謝銀俠 王蔚然 程楠 許文濤

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100081）

核酸除了作為遺傳物質(zhì)的載體之外，還可以與一些天然存在或人工合成的小分子或離子結(jié)合，并發(fā)生構(gòu)象的改變；或是在這些靶分子的存在下，具有類似蛋白酶的催化活性，可以催化底物發(fā)生切割或連接反應(yīng)，這一類核酸稱為功能核酸（Functional nucleic acids，F(xiàn)NAs）［1-2］。FNAs 主要有兩類［3］，一類是與靶物質(zhì)結(jié)合時(shí)可發(fā)生構(gòu)象改變的適配體（Aptamer）；另一類是有酶催化活性的脫氧核酶（DNAzyme）和G-四鏈體（富含腺嘌呤的DNA所形成的四鏈體結(jié)構(gòu)）與氯化血紅素的復(fù)合物（Hemin/G4）。

近些年來(lái)，許多學(xué)者將FNAs用于構(gòu)建各種生物傳感器，包括光學(xué)生物傳感器［4-5］、壓電生物傳感器［6-7］和電化學(xué)生物傳感器［8-9］。其中，電化學(xué)功能核酸生物傳感器（Functional Nucleic Acids Elechemical Biosensors，F(xiàn)NAs-EB）由于其操作簡(jiǎn)單，便攜性，靈敏度高，特異型強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，并且在快速檢測(cè)和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)方面具有廣闊的發(fā)展前景，近年來(lái)備受青睞。

FNAs-EB的構(gòu)建包括3個(gè)過(guò)程：信號(hào)識(shí)別、信號(hào)轉(zhuǎn)換和信號(hào)輸出［10］。信號(hào)識(shí)別主要是通過(guò)具有特異性識(shí)別能力的FNAs來(lái)實(shí)現(xiàn)；信號(hào)轉(zhuǎn)換主要是通過(guò)具有電活性的電信號(hào)分子實(shí)現(xiàn)的；信號(hào)輸出主要是通過(guò)電化學(xué)工作站和相關(guān)的分析設(shè)備來(lái)完成。具有氧化還原活性的電信號(hào)分子是FNAs-EB中必不可少的信號(hào)轉(zhuǎn)換元件。核酸在電極表面的狀態(tài)、是否與靶物質(zhì)結(jié)合、單鏈還是雙鏈都可以通過(guò)這些電信號(hào)分子的轉(zhuǎn)換變成電化學(xué)信號(hào)（電流、阻抗、電位、電勢(shì)）顯示出來(lái)（圖1）。因此，電信號(hào)分子的選擇對(duì)于每一個(gè)FNAs-EB的構(gòu)建都至關(guān)重要。常用的電化學(xué)檢測(cè)方法包括差示脈沖伏安法（Differential pulse voltammograms，DPV）、 方 波伏安法（Square wave voltammetry，SWV）、循環(huán)伏安法（Cyclic voltammograms，CV）、電化學(xué)阻抗圖譜法（Electrochemical impedance spectroscopy，EIS）、安培檢測(cè)法（Amperometric detection）、線性掃描伏安法（Linear sweep voltammetry，LSV）、計(jì)時(shí)庫(kù)侖法（Chronocoulometry）、 交 流 伏 安 法（Alternating current voltammetry，ACV）、陽(yáng)極溶出伏安法（Anodic stripping voltammetry，ASV）等。

圖1 電信號(hào)的輸出形式

目前尚未發(fā)現(xiàn)有研究人員對(duì)于FNAs-EB中所使用的電信號(hào)分子進(jìn)行總結(jié)或是分類，因此，本文將電信號(hào)分子按照其化學(xué)本質(zhì)和結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行分類，共分為5大類，分別介紹了每種電信號(hào)分子的產(chǎn)生電信號(hào)的方式和電信號(hào)分子的具體應(yīng)用，并對(duì)每種電信號(hào)分子的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了說(shuō)明，最后對(duì)電信號(hào)分子的發(fā)展進(jìn)行了展望。

