王靜雅 楊琦 安蘇蘇 張仕勝 周亞軍

摘 要：為研究河蚌肉酶解制備復(fù)合調(diào)味料工藝，采用高壓脈沖電場(chǎng)輔助酶解，提高氨基態(tài)氮得率。以水解度為檢測(cè)指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)研究復(fù)合酶種類、溫度、反應(yīng)時(shí)間、pH值、酶類配比、酶添加量、液料比、脈沖數(shù)和電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)水解度的影響;在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化高壓脈沖電場(chǎng)輔助酶解河蚌肉工藝。結(jié)果表明：酶解河蚌肉的最佳條件為木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶質(zhì)量比1.71∶1、酶添加量1.6%、溫度50 ℃、反應(yīng)時(shí)間4.5 h、pH值6.74、電場(chǎng)強(qiáng)度18.85 kV/cm、液料比50（V/m）、脈沖數(shù)8，最終水解度為42.75%，水解度較對(duì)照組（36.23%）提高18.0%。

關(guān)鍵詞：河蚌肉;酶解;高壓脈沖電場(chǎng);響應(yīng)面優(yōu)化

中圖分類號(hào)：TS254.9? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2019）02-0025-07

Abstract： High-voltage pulsed electric field-assisted enzymatic hydrolysis was applied to the preparation of composite seasoning from freshwater mussel meat for improve yield of amino nitrogen. The effects of enzyme types and combinations， temperature， reaction time， pH value， enzyme dosage， solid-to-liquid ratio， pulse number and electric field intensity on the degree of hydrolysis were investigated by one-factor-at-a-time method. Subsequently， the selected variables were optimized by response surface methodology. Results showed that the optimum conditions were as follows： papain/flavourzyme ratio 1.71：1， enzyme dosage 1.6%， temperature 50 ℃， reaction time 4.5 h， pH 6.74， electric field strength 18.85 kV/cm， solid-to-liquid ratio 50 （V/m）， and pulse number 8. Under these conditions， the degree of hydrolysis was 42.75%， which was increased by 18.0% compared with 36.23% for the control group.

河蚌是一種貝殼類水生動(dòng)物，可產(chǎn)珍珠，是中國(guó)特有資源[1]，來源廣泛，價(jià)格低廉，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高。河蚌肉含有豐富的蛋白質(zhì)、糖類、維生素和礦物質(zhì)（銅、鋅），具有高蛋白質(zhì)、低脂肪的特點(diǎn)[2]，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值豐富[3]，且蚌肉的營(yíng)養(yǎng)成分易溶于汁液，易于被人體消化吸收[4]。王素雅等[5]測(cè)定河蚌的基本營(yíng)養(yǎng)成分，利用酶法制備河蚌功能性產(chǎn)品;郭福軍等[6]研究河蚌酶解液美拉德反應(yīng)前后風(fēng)味成分的變化;史萬忠等[7]研究河蚌多糖粗提物的分級(jí)醇沉及其活性;Almonacid等[8]對(duì)商業(yè)消毒蚌肉的工藝收率進(jìn)行研究;Silva等[9]研究蚌肉酶解的優(yōu)化條件。

本研究主要探究酶解河蚌肉制備調(diào)味料工藝，采用高壓脈沖電場(chǎng)（pulsed electric field，PEF）輔助酶解，提高氨基態(tài)氮得率，從而制備營(yíng)養(yǎng)、風(fēng)味俱全的復(fù)合調(diào)味料。PEF輔助酶解的主要原理為：物料細(xì)胞膜在電場(chǎng)作用下被擊穿，促使細(xì)胞內(nèi)容物滲出，提高酶與底物的接觸機(jī)會(huì)[10];適宜的電場(chǎng)強(qiáng)度能改變酶的結(jié)構(gòu)，從而使其活性中心暴露出來，酶活性升高[11];河蚌蛋白在適宜的電場(chǎng)強(qiáng)度下變得松弛，增加與酶的接觸機(jī)會(huì)，加速酶解[12]。近幾年來，針對(duì)PEF的研究主要涉及高壓脈沖的殺菌作用、對(duì)微生物、酶的影響和功能物質(zhì)的提取等方面[13-14]。不少學(xué)者研究了PEF技術(shù)對(duì)于食品新鮮度的保持及對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分的影響效果，近年來有望實(shí)現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)

