何 珊，馬淑一，付玉華，于敬達(dá)，高 芳，蔡 琳

(1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014040；2.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科)

ZBED6是在研究瘦肉型豬的影響因素時(shí)發(fā)現(xiàn)的一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，在哺乳動(dòng)物中有高度的保守性[1]。ZBED6結(jié)合在胰島素樣生長(zhǎng)因子2(IGF2)的3號(hào)內(nèi)含子區(qū)，可抑制IGF2的表達(dá)量[1]。但是關(guān)于ZBED6的研究很少，而關(guān)于其與人類疾病相關(guān)的研究更是少之又少，只在胰島細(xì)胞和人結(jié)直腸癌細(xì)胞系中做過(guò)相關(guān)研究。發(fā)現(xiàn)ZBED6介導(dǎo)的對(duì)IGF2的調(diào)控可能與胰島β細(xì)胞有關(guān)，因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)在自發(fā)糖尿病小鼠中異常的IGF2產(chǎn)物會(huì)引起后續(xù)β細(xì)胞量的異常[2]。而且，人胰島素基因成簇排列在IGF2附近，說(shuō)明除了IGF2外，胰島素或許也受到ZBED6依賴性方式的調(diào)控[3]。本實(shí)驗(yàn)采用單核苷酸多態(tài)性(SNP)的關(guān)聯(lián)研究，初步探討ZBED6基因1043A/G多態(tài)性與2型糖尿病發(fā)病的相關(guān)性。

1 資料和方法

1.1研究樣本 2型糖尿病患者83例，均來(lái)自包頭地區(qū)，彼此間無(wú)親緣關(guān)系。其中男37例，女46例，年齡28-88歲。同等數(shù)量的健康對(duì)照來(lái)自同時(shí)期社區(qū)體檢人群，均無(wú)2型糖尿病，且性別、年齡與患病組相匹配。

1.2聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)檢測(cè) (1) 提取基因組DNA：EDTA抗凝管采集研究對(duì)象靜脈血，使用天根基因組DNA提取試劑盒提取外周血基因組DNA。(3)引物設(shè)計(jì)、合成：通過(guò)NCBI查找ZBED6基因序列，并使用Primer5軟件設(shè)計(jì)引物，交由生物公司合成。引物序列F:TCAAGAGCTGTGTGTAATATATGTA，R: CTAACATAGGTTCATCTGAATCAGA。擴(kuò)增基因序列長(zhǎng)280 bp。(3)PCR擴(kuò)增：反應(yīng)體系：模板3 μl，上下游引物各1 μl，2×Taq PCR Master Mix 13 μl,去離子水7 μl。反應(yīng)參數(shù)：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，51 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，33個(gè)循環(huán)，72 ℃ 5 min；(4)基因分型和測(cè)序：對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切反應(yīng)，反應(yīng)體系10 μl，包括PCR產(chǎn)物4 μl，內(nèi)切酶NlaⅢ 0.2 μl，10×限制性內(nèi)切酶Buffer 1 μl。37 ℃反應(yīng)15 min后，電泳，分析基因型(GG型：280 bp，AA型：205和75 bp，AG型：205,280,75 bp)，隨機(jī)選取患者及正常對(duì)照PCR產(chǎn)物各5份，送北京六合華大基因科技有限公司測(cè)序，驗(yàn)證酶切結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1ZBED6基因1043A/G位點(diǎn)基因分型 經(jīng)酶切反應(yīng)確定ZBED6基因1043A/G位點(diǎn)只存在1種基因型AA，2型糖尿病患者與正常對(duì)照無(wú)差異，見(jiàn)圖1。

2.2ZBED6基因1043A/G位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果 PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果顯示：ZBED6基因1043A/G位點(diǎn)只有1種基因型AA，與酶切結(jié)果一致，2型糖尿病患者與正常對(duì)照無(wú)差異，見(jiàn)圖2。

圖1 ZBED6基因1043A/G位點(diǎn)基因分型電泳圖

圖2 ZBED6基因1043A/G位點(diǎn)PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果

3 討論

2型糖尿病是一種常見(jiàn)的內(nèi)分泌代謝性疾病，其發(fā)病特點(diǎn)主要表現(xiàn)為胰島素抵抗和/或胰島β細(xì)胞功能受損。目前研究顯示ZBED6基因的表達(dá)對(duì)胰島β細(xì)胞的發(fā)育與功能有重要的調(diào)節(jié)和控制作用。有人證實(shí)ZBED6在胰島素分泌細(xì)胞、小鼠胰島及人的β細(xì)胞中均有表達(dá)。且轉(zhuǎn)錄因子ZBED6影響胰島β細(xì)胞的基因表達(dá)、增殖和細(xì)胞死亡[4]， 因而可能與各型糖尿病的發(fā)病機(jī)理有關(guān)。2型糖尿病病因復(fù)雜，通常認(rèn)為其發(fā)病與遺傳及環(huán)境這兩大因素有著密切的聯(lián)系。有報(bào)道顯示CAPN-10基因的單核苷酸多態(tài)性與2型糖尿病呈顯著相關(guān),尤其CAPN-10的SNP43與2型糖尿病呈顯著相關(guān)[5]。有學(xué)者對(duì)中國(guó)人群進(jìn)行了一項(xiàng)大規(guī)模的研究，該研究驗(yàn)證了從韓國(guó)人、新加坡華人和歐洲美國(guó)人等3個(gè)GWAS中篩選出2100個(gè)SNP，研究后發(fā)現(xiàn)rs1359790，rs10906115和rs1436955與2型糖尿病相關(guān)[6]。另外，也有人發(fā)現(xiàn)在胰島β細(xì)胞出現(xiàn)的HDAC基因變異可能在糖尿病的發(fā)生中有作用[7]。目前，研究發(fā)現(xiàn)牛ZBED6基因存在3個(gè)對(duì)牛體重等性狀有顯著影響的SNP[8]，其中1043A/G位點(diǎn)與人最具同源性。但尚無(wú)關(guān)于人ZBED6基因1043A/G位點(diǎn)多態(tài)性與2型糖尿病發(fā)病關(guān)系的研究，故本課題選取了1043A/G位點(diǎn)，探討其多態(tài)性以及與2型糖尿病關(guān)系。結(jié)果顯示人ZBED6基因1043A/G位點(diǎn)無(wú)突變，均為AA型。表明2型糖尿病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)與1043A/G位點(diǎn)是否突變無(wú)相關(guān)性。雖然ZBED6基因在哺乳動(dòng)物中具有高度保守性[1]，但與牛不同，在人群中此位點(diǎn)不存在多態(tài)性，亦或可能因標(biāo)本數(shù)量不足而出現(xiàn)誤差。在后續(xù)研究中可選擇NCBI中已有的人ZBED6基因SNP位點(diǎn)進(jìn)行分析，進(jìn)一步探尋ZBED6基因多態(tài)性與2型糖尿病發(fā)病關(guān)系。以確證2型糖尿病發(fā)病是否與該基因某位點(diǎn)多態(tài)性相關(guān)。