張昭楊 龐軍玲 韓梅 冷鵬飛 趙軍

（1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，長春 130118；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

土地鹽漬化嚴(yán)重制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，導(dǎo)致世界范圍內(nèi)作物產(chǎn)量受損。據(jù)統(tǒng)計，全球有50%澆灌地和20%農(nóng)業(yè)用地遭受不同程度鹽害［1］。我國鹽漬土分布廣泛，大約占全球鹽漬土面積的1/10，嚴(yán)重影響我國農(nóng)業(yè)的發(fā)展［2］。玉米是世界三大糧食作物之一，在中國種植面積居世界第二位，在國民經(jīng)濟(jì)中占有重要地位［3］。玉米是中度鹽敏感植物，耐鹽能力比較低，因此限制了玉米種植面積和產(chǎn)量［4］。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育抗逆轉(zhuǎn)基因玉米已經(jīng)成為提高玉米抗逆性的有效途徑之一［5］。

植物中bZIP類轉(zhuǎn)錄因子參與多種生物過程和對干旱、鹽漬和極端溫度等逆境脅迫的反應(yīng)［6-7］。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所課題組前期利用酵母單雜交方法從玉米中克隆了一個可與過氧化氫酶基因Cat1［8］上游順式作用元件ABRE2相互作用的bZIP類轉(zhuǎn)錄因子基因ABP9［9］。通過對諸多轉(zhuǎn)ABP9植物研究表明，該基因可以大幅度提高植物對鹽漬等多種非生物脅迫的耐性［10-14］。

ABP9過表達(dá)可以提高擬南芥、水稻等植物的抗逆性，但在玉米中的研究還知之甚少。為了改良玉米品種的耐鹽性和進(jìn)一步研究ABP9過表達(dá)提高植物耐鹽性的調(diào)控機(jī)制，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所課題組創(chuàng)制了鄭58背景由逆境誘導(dǎo)型啟動子Pabp9［15］驅(qū)動ABP9表達(dá)的轉(zhuǎn)基因玉米株系。旨在通過研究其在NaCl脅迫下的生理和基因表達(dá)變化，分析其耐鹽性和初步探討其耐鹽分子調(diào)控機(jī)制，為后續(xù)研究工作提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為鄭58背景由逆境誘導(dǎo)型啟動子Pabp9驅(qū)動ABP9表達(dá)的轉(zhuǎn)基因玉米株系，對照為同一遺傳背景的轉(zhuǎn)基因陰性株系，種子均系中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院實驗室保藏。

1.2 方法

1.2.1 轉(zhuǎn)基因株系分子鑒定 采用盆栽法（蛭石∶營養(yǎng)土=1∶1）于人工氣候室內(nèi)種植，溫度27℃（±3℃），光周期16 h/8 h，光照強(qiáng)度500-1 000μmol/m2·s1，相對濕度為40%-50%。三葉期取葉片保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

（1）基因組DNA提取及PCR檢測 玉米葉片基因組DNA提取使用新型植物基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）。

使用特異引物ABP9-Fw：5'-CGAAGAAAAAGAAGCTGGTGGAG-3'，Tnos-Rv：5'-TGCGGGACTCTAATCATAAAAACC-3'，對轉(zhuǎn)基因ABP9株系進(jìn)行PCR檢測。

PCR反應(yīng)程序為95℃ 5 min；95℃ 30 s，60℃40 s，72℃ 40 s，32個循環(huán)；72℃ 10 min。經(jīng)電泳檢測PCR產(chǎn)物長度為582 bp的即為陽性植株。

（2）Southern blot分析 采用CTAB法大量提取玉米基因組DNA，探針合成及雜交試劑盒均購自羅氏。具體方法參照試劑盒說明及《分子克隆實驗指南·第三版》

（3）植物總RNA提取及qRT-PCR分析 采用RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）提取植物總RNA，參照TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用7500熒光定量PCR儀檢測相關(guān)基因的表達(dá)，反應(yīng)程序為95℃ 30 s；95℃ 15 s，60℃ 15 s，72℃ 30 s，40個循環(huán)；采用 2-ΔΔCt方法分析基因的表達(dá)水平。引物如下：