用[15]。Rahbari等[16]研究高壓電場(chǎng)解凍對(duì)雞胸肉蛋白特性的影響;Ding Changjiang等[17]研究高壓電場(chǎng)輔助冷凍豆腐解凍;Delsart等[18]研究脈沖電場(chǎng)和高壓放電對(duì)紅酒微生物穩(wěn)定性和品質(zhì)特性的影響;周亞軍等[19-20]利用PEF提取河蚌中的多糖及魚骨中的鈣;張鳴鏑等[21]采用PEF破壁法提高了紅松籽的抗氧化肽活性;劉錚等[22]采用PEF破壁法提取廢啤酒酵母中的蛋白質(zhì)與核酸。PEF技術(shù)在制備氨基態(tài)氮方面應(yīng)用較少，本研究將PEF技術(shù)應(yīng)用于河蚌肉酶解中，得到氨基態(tài)氮得率高的酶解液，制備營(yíng)養(yǎng)、風(fēng)味俱佳的復(fù)合調(diào)味料，為河蚌肉的加工與調(diào)味料制備提供一種新的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

松花江野生河蚌，購(gòu)于長(zhǎng)春市扶余市長(zhǎng)春嶺鎮(zhèn)。

甲醛、鹽酸、氫氧化鈉（均為分析純） 北京化工廠;風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶（均為食品級(jí)） 廣西南寧龐博生物工程有限公司;中性蛋白酶、獼猴桃蛋白酶、無花果蛋白酶（均為食品級(jí)） 南京奧多福尼生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PEF系統(tǒng)（頻率10～5 000 Hz，處理室體積0.75 mm3） 自制;JJ200電子天平 常熟市雙杰測(cè)試儀器廠;THZ-98C恒溫振蕩器 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;TGL-16gR飛鴿牌系列離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;SHJ-4B恒溫磁力攪拌水浴鍋 常州高德儀器制造有限公司;PHSJ-4A實(shí)驗(yàn)室pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;XFS-280手提式壓力蒸汽滅菌器（規(guī)格DN-300） 浙江新豐醫(yī)療器械有限公司;ME204/02電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司;HHS-8S電子恒溫不銹鋼水浴鍋 上海宜昌儀器沙篩廠。

1.3 方法

1.3.1 酶解液制備工藝流程

河蚌→清洗勻漿→加酶水解（PEF輔助）→滅酶→離心→酶解液操作要點(diǎn)：1）原料預(yù)處理：清洗河蚌肉，去除蚌肉中的沙子和污物，將蚌肉倒入膠體磨中，加入少量水，制成勻漿，將河蚌肉分裝入袋，放入冰箱備用;2）PEF處理：將上述混合漿液以10 mL/min流速經(jīng)蠕動(dòng)泵送至PEF處理室，在一定電場(chǎng)強(qiáng)度、液料比和脈沖數(shù)（個(gè)）的條件下進(jìn)行PEF處理;3）制備酶解液：取40 g河蚌肉，按照4∶1的液料比（V/m）加水溶解，放入錐形瓶中，加入不同種類、一定比例的蛋白酶，調(diào)至一定溫度和pH值，放入恒溫磁力攪拌水浴鍋中水浴一段時(shí)間;4）離心：反應(yīng)完成后，放置于室溫下冷卻，再放入離心機(jī)中離心（4 500 r/min、15 min）后取出上層清液，并記錄上清液質(zhì)量;5）分析檢測(cè)：取20 g上清液至100 mL容量瓶中定容，分別取20 mL定容后的溶液放入3 個(gè)錐形瓶中，各加入60 mL蒸餾水，空白實(shí)驗(yàn)取80 mL蒸餾水于錐形瓶中，用甲醛進(jìn)行滴定，滴定方法參照GB/T 12143—2008《飲料通用分析方法》。取滴定結(jié)果平均值計(jì)算水解度，并作柱狀圖或折線圖，對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.3.2 指標(biāo)檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)以水解度為反應(yīng)指標(biāo)，采用甲醛電位滴定法測(cè)定離心液中氨基態(tài)氮的含量，計(jì)算酶解所得蛋白質(zhì)的質(zhì)量。水解度按照下式計(jì)算。

式中：β為水解度/%;n為甲醛電位滴定法測(cè)得氨基態(tài)氮物質(zhì)的量/mol;M為氮元素的摩爾質(zhì)量（14 g/mol）;K為河蚌肉換算系數(shù)，根據(jù)GB 5009.5—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》，河蚌肉換算系數(shù)為6.25;m為河蚌肉質(zhì)量/g;α為河蚌肉中蛋白質(zhì)含量（7%），測(cè)定方法參照GB 5009.5—2016。

