。所有樣品均為3次平行，測定結果以平均值±標準差(mean±SD表示)。

2 結果與分析

2.1 標準和樣品色譜圖

圖1為13種類黃酮標準品色譜圖，可以看出目標物在12 min內均完全分離，各種物質分離度高，相鄰兩物質間分離度R均大于1.5，峰型好。表明該方法適合于甜橙類果皮、果肉、果汁中類黃酮分離檢測。目標物在0.005～50 mg/L，線性關系良好，相關系數(shù)r>0.999 8，測定精密度、重復性、穩(wěn)定性和回收率良好，RSD值<3%。

圖2為7種酚酸標準品色譜圖，可以看出目標物在8 min內均完全分離，各種物質分離度高，相鄰兩物質間分離度R均大于1.5，峰型好。表明該方法適合于甜橙類果皮、果肉、果汁中酚酸的分離檢測。目標物在0.01～50 mg/L，線性關系良好，相關系數(shù)r>0.999 5，精密度、重復性、穩(wěn)定性、回收率和相對偏差良好，RSD值<3%。

2.2 甜橙類類黃酮含量和種類比較

甜橙是柑橘類的主要品種，全球甜橙總產(chǎn)量占柑橘總量的63%[12]。類黃酮化合物是一類分布十分廣泛的植物次生代謝產(chǎn)物，是一類具有重要藥理活性的天然產(chǎn)物[13]。本實驗分析了25個甜橙類樣本(16

1-圣草枸櫞苷；2-蕓香柚皮苷；3-柚皮苷；4-橙皮苷；5-新橙皮苷；6-野漆樹苷；7-香風草苷；8-枸橘苷；9-柚皮素；10-橙皮素；11-甜橙黃酮；12-川皮苷；13-橘皮素; A-標準品283 nm色譜圖；B-標準品330 nm色譜圖圖1 13種類黃酮標準品在283 nm和330 nm的超高效液相色譜圖Fig.1 UPLC chromatograms of 13 flavonoids for standards at 283 nm and 330 nm

1-原兒茶酸；2-對羥基苯甲酸；3-咖啡酸；4-香草酸；5-對香豆酸；6-阿魏酸；7-芥子酸A-標準品260 nm色譜圖;B-標準品320 nm色譜圖圖2 7種酚酸標準品在260 nm和320 nm的超高效液相色譜圖Fig.2 UPLC chromatograms of 7phenolic acid for standards at 260 nm and 320 nm

個普通甜橙樣本、6個臍橙樣本、3個血橙樣本)中13種類黃酮的含量，甜橙類果皮和果肉類黃酮含量豐富[14]。甜橙類黃酮主要包括黃烷酮類和多甲氧基黃酮類，黃烷酮類包括圣草枸櫞苷、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、野漆樹苷、香風草苷、枸櫞苷、柚皮素和橙皮素，多甲氧基黃酮類包括甜橙黃酮、川皮苷和橘皮素。

2.2.1 甜橙類果皮中類黃酮含量和種類比較

表1結果表明，果皮類黃酮平均含量達6 193.92 mg/kg FW，約為果肉含量的3倍，果汁含量的18倍。在普通甜橙、臍橙、血橙三大類型中，類黃酮含量有一定差異，臍橙果皮類黃酮含量最為豐富，達到6 376.44 mg/kg FW。臍橙中，斯卡吉斯·朋娜臍橙(意大利)(編號18)果皮類黃酮含量最高，達到7 238.47 mg/kg FW；普通甜橙中，紅肉暗柳橙(編號14)含量最多，達到7 338.06 mg/kg FW，約為雪柑(編號5)含量的1.68倍；血橙果皮類黃酮含量最低，平均值6 057.68 mg/kg FW。