內(nèi)源參照基因Actin引物為：

1.2.2 生理指標(biāo)測定 挑選籽粒飽滿程度一致的種子用5%次氯酸鈉溶液消毒20 min，去離子水沖洗干凈，種于蛭石中。生長至一葉期時在溫室中用1/2Hoagland營養(yǎng)液進(jìn)行水培，光周期、溫度及濕度與1.2相同。兩葉期時逐漸增加營養(yǎng)液濃度至全營養(yǎng)液培養(yǎng)，每天氣泵增氧2 h，每隔2 d更換一次營養(yǎng)液。三葉期開始鹽脅迫處理，為了防止鹽應(yīng)激，每隔12 h增加50 mmol/L NaCl，直至終濃度150 mmol/L NaCl，對照組全營養(yǎng)液培養(yǎng)。處理7 d，期間觀察表型及測量各項生理指標(biāo)。

（1）葉綠素含量測定 采用乙醇丙酮法測定葉綠素含量［16］。

（2）葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定 挑選長勢一致的幼苗，選取相同葉位功能葉，固定葉夾，避光20 min，使用便攜式植物熒光檢測儀（Handy PEA，Hansatech Instrument Ltd，UK）測PSII的最大光化學(xué)效率（The maximal efficiency of PSII photochemistry，F(xiàn)v/Fm），測定光源為波長650 nm、光強(qiáng)3 000 μmol/m2·s1的紅光，熒光信號的記錄時長為2 s。計算公式為Fv/Fm=（Fm-Fo）/Fm，具體生理意義參照王立豐等的研究結(jié)果［17］。

（3）葉片相對含水量測定 三葉期水培苗直接用150 mmol/L NaCl處理12 h，恢復(fù)生長3 h后，剪取第二片全展葉1-2 cm稱取鮮重（Fresh Weight，F(xiàn)W），將葉片放入去離子水中浸泡至恒重（Total Weigh，TW）。再將葉片放入烘箱105℃殺青10 min，80℃烘干至恒重（Dry Weight，DW）。葉片相對含水量（%）=（FW-DW）/（TW-DW）×100%。

（4）游離脯氨酸及可溶性糖含量測定 脯氨酸含量測定參照脯氨酸（PRO）測試盒（南京建成生物工程研究所），可溶性糖測定參照植物可溶性糖含量檢測試劑盒提供的方法（北京索萊寶生物科技有限公司）。

（5）丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量測定 測定方法參照植物MDA試劑盒提供的方法（南京建成生物工程研究所）。

（6）相對電導(dǎo)率測定 三葉期水培苗用150 mmol/L NaCl處理3 d時，將幼苗葉片用超純水中沖洗3次，使用打孔器剪取葉片，置于裝有10 mL超純水的離心管中，抽真空10 min，讓葉片全部沉入管底，室溫靜置1 h，搖勻后測初始電導(dǎo)值（E1）。沸水浴10 min以殺死植物組織，流水冷卻至室溫，搖勻后次測定終電導(dǎo)值（E2）。相對電導(dǎo)率計算公式為相對電導(dǎo)率（RE）=E1 /E2。

（7）抗氧化酶活性測定 超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶（Peroxidase，POD）及過氧化氫酶（Catalase，CAT）活性測定參照試劑盒提供的方法（南京建成生物工程研究所）。粗酶液制備方法為稱取0.5 g葉片，加2 mL磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH=7.4），冰水浴條件下加入石英砂研磨，離心取上清。

1.2.3 轉(zhuǎn)錄組測序 用150 mol/L NaCl處理三葉期玉米幼苗，取處理0 h、15 min、30 min、1 h、2 h、3 h、6 h、9 h和12 h的玉米葉片，液氮速凍后-80℃保存。用RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）提取RNA，由諾禾致源測序公司完成測序。利用Tophat2軟件分析測序后的序列信息，并且只保留比對到基因組上單一位點的序列進(jìn)行后續(xù)分析。利用GenomicFeatures和GenomicAlignments軟件包統(tǒng)計比對到參考基因上的序列數(shù)目。然后用DESeq2軟件包進(jìn)行樣本間的歸一化，并且計算基因的表達(dá)量（FPKM值）。樣本之間的差異基因也是利用DESeq2軟件包完成。

基因的GO富集分析利用在線分析軟件agriGO完成。每一個條目中允許的最少基因數(shù)為5，F(xiàn)isher精確檢驗用來檢測輸入的基因列表與背景基因（AGPv3，Ensembl release 30）之間的差異。采用Benjamini-Yekutieli方法校正P值，最終取FDR ＜0.05作為最終顯著性檢驗的標(biāo)準(zhǔn)。對篩選的部分差異表達(dá)基因進(jìn)行qRT-PCR驗證，方法同1.2.3，引物見表1。