FNAs-EB中的電信號(hào)分子主要包括染料類、金屬有機(jī)配合物類、納米材料類、類過(guò)氧化氫酶類和有機(jī)小分子類。每一大類下都有具體的分類，具體見(jiàn)表1。該表主要從電信號(hào)分子的使用情況、電化學(xué)檢測(cè)方法、出峰電位區(qū)間以及電信號(hào)輸出信號(hào)的方式對(duì)電信號(hào)分子進(jìn)行匯總。

1 染料類電信號(hào)分子

染料類的電信號(hào)分子通常是一些具有多個(gè)苯環(huán)或者雜環(huán)的有機(jī)小分子，它們與DNA的相互作用主要是溝槽作用和嵌插作用。有平面結(jié)構(gòu)的多環(huán)芳烴（如吖啶類、吩噻嗪類、卟啉類等）可以以嵌插方式作用于DNA分子堿基對(duì)，還可以通過(guò)自身所帶的電荷與DNA發(fā)生靜電吸附作用［11］。但是，蘇木精與DNA間不是嵌插作用模式或溝槽作用模式、而是靜電作用模式［12］。

1.1 亞甲基藍(lán)

亞甲基藍(lán)（Methylene blue，MB），也稱次甲基藍(lán)，是一種芳香雜環(huán)化合物，屬吩噻嗪類染料，被用作化學(xué)指示劑、染料、生物染色劑和藥物使用。MB用作氧化還原指示劑通常用于電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)中，其產(chǎn)生電信號(hào)的方式主要有3種。

把電信號(hào)分子標(biāo)記在核酸鏈上，通過(guò)核酸構(gòu)象的改變來(lái)調(diào)節(jié)亞甲基藍(lán)和電極表面距離，從而通過(guò)峰電流或者阻抗的變化來(lái)表示靶物質(zhì)的存在與否及靶物質(zhì)的多少。Mao等［13］將MB標(biāo)記在三核酸鏈上，靶物質(zhì)的存在將適配體分離，從而導(dǎo)致三核酸的形成，MB與電極表面的距離拉近而實(shí)現(xiàn)電流的增加，其檢測(cè)限（Limit of detection，LOD）是0.86 nmol/L。這種方式是MB最常見(jiàn)的使用方式，標(biāo)記方式簡(jiǎn)單且通用，但是容易受到溶液環(huán)境的干擾且合成價(jià)格較貴。

研究表明，亞甲基藍(lán)與單雙鏈DNA（ssDNA/dsDNA）的結(jié)合能力不同，與dsDNA結(jié)合較多而與

ssDNA作用較少［14］。因此在利用FNAs進(jìn)行檢測(cè)的過(guò)程中，可以通過(guò)從ssDNA到dsDNA的轉(zhuǎn)換或是dsDNA到ssDNA的轉(zhuǎn)換而引起的電信號(hào)的變化來(lái)進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)。Yun等［15］利用鈾酰離子（UO2+）2的切割核酶和雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Hybridization chain reaction，HCR），當(dāng)靶物質(zhì)UO22+存在時(shí)，發(fā)生切割，裸露的ssDNA觸發(fā)HCR反應(yīng)，形成長(zhǎng)雙鏈，在溶液中加入MB，MB與dsDNA結(jié)合，電化學(xué)檢測(cè)有明顯電流增加。這種方法雖然使用簡(jiǎn)單，但是背景信號(hào)容易過(guò)高。

表1 電信號(hào)分子匯總表

圖2 染料類電信號(hào)分子

有研究人員將標(biāo)記在核酸鏈上的MB的通過(guò)酶切等作用釋放到溶液中，然后進(jìn)行電化學(xué)方法檢測(cè)［16］。如Liu等［17］通過(guò)形成 G4把 MB 封閉到納米介孔二氧化硅中，在堿性環(huán)境中G4結(jié)構(gòu)中打開，釋放MB到溶液中，然后進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)對(duì)甲基轉(zhuǎn)移酶活性的檢測(cè)。該方法使用較少。