在這25種甜橙類果皮中，黃烷酮類為甜橙中主要類黃酮，含量變幅為4 206.49～7 048.34 mg/kg FW，占13種類黃酮的93.79%～98.84%；甜橙類果皮中黃烷酮以橙皮苷含量最為豐富，平均含量可達4 922.38 mg/kg FW，在9種黃烷酮中的比例高達79.47%；蕓香柚皮苷次之，平均含量為637.52 mg/kg FW，占9種黃烷酮總含量的10.29%；香風草苷含量相對較低，平均含量僅為371.77 mg/kg FW，僅占9種黃烷酮總含量的6.00%。多甲氧基黃酮平均含量為262.25 mg/kg FW，僅占13種類黃酮總含量的1.16%～6.21%，多甲氧基黃酮以川皮苷為主，平均含量154.39 mg/kg FW，在3種多甲氧基黃酮中的比例為57.13%。

另外，盡管清家臍橙(日-81-1)(編號21)果皮中多甲氧基黃酮類含量極低，但其黃烷酮類占比最高，達到98.84%，高于其他品種。因此，清家臍橙(日-81-1)(編號21)可能是類黃酮黃烷酮類的良好來源。

2.2.2 甜橙類果肉中類黃酮含量和種類比較

如表2所示，甜橙類果肉中類黃酮種類與果皮相近，果肉中平均含量為2 025.57 mg/kg FW，在普通甜橙、臍橙、血橙三大類型中，類黃酮含量有一定差異，臍橙果皮類黃酮含量最為豐富，達到2 076.24 mg/kg FW。

臍橙中，清家臍橙(日-81-1)(編號21)含量高達2 946.71 mg/kg FW，是摩洛血橙(編號25)類黃酮含量的2.18倍。

結果表明，與果皮一致，黃烷酮類為甜橙果肉主要類黃酮。果肉黃烷酮以橙皮苷為主，其次為蕓香柚皮苷，香風草苷含量較蕓香柚皮苷和橙皮苷含量低。多甲氧基黃酮類檢出率極低，甜橙黃酮、川皮苷、橘皮素果肉含量平均值分別為0.50、0.82、0.14 mg/kg FW；改良橙(編號4)、雪柑(編號5)、香水橙(廣西)(編號8)、奧林達夏橙(美國)(編號12)、甜皮甜橙(編號16)、紐荷爾臍橙(編號17)、奉節(jié)72-1臍橙(編號22)、塔羅科血橙(編號23)、臍血橙(編號24)均未檢出橘皮素。

表1 不同品種甜橙類果皮中類黃酮含量 單位：mg/kg鮮重

注：不同小寫字母表示不同處理在0.05水平差異顯著。下同。

表2 不同品種甜橙類果肉中類黃酮含量 單位：mg/kg鮮重

續(xù)表2

分類名稱蕓香柚皮苷橙皮苷香風草苷甜橙黃酮川皮苷橘皮素總含量臍橙17.紐荷爾臍橙288.15±90.37hgkij1 014.84±292.25lk112.45±33.54ijh0.19±0.05ij0.18±0.05mND1 415.8118.斯卡吉斯·朋娜臍橙(意大利)528.10±61.91a1 581.40±152.86feg186.99±20.01bac0.33±0.02ighf0.47±0.02jk0.08e2 297.3719.華盛頓臍橙(丙區(qū))328.26±15.63hgfei991.38±36.14l108.63±4.75ij0.21±0.13ihj0.40lk0.10dce1 428.9820.早熟臍橙454.27±17.54b1 866.58±55.96cbd195.77±6.18ba0.53±0.04ed0.86±0.04ed0.14±0.01c2 518.1521.清家臍橙(日-81-1)265.43±6.96lkij2 496.01±35.58a184.88±5.42bac0.17±0.04j0.19±0.01m0.03±0.04f2 946.7122.奉節(jié)72-1臍橙419.54±3.65cbd1 281.48±15.25hjki148.61±0.01edf0.24±0.11ihj0.49±0.18jkND1 850.36臍橙各類黃酮含量平均值380.631 538.62156.220.280.430.062 076.24血橙23.塔羅科血橙(新系)193.82±11.16l1 778.06±96.94cebd92.29±6.23jk0.57d0.85±0.08edND2 065.5924.臍血橙257.63±26.19lkij2 382.67±141.95a114.22±12.30ijhgND0.11nmND2 754.6325.摩洛血橙(新系NO.2)196.94±14.36l1 083.24±137.07lk73.39±7.70k0.35±0.02ghf0.56±0.05jih0.08±0.03e1 354.56血橙各類黃酮含量平均值216.131 747.9993.300.310.510.032 058.27甜橙類各類黃酮含量平均值320.971 563.24139.900.500.820.142 025.57