1.3.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

取4 g河蚌肉，按照表1的數(shù)據(jù)，加水溶解，放入錐形瓶中，調(diào)節(jié)pH值，加入相應(yīng)的酶，放入恒溫磁力攪拌水浴鍋中水浴，控制溫度;反應(yīng)完成后，放置于室溫條件下冷卻，再放入離心機(jī)中離心（4 500 r/min、15 min）后取出上層清液，并記錄上清液質(zhì)量;取20 g上清液至100 mL容量瓶中定容，分別取20 mL定容后的溶液放入3 個(gè)錐形瓶中，各加入60 mL蒸餾水，另取80 mL蒸餾水于錐形瓶中作為對(duì)照組，用甲醛進(jìn)行滴定，計(jì)算水解度，并作柱狀圖或折線圖，對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇溫度、pH值和電場(chǎng)強(qiáng)度3 個(gè)影響顯著的因素作為響應(yīng)變量，利用Design-Expert 8.0.5b軟件，按照Central Composite的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以水解度為響應(yīng)值，通過響應(yīng)面分析進(jìn)行酶解條件的優(yōu)化，得到最優(yōu)酶解條件。各試驗(yàn)組的編碼與取值、因子編碼及各變量水平如表2所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶種類對(duì)河蚌肉水解度的影響

在酶添加量1.2%、溫度55 ℃、pH值6.5、反應(yīng)時(shí)間4 h、液料比40、脈沖數(shù)800、電場(chǎng)強(qiáng)度25 kV/cm的條件下，選用木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、無花果蛋白酶、中性蛋白酶和獼猴桃蛋白酶5 種不同的蛋白酶酶解河蚌肉。

由圖1可知，加入不同種類的酶，河蚌肉的水解度也不一樣。加入木瓜蛋白酶時(shí)的水解度最好，其次是風(fēng)味蛋白酶，無花果蛋白酶、中性蛋白酶和獼猴桃蛋白酶的酶解效果均不理想，與前2 種酶相差較大。根據(jù)劉通

訊等[23]對(duì)于酶法水解鰱魚蛋白的研究，復(fù)合酶的酶解效果優(yōu)于單一酶。因此，本研究采用木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶進(jìn)行復(fù)合酶解，這與郭福軍等[6]研究河蚌酶解液美拉德反應(yīng)前后風(fēng)味成分的變化實(shí)驗(yàn)所用的酶一致。

2.2 溫度對(duì)河蚌肉水解度的影響

在酶添加量1.2%、木瓜蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶配比1∶1、pH值6.5、反應(yīng)時(shí)間4 h、液料比40、脈沖數(shù)800、電場(chǎng)強(qiáng)度25 kV/cm的條件下，將溫度分別設(shè)定為45、50、55、60、65 ℃酶解河蚌肉。

由圖2可知，隨著溫度的升高，河蚌肉水解度呈先上升后下降的趨勢(shì)，在50 ℃時(shí)達(dá)到最大，50 ℃以后下降趨勢(shì)漸漸變緩慢，這是由于溫度低于50 ℃時(shí)，酶活性隨溫度升高而增強(qiáng)，而溫度高于50 ℃時(shí)，隨著溫度的不斷升高酶活性受到抑制，酶解效果越來越差。這與李梅青等[24]超聲輔助提取明綠豆中的超氧化物歧化酶工藝，譚秀山等[25]研究雞肉蛋白質(zhì)提取條件的優(yōu)化結(jié)果一致。

2.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)河蚌肉水解度的影響

在酶添加量1.2%、pH值6.5、木瓜蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶配比1∶1、溫度50 ℃、液料比40、脈沖數(shù)800、電場(chǎng)強(qiáng)度25 kV/cm的條件下，將反應(yīng)時(shí)間分別設(shè)定為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 h酶解河蚌肉。