1.2 結(jié)晶紫

結(jié)晶紫（Crystal violet，CV）是三苯甲烷染料家族的成員，已被廣泛用于紡織品，紙張，食品和藥物的染色，同時(shí)也是生化調(diào)查中重要的生物染色劑和探針。有研究發(fā)現(xiàn)CV具有與帶負(fù)電荷的磷酸骨架和G4環(huán)的氫鍵和陽(yáng)離子-偶極相互作用的能力。Kong等［18］則進(jìn)一步證明CV對(duì)G4的選擇性比dsDNA或ssDNA顯著。Li等［19］設(shè)計(jì)了一個(gè)利用Pb2+誘導(dǎo)富含G的序列形成G4結(jié)構(gòu)，當(dāng)CV嵌入到G4結(jié)構(gòu)中時(shí)，發(fā)生CV的還原，導(dǎo)致電流增強(qiáng)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)Pb2+的檢測(cè)，其檢測(cè)限為0.4 nmol/L。CV在功能核酸介導(dǎo)的電化學(xué)生物傳感器中使用較少，可能由于其使用范圍太窄。

1.3 乙基綠

乙基綠（Ethyl Green，EG）也屬三苯甲烷家族，是一種染料，金黃色閃光結(jié)晶，可溶于水和乙醇，由CV加入乙基制成。有研究的光譜和電化學(xué)結(jié)果表明，DNA和EG的主要相互作用模式是選擇性條件下的靜電結(jié)合［20］。Maryam等［21］利用EG作為電信號(hào)物質(zhì)基于C-Ag+-C錯(cuò)配檢測(cè)Ag+。當(dāng)Ag+存在的時(shí)候，富含C的核酸序列與之結(jié)合，使得原本與核酸鏈結(jié)合的EG部分脫去而導(dǎo)致峰電流的降低，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)Ag+的檢測(cè)，檢測(cè)限是26 pmol/L。該方法是一個(gè)陽(yáng)性組信號(hào)減小的模型，這對(duì)于其線性檢測(cè)范圍的上限是一個(gè)很大的限制。

1.4 蘇木精

蘇木精（Hematoxylin）是一種天然染料，可以和核酸鏈結(jié)合用于電化學(xué)生物傳感器中。蘇木精與單雙鏈DNA的結(jié)合能力不同，但都是與DNA鏈的大溝穴結(jié)合且更傾向于和dsDNA結(jié)合，其結(jié)合的差異性可以通過(guò)電信號(hào)的差異顯示。Aghili等［22］利用蘇木精作為電信號(hào)分子設(shè)計(jì)了一個(gè)檢轉(zhuǎn)基因的電化學(xué)生物傳感器，該方法實(shí)現(xiàn)了較高的靈敏度，其檢測(cè)限是13.0×10-15mol/L。

1.5 Hoechst 33258

Hoechst 33258，是一種熒光染料，常用于細(xì)胞中的DNA染色，可與DNA鏈中富含腺嘌呤-胸腺嘧啶（A-T）的區(qū)域，與DNA中的小溝穴結(jié)合。有研究人員把Hoechst 33258用于電化學(xué)生物傳感器中作為電信號(hào)分子［23］，Ahmed等［24］基于環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)構(gòu)建了檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米的電化學(xué)傳感器，利用Hoechst 33258的氧化產(chǎn)生的電子轉(zhuǎn)移來(lái)實(shí)現(xiàn)電信號(hào)的產(chǎn)生。Hoechst 33258在電化學(xué)生物傳感器中應(yīng)用較少，且多用于轉(zhuǎn)基因的檢測(cè)。

1.6 尼羅藍(lán)

