惠繼星，范 銳，岳 軍，寧艷春，屈海峰，胡世洋，王繼艷

（1.中國石油吉林石化公司研究院，吉林吉林132021；2.吉林燃料乙醇有限責(zé)任公司，吉林吉林132101）

我國是一個生物質(zhì)能源生產(chǎn)和應(yīng)用大國，以燃料乙醇為代表的生物質(zhì)能源對保障國家能源安全起到了重要作用[1]。隨著我國燃料乙醇的不斷推廣和應(yīng)用，預(yù)計(jì)到2020年燃料乙醇年利用量將達(dá)到1000萬t[2]?，F(xiàn)階段，在燃料乙醇生產(chǎn)過程中，大規(guī)模應(yīng)用且來源廣泛的原料主要是玉米、小麥、薯干等糧食作物和木薯等非糧作物[3-4]，這些原料發(fā)酵生產(chǎn)的酒精統(tǒng)稱為淀粉質(zhì)原料酒精。乙醇發(fā)酵中，淀粉到葡萄糖的轉(zhuǎn)化率高低直接影響到原料消耗量以及菌體可利用糖量，最終影響到乙醇產(chǎn)量的高低。如何提高乙醇生產(chǎn)的葡萄糖轉(zhuǎn)化率，提高乙醇產(chǎn)量以降低乙醇生產(chǎn)成本已成當(dāng)務(wù)之急[5]。20世紀(jì)90年代后，隨著酶工業(yè)和酵母工業(yè)的產(chǎn)業(yè)化，越來越多的研究人員嘗試將不同的酶制劑應(yīng)用于發(fā)酵生產(chǎn)酒精以提高發(fā)酵速率和原料出酒率，從而降低酒精生產(chǎn)成本[6]。

以玉米為原料生產(chǎn)酒精時，在發(fā)酵過程中添加適量的酸性蛋白酶，一方面能有效地水解原料中的蛋白質(zhì)，破壞原料細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，利于糖化酶的作用，使原料中可利用的糖增加，從而提高淀粉出酒率；另一方面，由于蛋白酶的水解作用，增加了醪液中可被酵母利用的有機(jī)氮，促進(jìn)了酵母的生長和繁殖，增強(qiáng)了酵母菌的產(chǎn)酒能力，提高發(fā)酵速度，縮短發(fā)酵周期[7]。在玉米原料酒精發(fā)酵過程中添加適量的纖維素酶，一方面能將部分纖維素水解成可發(fā)酵性糖供酵母菌利用，從而提高淀粉出酒率；另一方面能破壞原料細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，促進(jìn)淀粉、蛋白質(zhì)等有效成分的溶出，對提高淀粉出酒率有積極作用[8]。有關(guān)酸性蛋白酶和纖維素酶應(yīng)用方面的報道較多，但是酸性蛋白酶和纖維素酶聯(lián)合應(yīng)用于玉米燃料乙醇的報道較少。本實(shí)驗(yàn)研究了酸性蛋白酶和纖維素酶聯(lián)合應(yīng)用對玉米燃料乙醇發(fā)酵過程的影響，研究二者是否存在協(xié)同作用，并確定適宜的添加量，為工業(yè)化應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料及設(shè)備

菌種：超級釀酒高活性干酵母，湖北安琪酵母股份有限公司。

實(shí)驗(yàn)耗材：市售玉米粉；酸性蛋白酶，山東蔚藍(lán)生物科技有限公司，酶活力5萬U/mL；糖化酶，諾維信公司，10萬U/mL；耐高溫α-淀粉酶，24萬U/mL；纖維素酶，上海寶曼生物科技有限公司，150 FPU/g。

儀器設(shè)備：立式全溫振蕩培養(yǎng)箱，ZQPL-200，天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司；潔凈工作臺，SW-CJ-1FD；高壓滅菌鍋，MJ-78A，施都凱儀器設(shè)備（上海）有限公司；離心機(jī)，A14，Sartorius公司；液相色譜，LC-20A，日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料液化、糖化

將市售玉米粉按料水比1∶3，用60～70℃溫水調(diào)漿；95℃糊化液化120 min，液化酶加量為30 U/g玉米粉；60℃恒溫糖化60 min，糖化酶加量為70 U/g玉米粉，得到玉米糖化醪。

1.2.2 酵母活化

稱取0.3 g安琪超級釀酒高活性干酵母，加入裝有100 mL無菌水的三角瓶中，在32℃，180 r/min的搖床中活化60 min。

1.2.3 發(fā)酵

向玉米糖化醪中加入1 mL酵母活化液，加入適量的酸性蛋白酶、纖維素酶，在轉(zhuǎn)速180 r/min，溫度32℃的搖床中開始發(fā)酵。

1.3 分析方法

1.3.1 乙醇濃度和葡萄糖濃度測定

取發(fā)酵液樣品1.8 mL加入2.0 mL離心管中，在12000 r/min下離心5 min，取上清液稀釋10倍，然后用0.22 μm的水系濾膜過濾，用液相色譜儀（檢測器：示差折光檢測器；流速：0.6 mL/min；流動相：0.005 mol/L硫酸；柱溫：55℃）測定發(fā)酵液中乙醇和葡萄糖的濃度，按公式（1）計(jì)算樣品中乙醇濃度，按公式（2）計(jì)算樣品中葡萄糖濃度。