由圖3可知：當(dāng)反應(yīng)時(shí)間小于4.5 h時(shí)，河蚌肉水解度隨著時(shí)間的增加而不斷上升;當(dāng)反應(yīng)時(shí)間大于4.5 h時(shí)，河蚌肉水解度隨時(shí)間的增加呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢(shì)。這可能是由于隨著反應(yīng)時(shí)間的不斷增加，反應(yīng)底物和酶不斷反應(yīng)，水解度不斷增加;當(dāng)反應(yīng)時(shí)間大于4.5 h時(shí)，酶解效果變化不明顯，可能是由于反應(yīng)底物和酶完全反應(yīng)，水解度不再發(fā)生明顯變化，而反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng)既浪費(fèi)能源又可能引發(fā)不必要的反應(yīng)。這與黎英等[26]采用超聲波輔助酶法優(yōu)化提取紅腰豆多糖工藝實(shí)驗(yàn)中的觀點(diǎn)一致。

2.4 pH值對(duì)河蚌肉水解度的影響

在酶添加量1.2%、木瓜蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶配比1∶1、溫度50 ℃、反應(yīng)時(shí)間4.5 h、液料比40、脈沖數(shù)800、電場(chǎng)強(qiáng)度25 kV/cm的條件下，將pH值分別設(shè)定為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5酶解河蚌肉。

由圖4可知：當(dāng)pH值小于6.5時(shí)，隨著pH值的升高，河蚌肉水解度不斷上升，且上升趨勢(shì)不斷加快;當(dāng)pH值大于6.5時(shí)，隨著pH值的升高，河蚌肉水解度不斷降低，這是由于酶需要一個(gè)適合的pH值環(huán)境，pH值對(duì)水解度有很大的影響。這與張輝[27]超聲輔助酶解制備麥麩抗氧化肽工藝研究、王麗等[28]酶法制備白鰱魚蛋白粉研究中的觀點(diǎn)一致。

2.5 木瓜蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶配比對(duì)河蚌肉水解度的影響

在酶添加量1.2%、溫度50 ℃、pH值6.5、反應(yīng)時(shí)間4.5 h、液料比40、脈沖數(shù)800、電場(chǎng)強(qiáng)度25 kV/cm的條件下，將木瓜蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶的配比分別設(shè)為1∶1、1∶2、2∶3、3∶2、2∶1酶解河蚌肉。

由圖5可知：隨著木瓜蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶配比不斷增大，酶解效果先變好后變差，木瓜蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶配比為3∶2時(shí)，河蚌肉水解度最高，這是由于木瓜蛋白酶與樣品的結(jié)合能力更強(qiáng)，當(dāng)木瓜蛋白酶占比逐漸增大時(shí)，水解度逐漸增高。當(dāng)水解度增大到一定程度，由于底物有限，因此水解度受到底物濃度限制而不能繼續(xù)增大。因此，確定木瓜蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶最佳配比為3∶2。

2.6 酶添加量對(duì)河蚌肉水解度的影響

在木瓜蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶配比1∶1、溫度50 ℃、pH值6.5、反應(yīng)時(shí)間4.5 h、液料比40、脈沖數(shù)800、電場(chǎng)強(qiáng)度25 kV/cm的條件下，將酶添加量分別設(shè)定為0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%酶解河蚌肉。

由圖6可知：隨著酶添加量的增加，河蚌肉水解度不斷上升，且上升趨勢(shì)逐漸變緩，在酶添加量為1.6%時(shí)，河蚌肉水解度達(dá)到最大;酶量繼續(xù)增加，水解度沒有太大變化。這可能是由于底物一定時(shí)，隨著酶添加量的增加，酶解效果不斷增加，但酶添加量繼續(xù)增加時(shí)，酶受到底物限制，達(dá)到飽和點(diǎn)，并不能與底物繼續(xù)結(jié)合，因此酶解效果變化不明顯。這與王麗等[28]酶法制備白鰱魚蛋白粉研究中的觀點(diǎn)一致。因此，初步確定酶最佳添加量為1.6%。

2.7 液料比對(duì)河蚌肉水解度的影響

在酶添加量1.6%、木瓜蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶配比1∶1、溫度50 ℃、pH值6.5、反應(yīng)時(shí)間4.5 h、脈沖數(shù)8、電場(chǎng)強(qiáng)度25 kV/cm的條件下，將液料比分別設(shè)定為20、30、40、50、60酶解河蚌肉。

由圖7可知：當(dāng)液料比由20逐漸增加時(shí)，河蚌肉水解度逐漸增加并趨于穩(wěn)定;當(dāng)液料比為50時(shí)，河蚌肉水解度最高。這是由于增大溶劑用量時(shí)，樣品與溶劑充分接觸，并充分與酶結(jié)合;溶劑用量增加至一定程度，樣品與溶劑接觸程度足夠充分，水解度增加不明顯。這與蔣德旗等[29]在響應(yīng)面優(yōu)化纖維素酶法提取桂花多糖工藝及其抗氧化活性研究中的觀點(diǎn)一致。