尼羅藍(lán)（Nile blue，NB），又稱耐爾藍(lán)，尼羅藍(lán)硫酸鹽。綠色結(jié)晶性粉末，具有金屬光澤。溶于熱水呈藍(lán)色，微溶于冷水和乙醇，常用于配制酸堿混合指示劑，也用作生物染色劑。NB是具有雜環(huán)平面和剛性結(jié)構(gòu)的陽(yáng)離子吩惡嗪染料，其平面疏水性吩惡嗪部分會(huì)促進(jìn)NB嵌入到DNA螺旋的相對(duì)非平面內(nèi)部，其結(jié)合常數(shù)約10-3。NB與ssDNA的結(jié)合是通過(guò)靜電相互作用，而與dsDNA的結(jié)合是嵌入和靜電相互作用的雙重作用，根據(jù)這種結(jié)合的差異性，可以把 NB 用于 FNAs-EB 中［25］。Alipour等［26］利用NB作為電信號(hào)分子用于檢丙型肝炎病毒，NB與靶分子和探針?biāo)纬傻膁sDNA結(jié)合，導(dǎo)致NB在dsDNA上積累而實(shí)現(xiàn)電信號(hào)的增加。由于NB與單雙鏈均可結(jié)合，這種方法的背景信號(hào)會(huì)比較高。

2 金屬有機(jī)配合物類電信號(hào)分子

金屬有機(jī)配合物是指由金屬原子或離子作為中心原子或中心離子與有機(jī)配體完全或部分由配位鍵結(jié)合形成的化合物［27］。過(guò)渡金屬配合物具有低毒性，易制備，化學(xué)穩(wěn)定性好，氧化還原信號(hào)強(qiáng)，結(jié)構(gòu)靈活性高等優(yōu)點(diǎn)，因此，金屬基配合物經(jīng)常被設(shè)計(jì)用作電化學(xué)DNA雜交指示劑。對(duì)于帶負(fù)電的金屬有機(jī)配合物，它與DNA的相互作用主要是與DNA的帶負(fù)電的磷酸骨架之間的靜電排斥作用力［28-29］，如［Fe（CN）6］3-/4-。而帶正電的金屬有機(jī)配合物與DNA的相互作用方式主要是外層的靜電作用。常用于FNAs-EB的過(guò)渡金屬有機(jī)配合物主要包括：鐵類有機(jī)配合物、釕類有機(jī)配合物、銅類有機(jī)配合物、鋨類有機(jī)配合物、鈷類有機(jī)配合物等。

2.1 鐵類有機(jī)配合物

2.1.1 鐵氰化鉀和亞鐵氰化鉀 鐵氰化鉀{K3［Fe（CN）6］}，別名赤血鹽，深紅色或紅色單斜晶系柱狀結(jié)晶或粉末。亞鐵氰化鉀K4［Fe（CN）6］俗稱黃血鹽，是化學(xué)式為K4［Fe（CN）6］·3H2O的配位化合物。室溫下為檸檬黃色單斜晶體，于沸點(diǎn)分解。兩者均可溶于水。K3［Fe（CN）6］和 K4［Fe（CN）6］的酸根離子兩者本身就是一組可以發(fā)生半個(gè)氧化還原反應(yīng)的離子對(duì)，其在FNAs-EB中的應(yīng)用主要是用于EIS檢測(cè)中，通過(guò)檢測(cè)帶負(fù)電的［Fe（CN）6］3-/4-離子和帶負(fù)電的核酸的磷酸骨架的靜電排斥作用的阻抗值，然后根據(jù)EIS圖譜判斷電極表面的核酸修飾情況。Huang等［30］構(gòu)建了一個(gè)基于腺嘌呤納米線的Hg2+電化學(xué)生物傳感器，并用含［Fe（CN）6］3-/4-的溶液對(duì)核酸修飾的電極進(jìn)行表征，而Cai等［31］構(gòu)建了一個(gè)基于DNA水凝膠和切割核酶介導(dǎo)的靶循環(huán)及HCR檢Hg2+的傳感器，并用EIS直接進(jìn)行定性和定量檢測(cè)，并獲得線性檢測(cè)范圍和檢測(cè)限。