注：ND表示未檢出。下同。

值得一提的是，雖然清家臍橙(日-81-1)(編號21)中多甲氧基黃酮類含量極低，但其黃烷酮類(2 946.71 mg/kg FW)含量豐富，可作為蕓香柚皮苷和橙皮苷的良好資源。

2.2.3 甜橙類果汁中類黃酮含量和種類比較

如表3所示，甜橙類果汁中類黃酮種類與果皮、果肉相近，但果汁平均含量遠低于果皮、果肉，為345.16 mg/kg FW，在普通甜橙、臍橙、血橙三大類型中，類黃酮含量有一定差異，臍橙果汁類黃酮含量最為豐富，達到362.10 mg/kg FW。普通甜橙中的冰糖橙(編號3)果汁類黃酮含量最為豐富，高達619.91 mg/kg FW，是雪柑含量的2.78倍。

表3 不同品種甜橙類果汁中類黃酮含量 單位：mg/kg鮮重

續(xù)表3

分類名稱蕓香柚皮苷橙皮苷香風草苷甜橙黃酮川皮苷橘皮素總含量血橙23.塔羅科血橙(新系)20.35±0.07i264.51±2.91ghef8.67±0.19k0.05gifh0.09±0.01lkjND293.6724.臍血橙30.56±0.33ih347.09±1.97dc11.68±0.49kl0.02±0.01lk0.06±0.01lmND389.4125.摩洛血橙(新系NO.2)31.08±0.09ih189.36±1.99kl11.52±0.20kl0.12±0.01d0.25±0.02dND232.33血橙各類黃酮含量平均值27.33266.9910.620.060.13ND305.14甜橙類各類黃酮含量平均值53.22272.7718.840.100.190.04345.16

結果表明，與果皮、果肉一致，黃烷酮類為甜橙果汁主要類黃酮，平均含量為344.83 mg/kg FW。果汁黃烷酮以橙皮苷為主，其次為蕓香柚皮苷。多甲氧基黃酮類檢出率極低，其含量為0.08～1.50 mg/kg FW；一半以上甜橙類均未檢出橘皮素。

與類黃酮果皮、果肉含量不同的是，冰糖橙(編號3)果汁中，蕓香柚皮苷、橙皮苷含量最高，可作為甜橙類榨汁的良好資源。所有甜橙類果皮、果肉、果汁均未檢測出圣草枸櫞苷、柚皮苷、新橙皮苷、野漆樹苷、枸櫞苷、柚皮素、橙皮素。

2.3 甜橙類酚酸含量和種類比較

甜橙類含有豐富的酚酸類物質，因此，果皮可以作為藥物的良好來源[15-19]，如陳皮可以用于治療消化不良[16]。

2.3.1 甜橙類果皮酚酸含量和種類比較

本實驗測定了25個甜橙類品種(16個普通甜橙、6個臍橙、3個血橙)果皮中酚酸的含量，結果表明(表4)，7種目標酚酸在樣品中均被檢出，甜橙類果皮中酚酸平均含量為467.18 mg/kg FW，是甜橙類果肉酚酸含量的5.83倍，果汁含量的10.18倍。

表4 不同品種甜橙類果皮中酚酸含量 單位：mg/kg鮮重

普通甜橙、臍橙、血橙酚酸平均含量分別為463.82、458.68、502.11 mg/kg FW。血橙中臍血橙(編號24)含量最高，達640.60 mg/kg FW，含量最低的是改良橙(編號4)(294.82 mg/kg FW)。甜橙類中酚酸以肉桂酸型酚酸為主，平均含量為444.85 mg/kg FW，占總酚酸含量的的95.22%，肉桂酸型酚酸含量最高的是臍血橙，占總酚酸的95.83%；阿魏酸是主要的肉桂酸型酚酸，平均含量為300.74 mg/kg FW，在4種肉桂酸型酚酸中所占比例高達67.60%，對香豆酸、芥子酸次之，平均含量分別為99.96 mg/kg FW和31.47 mg/kg FW，分別占4種肉桂酸型酚酸總含量的22.47%和7.07%。臍血橙(編號24)果皮中阿魏酸含量最豐富(393.74 mg/kg FW)，含量是清家臍橙(日-81-1)(編號21)(175.58 mg/kg FW)的2.24倍；臍血橙中咖啡酸含量也顯著高于其他品種，因而，臍血橙(編號24)可以成為甜橙類果皮酚酸物質的良好來源。