2.8 脈沖數(shù)對(duì)河蚌肉水解度的影響

在酶添加量1.6%、木瓜蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶配比1∶1、溫度50 ℃、pH值6.5、反應(yīng)時(shí)間4.5 h、液料比50、電場(chǎng)強(qiáng)度25 kV/cm的條件下，將脈沖數(shù)分別設(shè)定為6、7、8、9、10酶解河蚌肉。

由圖8可知：當(dāng)脈沖數(shù)為8時(shí)，河蚌肉水解度最高;脈沖數(shù)從6增加至8時(shí)，水解度逐漸增大;脈沖數(shù)從8增加到10時(shí)，水解度逐漸降低。這是由于增大脈沖數(shù)時(shí)，細(xì)胞破壞程度增加，細(xì)胞內(nèi)容物易于溶出，但脈沖數(shù)增加至一定程度會(huì)引起分子破壞，使水解度先增加后降低。這與周亞軍等[19]PEF輔助提取河蚌多糖工藝優(yōu)化研究的結(jié)果一致。

2.9 電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)河蚌肉水解度的影響

在酶添加量1.6%、木瓜蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶配比1∶1、溫度50 ℃、pH值6.5、反應(yīng)時(shí)間4.5 h、液料比50、脈沖數(shù)8的條件下，將電場(chǎng)強(qiáng)度分別設(shè)定為15、20、25、30、35 kV/cm酶解河蚌肉。

由圖9可知：當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度為20 kV/cm時(shí)，河蚌肉水解度最高;電場(chǎng)強(qiáng)度從15 kV/cm增加至20 kV/cm時(shí)，水解度有所增加;電場(chǎng)強(qiáng)度從20 kV/cm增加至35 kV/cm時(shí)，水解度逐漸下降。這是由于電場(chǎng)強(qiáng)度增加，細(xì)胞孔隙增大，細(xì)胞內(nèi)容物易溶出，易提取細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)，但電場(chǎng)強(qiáng)度增加至某一程度后，介電特性降低，從而水解度降低。這與馬飛宇等[30]對(duì)于PEF影響果蔬介電特性實(shí)驗(yàn)與機(jī)理分析的觀點(diǎn)一致。

2.10 響應(yīng)曲面法優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.10.1 響應(yīng)面優(yōu)化方案設(shè)計(jì)與結(jié)果

在試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上繪制AB、AC、BC的兩因素交互作用響應(yīng)面3D效果圖。由圖10～12可知，AB、AC、BC的交互作用存在峰值，隨著溫度、pH值、電場(chǎng)強(qiáng)度的不斷增加，河蚌肉水解度呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，pH值對(duì)水解度影響較大。溫度與pH值兩因素交互作用的等高線圖為圓形，說明AB交互作用不顯著。溫度與電場(chǎng)強(qiáng)度、pH值與電場(chǎng)強(qiáng)度的交互作用等高線為橢圓，說明AC、BC之間交互作用顯著。

通過單因素試驗(yàn)找到對(duì)河蚌肉水解度影響顯著的因素，并用響應(yīng)面法分析河蚌肉酶解條件，應(yīng)用Design-Expert 8.0.5b軟件為各因素取最優(yōu)值，分別為A=49.86，B=6.74，C=18.58，轉(zhuǎn)換后得到的最佳提取條件為溫度50 ℃、pH值6.74、電場(chǎng)強(qiáng)度18.58 kV/cm，水解度預(yù)測(cè)值43.26%。對(duì)上述實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行驗(yàn)證，得到河蚌肉水解度分別為43.25%、44.14%和43.65%，平均值為42.68%，且重復(fù)性較好。

3 結(jié) 論

經(jīng)優(yōu)化后的河蚌肉酶解條件為酶添加量1.6%、木瓜蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶配比1.71∶1、溫度50 ℃、pH值6.74、反應(yīng)時(shí)間4.5 h、液料比50、脈沖數(shù)8、電場(chǎng)強(qiáng)度18.85 kV/cm。經(jīng)優(yōu)化后的酶解條件可使河蚌肉水解度達(dá)42.75%，較對(duì)照組的36.23%提高18.0%。

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