圖3 金屬有機(jī)配合物類電信號(hào)分子

2.1.2 二茂鐵及其衍生物 二茂鐵（Ferrocene，F(xiàn)c）也稱雙環(huán)茂二烯合鐵，是一種具有芳香族性質(zhì)的過(guò)渡金屬有機(jī)化合物。常溫下為橙黃色粉末，有樟腦氣味。Fc由于具有2個(gè)可以自由旋轉(zhuǎn)的環(huán)戊二烯環(huán)，能與DNA堿基產(chǎn)生疏水、堆積作用而發(fā)生溝面結(jié)合［32］。Fc作為電信號(hào)分子其產(chǎn)生電信號(hào)的方式主要是被標(biāo)記在核酸鏈的末端或者莖環(huán)核酸的一端，通過(guò)切割核酶的切割作用或是核酸鏈之間的相互作用改變Fc與電極表面之間的距離，從而實(shí)現(xiàn)電信號(hào)的改變，達(dá)到檢測(cè)的目的。Wei等［33］基于三核酸結(jié)構(gòu)和抗原抗體雜交構(gòu)建了一個(gè)檢地高辛抗體的生物傳感器，抗原抗體結(jié)合之后，三核酸結(jié)構(gòu)打開，形成莖環(huán)，F(xiàn)c與電極之間距離減小，電流增加。Zhang等［34］基于Pb2+的切割核酶和發(fā)卡的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)了一個(gè)檢Pb2+的生物傳感器，當(dāng)靶物質(zhì)Pb2+存在時(shí)，發(fā)卡的一部分被切割，F(xiàn)c遠(yuǎn)離電極，電流減小，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)Pb2+的檢測(cè)，檢測(cè)限是0.25 nmol/L。Fc作為電信號(hào)分子在FNAs-EB中使用較多，和MB一樣都是經(jīng)典的電信號(hào)分子，且會(huì)跟MB結(jié)合用在比率電化學(xué)傳感器中［35-37］，雙電信號(hào)分子的結(jié)合使用相當(dāng)于引進(jìn)了內(nèi)參，排除了背景信號(hào)的干擾。

2.2 釕類有機(jī)配合物

2.2.1 氯化六胺合釕 氯化六胺合釕（［Ru（NH3）6］Cl3）作為電信號(hào)分子主要是［Ru（NH3）6］3+起作用，其與DNA作用的主要方式是嵌入作用［38］。［Ru（NH3）6］3+只與dsDNA結(jié)合而不與ssDNA結(jié)合，它與DNA序列中帶負(fù)電的磷酸骨架靜電結(jié)合之后通過(guò)電化學(xué)方法（DPV、CV等）檢測(cè)電信號(hào)。Cui等［39］基于金納米粒子和發(fā)卡DNA構(gòu)建了檢DNA的電化學(xué)生物傳感器，當(dāng)靶序列存在的時(shí)候，將連有發(fā)卡的金納米粒子連接在電極表面，基于［Ru（NH3）6］3+進(jìn)行DPV檢測(cè)，檢測(cè)限為1×10-15mol/L。值得一提的是DNA磷酸骨架的結(jié)合會(huì)受到檢測(cè)溶液中電介質(zhì)的影響，尤其是其中的陽(yáng)離子濃度，［Ru（NH3）6］3+本身的濃度也會(huì)影響最終檢測(cè)的電信號(hào)，所以實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需要優(yōu)化［40］。

2.2.2 1，10-菲咯啉二氯化釕 1，10-菲咯啉二氯化釕{［Ru（phen）3］Cl2}在電化學(xué)檢測(cè)中的應(yīng)用主要是基于帶正電的釕配合物{［Ru（phen）3］2+}與帶負(fù)電的磷酸骨架之間的靜電吸引作用，由于DNA的單雙鏈的陰離子密度不同，可以結(jié)合的釕配合物分子的數(shù)量也不同，從而通過(guò)檢測(cè)結(jié)合在核酸鏈上的釕配合物分子的電子傳遞情況，結(jié)合的釕配合物分子越多，峰電流越大。Huang等［41］利用石墨烯，金納米棒及聚硫堇的復(fù)合物和超級(jí)三明治的放大方法設(shè)計(jì)了一個(gè)檢人乳頭瘤病毒DNA的電化學(xué)生物傳感器，當(dāng)靶物質(zhì)存在的時(shí)候引發(fā)超級(jí)三明治的發(fā)生，產(chǎn)生長(zhǎng)雙鏈，［Ru（phen）3］2+與長(zhǎng)雙鏈結(jié)合，有明顯的電流增加。Liu等［42］基于劈裂適配體設(shè)計(jì)了一個(gè)檢ATP的電化學(xué)生物傳感器，當(dāng)靶物質(zhì)ATP存在的時(shí)候形成雙鏈，［Ru（phen）3］2+與長(zhǎng)雙鏈結(jié)合引起電流的增加。這種與單雙鏈均可結(jié)合的電信號(hào)分子存在一個(gè)共性的問(wèn)題，即背景信號(hào)過(guò)高。