表1 引物設(shè)計

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)基因玉米植株分子鑒定

利用特異性引物進(jìn)行PCR檢測，植株均能擴(kuò)增出特異性條帶（圖1-A）。根據(jù)T-DNA片段所在區(qū)域，選用HindⅢ和EcoRI酶切后，進(jìn)行southern blot分析，結(jié)果（圖1-C）顯示為單個拷貝插入。

利用qRT-PCR檢測ABP9在轉(zhuǎn)基因及非轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)水平，轉(zhuǎn)基因植株中ABP9表達(dá)量高于陰性對照（圖1-B）。結(jié)果表明，ABP9以單拷貝形式整合到轉(zhuǎn)基因玉米基因組中，并得到較高水平表達(dá)。

圖1 轉(zhuǎn)基因植株分子鑒定

2.2 表型觀察及葉綠素含量測定

鹽處理至第3 d時，陰性植株第一片真葉失綠枯萎，而轉(zhuǎn)基因植株仍能保持較鮮綠狀態(tài)（圖2-A）。分別測定處理3 d的第一片真葉（圖2-B）和處理7 d第二片全展葉（圖2-C）的葉綠素含量，結(jié)果顯示，與對照組相比，處理組葉綠素含量均有下降，但轉(zhuǎn)基因植株葉綠素含量均極顯著高于陰性植株（P＜0.01）。

圖2 NaCl脅迫對玉米幼苗葉綠素含量的影響

2.3 NaCl脅迫對玉米幼苗Fv/Fm的影響

葉綠素?zé)晒鈪?shù)是植物耐鹽性分析中一個重要指標(biāo)，測定NaCl脅迫下玉米幼苗PSII最大光能轉(zhuǎn)化效率（Fv/Fm）的變化。隨著脅迫時間延長，玉米幼苗Fv/Fm逐漸下降。當(dāng)處理至第5天和第7天時，轉(zhuǎn)基因植株Fv/Fm顯著高于陰性植株（圖3）。

2.4 NaCl脅迫對玉米幼苗葉片含水量的影響

在150 mmol/L NaCl脅迫下，轉(zhuǎn)基因與陰性幼苗葉片逐漸失水萎蔫，但兩者間無顯著差異?；謴?fù)生長3 h后葉片含水量逐漸上升，但轉(zhuǎn)基因植株葉片含水量極顯著高于陰性植株（P＜0.01）（圖4）。

圖3 NaCl脅迫對玉米幼苗Fv/Fm的影響

圖4 NaCl脅迫對玉米幼苗葉片相對含水量的影響

2.5 NaCl脅迫對玉米幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

鹽脅迫條件下，植物常通過有機(jī)物質(zhì)的積累來維持較高的細(xì)胞質(zhì)滲透壓。通過測定脯氨酸和可溶性糖含量的變化，發(fā)現(xiàn)兩種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)隨處理時間增長，呈先上升后下降趨勢，但轉(zhuǎn)基因植株的脯氨酸（圖5-A）和可溶性糖（圖5-B）含量顯著高于陰性植株。

2.6 NaCl脅迫對玉米幼苗丙二醛（MDA）含量和電導(dǎo)率的影響

鹽脅迫導(dǎo)致植物細(xì)胞受到傷害發(fā)生膜脂過氧化作用，細(xì)胞膜透性增加，MDA含量和電導(dǎo)率上升。如圖6所示，隨脅迫時間增加，丙二醛含量呈先上升后下降趨勢，但陰性植株丙二醛含量要高于轉(zhuǎn)基因植株（圖6-A），在多個時間點達(dá)到顯著水平。處理至3 d時，陰性植株葉片相對電導(dǎo)率顯著高于轉(zhuǎn)基因植株（圖6-B）。

圖5 NaCl脅迫對玉米幼苗脯氨酸（A）和可溶性糖（B）含量的影響

圖6 NaCl脅迫對玉米幼苗丙二醛含量（A）和電導(dǎo)率（B）的影響

2.7 NaCl脅迫對玉米幼苗抗氧化酶活性的影響

逆境可使植物體內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧，而SOD、POD和CAT是清除除活性氧的重要抗氧化酶，其活性上升是提高玉米抗逆能力的重要因素。如圖7所示，受到鹽脅迫后，轉(zhuǎn)基因與陰性植株葉片中的SOD、POD和CAT均呈先上升后下降的趨勢，但轉(zhuǎn)基因植株中抗氧化酶活性顯著高于陰性植株。