1.3.2 可溶性蛋白的測定

用電子分析天平準(zhǔn)確稱取0.1 g牛血清白蛋白，加入100 mL容量瓶中，加水定容至100 mL，振蕩溶解，靜置30 min，得到濃度為1 mg/mL的牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液；取6支試管，用移液器分別加入0 mL、0.02 mL、0.04 mL、0.06 mL、0.08 mL、0.10 mL濃度為1 mg/mL的牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，加去離子水定容至1.0 mL，振蕩搖勻。取一個潔凈的微孔板，依次加入20 μL上述不同濃度梯度的牛血清白蛋白溶液和200 μL蛋白定量試劑，靜置10～15 min。利用微孔板光譜儀在波長為595 nm處，以未添加牛血清白蛋白溶液的試驗(yàn)組為對照，測定各孔板中液體的吸光度值。發(fā)酵液中可溶性蛋白濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

2 結(jié)果與討論

2.1 酸性蛋白酶對發(fā)酵液中可溶性蛋白濃度的影響

圖1 可溶性蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

酸性蛋白酶能有效地水解原料中的可溶性蛋白成游離氨基酸，增加醪液中可被酵母利用的有機(jī)氮。酸性蛋白酶在接種前添加，添加量為10 U/g固體原料，自然pH值，發(fā)酵液中可溶性蛋白濃度隨時間的變化如圖2所示。

圖2 發(fā)酵液中可溶性蛋白濃度隨時間的變化

由圖2可見，空白試驗(yàn)發(fā)酵液中可溶性蛋白濃度隨發(fā)酵時間的延長而逐漸升高，表明酵母細(xì)胞不能直接利用可溶性蛋白；添加酸性蛋白酶試驗(yàn)的發(fā)酵液中可溶性蛋白濃度保持在相對較低的水平，表明酸性蛋白酶對發(fā)酵液中的可溶性蛋白具有較強(qiáng)的水解作用。

2.2 酸性蛋白酶對發(fā)酵周期的影響

微生物的生長離不開氮源，由于酸性蛋白酶的水解作用，增加了醪液中可被酵母利用的有機(jī)氮，促進(jìn)酵母的生長繁殖，提高發(fā)酵速率。酸性蛋白酶在接種前添加，添加量為10 U/g固體原料，自然pH值，發(fā)酵液中乙醇濃度和葡萄糖濃度隨時間的變化見圖3。

圖3 發(fā)酵液中乙醇和葡萄糖濃度隨發(fā)酵時間的變化

由圖3可見，添加酸性蛋白酶試驗(yàn)的發(fā)酵液中乙醇濃度明顯高于空白試驗(yàn)，相應(yīng)的發(fā)酵液中殘余葡萄糖濃度明顯低于空白試驗(yàn)，表明添加酸性蛋白酶對乙醇發(fā)酵過程具有明顯的促進(jìn)作用，發(fā)酵周期較空白試驗(yàn)縮短8 h。

2.3 酸性蛋白酶添加量的影響

酸性蛋白酶的添加量是影響乙醇發(fā)酵過程的重要因素，對提高乙醇發(fā)酵速率、降低燃料乙醇成本具有重要意義。酸性蛋白酶在接種前添加，自然pH值，不同酸性蛋白酶添加量的發(fā)酵液中乙醇濃度和葡萄糖濃度隨發(fā)酵時間的變化見圖4。

圖4 發(fā)酵液中乙醇濃度隨發(fā)酵時間及添加量的變化

由圖4可見，發(fā)酵24 h，隨著酸性蛋白酶添加量的增加，發(fā)酵液中乙醇濃度逐漸增加，當(dāng)酸性蛋白酶添加量大于6 U/g固體原料時，隨著酸性蛋白酶添加量的增加，發(fā)酵液中乙醇濃度增加緩慢；發(fā)酵32 h，當(dāng)酸性蛋白酶添加量大于4 U/g固體原料時，隨著酸性蛋白酶添加量的增加，發(fā)酵液中乙醇濃度增加緩慢；發(fā)酵44 h，各試驗(yàn)的發(fā)酵液中乙醇濃度停止上升，發(fā)酵結(jié)束，表明添加酸性蛋白酶可加快前期乙醇發(fā)酵速率，適宜在發(fā)酵前期添加。

2.4 纖維素酶添加量的影響

纖維素酶是一種復(fù)合酶，具有極高的活力，在糖化及發(fā)酵過程中，將原料中的纖維素、半纖維素及其他成分降解為可發(fā)酵性糖，供酵母利用，從而提高原料的出酒率。纖維素酶在接種前添加，自然pH值，不同纖維素酶添加量的發(fā)酵液中乙醇濃度、葡萄糖濃度隨發(fā)酵時間的變化分別見圖5、圖6。