2.3 銅類有機(jī)配合物

銅（Cu）是價(jià)格相對(duì)低廉，化學(xué)穩(wěn)定性好和低毒性的過(guò)渡金屬，并且在電化學(xué)方面，Cu2+表現(xiàn)出合適的氧化還原電位，高的電子轉(zhuǎn)移可逆性（Cu2+/Cu+）和強(qiáng)的響應(yīng)信號(hào)。因此，它常常被選作電化學(xué)信號(hào)源，與某些功能性配體結(jié)合，然后作為生物傳感應(yīng)用的電化學(xué)探針。

2.3.1 4'-氨基苯并-18-冠醚-6-Cu2+冠醚具有與金屬離子選擇性絡(luò)合的優(yōu)異能力，因此經(jīng)常用作選擇性測(cè)定各種金屬離子的功能材料。18-冠醚-6是重要的主體冠醚，其空腔尺寸與一系列金屬離子的大小相當(dāng)，在溶液和固態(tài)中形成穩(wěn)定的“金屬空腔”型絡(luò)合物。Zhan等［43］設(shè)計(jì)了一個(gè)以4'-氨基苯并-18-冠醚-6銅（II）配合物（AbC-Cu2+）作為電信號(hào)分子的電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)花椰菜花葉病毒啟動(dòng)子（CaMV 35s），冠醚環(huán)通過(guò)羧基與氨基之間形成共價(jià)鍵連接至莖環(huán)核酸末端，而Cu2+與環(huán)之間通過(guò)配位鍵結(jié)合，此時(shí)有一個(gè)較高的電流信號(hào)產(chǎn)生，當(dāng)莖環(huán)被靶物質(zhì)打開后，電流信號(hào)降低，兩者之間的電子轉(zhuǎn)移是通過(guò)Cu2+/ Cu+產(chǎn)生的。該方法實(shí)現(xiàn)了一個(gè)較低的靈敏度，檢測(cè)限是0.060 pmol/L。這種電信號(hào)分子對(duì)于檢核酸的電化學(xué)生物傳感器具有通用性。

2.3.2 三聚氰胺-Cu2+作為具有1，3，5-三嗪骨架的氰胺三聚物，三聚氰胺（Mel）具有非常好的穩(wěn)定性和較差的電活性。即使在強(qiáng)堿性條件下，由于氨基的電氧化帶來(lái)的電化學(xué)響應(yīng)也非常弱，因此不適用于Mel的電化學(xué)分析。而Cu2+的加入可以改善其電活性，由于Mel的pKa約為6，所以中性或弱堿性條件適合于通過(guò)將亞銅離子與中性Mel配位而形成Cu-Mel絡(luò)合物。Zhu等［44］利用Cu2+與三聚氰胺的結(jié)合設(shè)計(jì)了一種可以快速檢測(cè)污染的奶制品中三聚氰胺含量的濃度。當(dāng)Mel的濃度大于Cu2+時(shí)，會(huì)形成 CuCl2（Mel）2H2O配合物；當(dāng)Cu2+濃度小于Mel的濃度時(shí)，會(huì)形成CuCl2Mel（H2O）2配合物。該檢測(cè)體系實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)限為7.92 nmol/L。Wang等［45］基于莖環(huán)結(jié)構(gòu)和Mel-Cu2+作為電信號(hào)物質(zhì)以及金納米粒子設(shè)計(jì)了檢測(cè)核酸序列的電化學(xué)生物傳感器，檢測(cè)限低至1.2×10-19mol/L。但是這種針對(duì)某種特殊非法添加物設(shè)計(jì)的檢測(cè)方法不具有通用性。