2.8 NaCl脅迫下玉米幼苗RNA-seq分析

對轉(zhuǎn)基因和陰性玉米的三葉期幼苗鹽脅迫處理0 h、15 min、30 min、1 h、2 h、3 h、6 h、9 h 和 12 h的葉片進(jìn)行RNA-seq分析。首先比較各個時間點中轉(zhuǎn)基因和陰性玉米的基因表達(dá)差異，將各時間點的所有差異基因合并并去除重復(fù)基因，共得到2 139個差異表達(dá)基因，這些基因是受ABP9調(diào)控的基因。

同時，利用轉(zhuǎn)基因陰性植株的RNA-seq數(shù)據(jù)挖掘其中響應(yīng)鹽脅迫的基因，將鹽處理各個時間點的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分別與0 h的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，合并所有差異表達(dá)的基因之后共得到2 453個基因。將兩組差異基因作交集后得到1 075個基因，這些基因為受ABP9調(diào)控的且響應(yīng)鹽脅迫的基因。將這些基因進(jìn)行GO功能富集分析，發(fā)現(xiàn)這些基因顯著富集在響應(yīng)非生物脅迫及活性氧清除等生物學(xué)過程中。

選取其中一些響應(yīng)鹽脅迫上調(diào)表達(dá)且在轉(zhuǎn)基因和對照植株中表達(dá)差異倍數(shù)≥2的基因（表2）進(jìn)行qTR-PCR驗證（圖8），結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果基本一致，這些基因均是鹽誘導(dǎo)基因，且其脅迫過程中的表達(dá)在轉(zhuǎn)基因植株中相比陰性對照明顯提高。

圖7 NaCl脅迫對玉米幼苗SOD（A）、POD（B）和CAT（C）活性的影響

表2 部分差異表達(dá)基因列表

3 討論

近年來，隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷發(fā)展，應(yīng)用該技術(shù)對農(nóng)作物改良已成為培育具有優(yōu)良性狀新品種的有效途徑［18］。已有諸多報道成功獲得轉(zhuǎn)基因植株，并在提高其耐鹽性等方面有顯著成效［19-20］。在前期工作的基礎(chǔ)上，創(chuàng)制了鄭58背景的轉(zhuǎn)ABP9玉米株系，通過PCR檢測和Southern blot分析證明ABP9已成功整合到玉米基因組中，且為單拷貝形式插入。qRT-PCR分析結(jié)果顯示ABP9在轉(zhuǎn)基因株系中表達(dá)量較高。

圖8 鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因植株中差異表達(dá)基因qRT-PCR鑒定

當(dāng)植物遭受鹽脅迫時，可在生理及分子水平快速響應(yīng)，通過一系列的生理生化反應(yīng)適應(yīng)和抵御鹽害。葉綠素是對鹽脅迫敏感的光合色素，鹽脅迫會加速植物葉綠素降解，降低葉綠體對光的吸收，從而導(dǎo)致光合速率下降［21］。本研究結(jié)果顯示，鹽脅迫后轉(zhuǎn)基因和陰性對照玉米葉片的葉綠素含量下降，說明長時間高濃度的鹽脅迫導(dǎo)致葉綠素大量分解。但轉(zhuǎn)基因植株葉綠素含量顯著（P＜0.01）高于陰性植株，說明前者具有較強(qiáng)的抵御葉綠素降解的能力，進(jìn)而保持了較高的光合能力。通過葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化可以了解植物光系統(tǒng)對光能的吸收、耗散等一系列反應(yīng)，能夠反映植物受逆境影響的情況［22］。研究表明，鹽脅迫會破壞PSII、抑制光反應(yīng)活性，進(jìn)而導(dǎo)致植物光合能力降低［23］。本研究Fv/Fm測定結(jié)果顯示，隨鹽脅迫時間增加，F(xiàn)v/Fm逐漸下降，但在脅迫第5天、第7天時轉(zhuǎn)基因植株顯著（P＜0.05）高于陰性植株，說明雖然轉(zhuǎn)基因和陰性對照玉米植株光反應(yīng)活性均受到抑制，但轉(zhuǎn)基因植株的PSII活性中心受損程度較小，且具有較高光反應(yīng)活性，從而保持了較高的光能捕獲能力與轉(zhuǎn)化效率。進(jìn)一步說明鹽脅迫下，轉(zhuǎn)基因玉米植株的光合能力要高于陰性植株。