圖5 發(fā)酵液中乙醇濃度隨纖維素酶添加量的變化

圖6 發(fā)酵液中殘?zhí)菨舛入S纖維素酶添加量的變化

由圖5、圖6可見，發(fā)酵16 h，隨著纖維素酶添加量的增加，發(fā)酵液中乙醇濃度和殘?zhí)菨舛认嗖畈淮螅话l(fā)酵32 h，隨著纖維素酶添加量的增加，發(fā)酵液中乙醇濃度逐漸上升，相應(yīng)的殘余葡萄糖濃度逐漸下降，當(dāng)纖維素酶添加量大于3 FPU/g固體原料時，發(fā)酵液中乙醇濃度和殘?zhí)菨舛茸兓吘彛话l(fā)酵40 h，添加纖維素酶試驗(yàn)的發(fā)酵液中乙醇濃度明顯高于空白試驗(yàn)，這是由于纖維素酶可使發(fā)酵液中殘余的纖維素、半纖維素等轉(zhuǎn)化為葡萄糖供酵母利用，產(chǎn)生更多的乙醇，較空白試驗(yàn)發(fā)酵成熟醪中乙醇濃度提高5 g/L，從而提高了原料的出酒率。添加纖維素酶試驗(yàn)的發(fā)酵周期較空白試驗(yàn)有所縮短，這是由于纖維素酶中除了含有纖維素酶以外，還含有對乙醇發(fā)酵過程具有促進(jìn)作用的酶類。

2.5 兩因素中心組合優(yōu)化

試驗(yàn)以酸性蛋白酶、纖維素酶添加量為主要因素，以發(fā)酵液中乙醇濃度為響應(yīng)值進(jìn)行了2因素5水平的優(yōu)化，利用minitab16軟件對試驗(yàn)進(jìn)行了2因素5水平中心組合設(shè)計(jì)，如表1所示。利用Statistic6.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面的分析，發(fā)酵24 h中心組合響應(yīng)面如圖7所示。

表1 2因素5水平中心組合設(shè)計(jì)

圖7 中心組合響應(yīng)面圖（酸性蛋白酶與纖維素酶交互作用）

表2 中心組合因子水平設(shè)計(jì)及ρ（乙醇）值實(shí)驗(yàn)結(jié)果預(yù)測結(jié)果對比表 (g/L)

由圖7可見，發(fā)酵24 h發(fā)酵液中乙醇濃度的回歸方程為：z=54.6655+0.3609x+1.8736y-0.0286x2+0.4068xy-0.1941y2（式中，x為酸性蛋白酶添加量，單位為U/g固體原料；y為纖維素酶添加量，單位為FPU/g固體原料；z為乙醇濃度，單位為g/L）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，模型的P＜0.05，表明添加纖維素酶和酸性蛋白酶對發(fā)酵液中乙醇濃度影響顯著，數(shù)學(xué)模型R2為97.82%，表明該模型顯著，可以很好地對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行預(yù)測[9]。當(dāng)ρ（酸性蛋白酶）與ρ（纖維素酶）同時處于低水平時，乙醇濃度處于較低值；反之，當(dāng)ρ（酸性蛋白酶）與ρ（纖維素酶）同時處于高水平時，乙醇濃度處于較高值；當(dāng)ρ（酸性蛋白酶）處于低水平，ρ（纖維素酶）大于2 FPU/g固體原料時，乙醇濃度升高顯著；當(dāng)ρ（纖維素酶）處于低水平，ρ（酸性蛋白酶）大于6 U/g固體原料時，乙醇濃度升高顯著。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，ρ（酸性蛋白酶）與ρ（纖維素酶）交互作用P值為0.082＞0.05，表明二者交互作用不顯著。

2.6 酸性蛋白酶與纖維素酶聯(lián)用回歸方程驗(yàn)證試驗(yàn)

在酸性蛋白酶和纖維素酶聯(lián)用的條件下進(jìn)行乙醇發(fā)酵試驗(yàn)，發(fā)酵24 h發(fā)酵液中乙醇濃度的預(yù)測值和實(shí)際值見表2。

由表2可知，發(fā)酵24 h，發(fā)酵液中乙醇濃度的實(shí)際值與預(yù)測值相差不大，表明發(fā)酵24 h發(fā)酵液中乙醇濃度的回歸方程可以對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行較準(zhǔn)確的預(yù)測。

3 結(jié)論

采用單因素、2因素5水平中心組合的方法對纖維素酶、酸性蛋白酶的添加量進(jìn)行了2次優(yōu)化。結(jié)果表明：ρ（酸性蛋白酶）與ρ（纖維素酶）交互作用P值為0.082＞0.05，二者交互作用不顯著；當(dāng)ρ（酸性蛋白酶）處于低水平，ρ（纖維素酶）大于2 FPU/g固體原料時，乙醇濃度升高顯著；當(dāng)ρ（纖維素酶）處于低水平，ρ（酸性蛋白酶）大于6 U/g固體原料時，乙醇濃度升高顯著。數(shù)學(xué)模型R2為91.86%，P=0.001＜0.05，模型顯著，可以用于對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的預(yù)測。