2.3.2 甜橙類果肉酚酸含量和種類比較

由表5可知，與果皮相似，果肉樣品中7種目標酚酸均被檢出，平均含量為80.12 mg/kg FW。血橙類酚酸含量最高，達到87.63 mg/kg FW，其次為普通甜橙類(81.30 mg/kg FW)，含量最低的為臍橙類(73.21 mg/kg FW)。果肉酚酸類型與果皮中一致，均以肉桂酸型酚酸為主要，占總酚酸的94.30%，果肉中阿魏酸為主要酚酸，平均含量為50.29 mg/kg FW，在4種肉桂酸型酚酸中的比例高達66.56%；對香豆酸、芥子酸含量相近，平均含量分別為9.24 mg/kg FW和9.23 mg/kg FW，在4種肉桂酸型酚酸中所占比例分別是12.23%、12.22%；與果皮酚酸含量相類似，臍血橙果肉中的阿魏酸、對香豆酸含量最高，高達70.15 mg/kg FW和21.38 mg/kg FW。

2.3.3 甜橙類果汁酚酸含量和種類比較

由表6可知，果汁樣品中7種目標酚酸均被檢出，平均含量為45.87 mg/kg FW。

表5 不同品種甜橙類果肉中酚酸含量 單位：mg/kg鮮重

表6 不同品種甜橙類果汁中酚酸含量 單位：mg/kg鮮重

血橙類酚酸含量最高，達到47.77 mg/kg FW，其次為普通甜橙類(45.82 mg/kg FW)，含量最低的為臍橙類(45.08 mg/kg FW)。其中含量最豐富的是冰糖橙(編號3)果汁，高達62.77 mg/kg FW，含量是改良橙(編號4)果汁(26.63 mg/kg FW)的2.36倍。果汁酚酸類型與果皮、果肉中一致，均以肉桂酸型酚酸為主要，占總酚酸的94.86%，阿魏酸為主要酚酸，平均含量為30.50 mg/kg FW，在4種肉桂酸型酚酸中的比例高達70.10%；對香豆酸含量次之，平均含量為7.93 mg/kg FW；普通甜橙類果汁中的阿魏酸含量最高，高達31.96 mg/kg FW，而血橙類對香豆酸含量最高(13.24 mg/kg FW)，約為普通甜橙類、臍橙類對香豆酸的1.88、1.74倍。普通甜橙類、臍橙類、血橙類苯甲酸型酚酸含量有一定差異，血橙類含量最高，平均含量為2.62 mg/kg FW。

3 結論

甜橙類三大基本類型的果皮、果肉、果汁中，酚類物質含量豐富，不同類型間種類和含量差異不大。在所檢測的13種類黃酮中，以橙皮苷、蕓香柚皮苷、香風草苷為主。甜橙類類型檢測到的類黃酮總變量變化順序為：臍橙類>普通甜橙類>血橙類，果皮>果肉>果汁，橙皮苷>蕓香柚皮苷>香風草苷。在所檢測的7種酚酸物質中，以阿魏酸和對香豆酸為主。甜橙類類型檢測到的酚酸總變量變化順序為：血橙類>普通甜橙類>臍橙類，果皮>果肉>果汁，阿魏酸>對香豆酸≈芥子酸。甜橙類三種類型的不同代表中酚類物質具有相同的變化模式，果皮、果肉、果汁的酚類物質只存在豐度上的差異。清家臍橙(日-81-1)(編號21)類黃酮含量較豐富，臍血橙(編號24)酚酸物質含量較豐富，具有較高的利用價值。