鹽脅迫對植物的危害來源之一就是滲透脅迫。高鹽導(dǎo)致環(huán)境滲透勢降低，抑制植物水分吸收或致使植物失水，造成植物生理干旱。本研究中，鹽脅迫后玉米葉片相對含水量下降，轉(zhuǎn)基因植株與陰性株之間無顯著差異，但恢復(fù)生長后，轉(zhuǎn)基因植株能夠快速吸收水分，葉片相對含水量高于陰性植株（圖4），說明其具有較高的恢復(fù)能力，推測這可能與滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累有關(guān)。研究表明，鹽脅迫后植物細(xì)胞常通過積累一些有機(jī)小分子物質(zhì)（如脯氨酸、可溶性糖等）來維持較高的細(xì)胞質(zhì)滲透壓［24］。本研究中玉米葉片中脯氨酸和可溶性糖含量受到脅迫后上升，且轉(zhuǎn)基因植株始終高于陰性。由此可見，遭受鹽脅迫后轉(zhuǎn)基因植株可以積累更多的有機(jī)調(diào)節(jié)物質(zhì)，從而提高自身對高鹽脅迫的耐受性。

鹽脅迫導(dǎo)致植物體內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧，造成膜脂過氧化，破壞細(xì)胞膜完整性［25］。MDA是膜脂過氧化作用的產(chǎn)物之一，而相對電導(dǎo)率能夠代表細(xì)胞膜透性大小，二者可以反映植物細(xì)胞膜的損傷程度［26］。本研究的結(jié)果顯示，受到鹽脅迫后，玉米葉片中MDA含量上升，在第3天時達(dá)到最高，但轉(zhuǎn)基因植株低于陰性；測定3 d時葉片相對電導(dǎo)率發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株膜透性也低于陰性株，說明在鹽脅迫條件下轉(zhuǎn)基因植株細(xì)胞膜損傷程度較小。

逆境脅迫下，植物細(xì)胞的存活與活性氧清除能力密切相關(guān)，而抗氧化酶的存在是清除活性氧的重要機(jī)制。Vijayalakshmi等［27］和 Farhangi-Abriz等［28］研究表明，鹽脅迫下植物通過提高抗氧化酶活性，能夠保護(hù)植物細(xì)胞免受氧化傷害，提高了植物的耐鹽能力。本研究測定了SOD、POD和CAT活性，在遭受鹽脅迫后抗氧化酶活性上升，且轉(zhuǎn)基因植株高于陰性植株，說明前者具有更高的活性氧清除和降低膜脂過氧化的能力。此外，有研究表明，脯氨酸等一些滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)也和植物抗氧化有關(guān)，不僅能夠維持細(xì)胞質(zhì)滲透壓，還起到保護(hù)抗氧化酶、增強(qiáng)植物蛋白穩(wěn)定性的作用［29-30］，因而本研究中轉(zhuǎn)基因植株中脯氨酸含量的提高也使轉(zhuǎn)基因植株具有更高的抗氧化能力。

本研究通過RNA-seq和qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，與陰性植株相比，轉(zhuǎn)基因植株中包括轉(zhuǎn)錄因子、熱激蛋白，抗氧化酶等大量鹽誘導(dǎo)基因的表達(dá)顯著增強(qiáng)。例如，WRKY轉(zhuǎn)錄因子，大量研究表明，其參與植物多種生理生化過程，包括應(yīng)對多種非生物脅迫、參與葉片衰老及次生代謝等［31-34］。研究中發(fā)現(xiàn)，在受到鹽脅迫后，轉(zhuǎn)基因株系中WRKY基因AC209050.3_FG003的表達(dá)能在短時間內(nèi)迅速升高，而在陰性材料中表達(dá)量變化幅度較小。熱激蛋白作為分子伴侶，能夠防止蛋白質(zhì)降解，保護(hù)細(xì)胞免受傷害，相關(guān)研究表明其在植物抗逆方面發(fā)揮著重要作用［35-37］。結(jié)果顯示，熱激蛋白基因GRMZM2G007729在轉(zhuǎn)基因株系中高表達(dá)，且上升幅度較大。此外，還有一些與抗氧化相關(guān)基因，如GRMZM2G044383、GRMZM2G074743等，在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)顯著高于陰性植株。研究表明，這些基因在活性氧清除方面起重要作用［38-39］。因此，上述抗逆基因的增強(qiáng)表達(dá)很可能是導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因玉米植株耐鹽性提高的關(guān)鍵。

4 結(jié)論

ABP9的增強(qiáng)表達(dá)提高了大量抗逆相關(guān)基因的表達(dá)，導(dǎo)致鹽脅迫下其抗氧化能力、滲透調(diào)解能力、膜完整性和光合能力的提高。