2.3.3 L-天門冬氨酸-Cu2+Cu2+與很多氨基酸具有很強(qiáng)的結(jié)合能力，Wang等［46］基于Cu2+與L-天門冬氨酸（L-Asp）結(jié)合和分子信標(biāo)設(shè)計(jì)了一個(gè)檢測(cè)DNA的電化學(xué)生物傳感器，電信號(hào)的產(chǎn)生主要來(lái)自Cu2+/Cu+之間的氧化還原反應(yīng)，其檢測(cè)限最低可達(dá)到0.17 f mol/L。這種電信號(hào)產(chǎn)生的方式也可用于其他類似的電化學(xué)生物傳感器中。

2.4 鋨類有機(jī)配合物

四氧化鋨聯(lián)吡啶［OsO4（bipy）］不與完全互補(bǔ)的雙鏈結(jié)合，且當(dāng)四氧化鋨聯(lián)吡啶［OsO4（bipy）］與ssDNA結(jié)合時(shí)，該ssDNA無(wú)法和其互補(bǔ)鏈結(jié)合，因此可用于檢測(cè)單堿基錯(cuò)配。Mix等［47］利用［OsO4（bipy）］作為電信號(hào)分子檢測(cè)實(shí)際轉(zhuǎn)基因玉米樣品，可以檢測(cè)到混合樣品中0.6%的轉(zhuǎn)基因樣品。［OsO4（bipy）］作為電信號(hào)分子使用較少，且多用于轉(zhuǎn)基因的檢測(cè)。這種與單鏈結(jié)合而不與完全互補(bǔ)的雙鏈結(jié)合的電信號(hào)分子比較少見(jiàn)，適合用于關(guān)閉型的生物傳感器的構(gòu)建。

2.5 鈷類有機(jī)配合物

1，10-鄰菲咯啉合鈷［Co（phen）3］3+被用作電化學(xué)傳感器的電信號(hào)分子，原理與［Ru（phen）3］2+類似。Wang等［48］利用［Co（phen）3］3+作為電信號(hào)分子構(gòu)建了檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆的電化學(xué)傳感器，并實(shí)現(xiàn)了1.0×10-9mol/L的檢測(cè)限。同樣，以［Co（phen）3］3+作為電信號(hào)分子設(shè)計(jì)的功能核酸電化學(xué)生物傳感器的背景信號(hào)會(huì)比較高。

3 納米材料類電信號(hào)分子

納米材料是指在三維空間中至少有一維處于納米尺寸（0.1-100 nm）或由它們作為基本單元構(gòu)成的材料。納米材料類的電信號(hào)分子的一個(gè)主要結(jié)構(gòu)特征就是具有納米級(jí)的尺度，因此具有量子尺寸效應(yīng)和表面效應(yīng)。納米材料類的電信號(hào)分子的電子轉(zhuǎn)移效率相對(duì)于其他電信號(hào)分子會(huì)高很多，因此基于納米材料類的電信號(hào)分子的電化學(xué)生物傳感器具有很高的靈敏度。

3.1 量子點(diǎn)

量子點(diǎn)（Quantum dots，QDs）是一種納米材料，電化學(xué)生物傳感器中最常用的是硒化鎘（CdSe）QD。QDs作為電信號(hào)分子主要用來(lái)標(biāo)記核酸鏈，當(dāng)識(shí)別和雜交過(guò)程結(jié)束之后，用硝酸將標(biāo)記在核酸鏈上的量子點(diǎn)溶解出Cd2+，再采用電化學(xué)方法檢測(cè)Cd2+的峰電流，根據(jù)Cd2+的濃度與靶物質(zhì)的關(guān)系得出靶物質(zhì)的濃度［49］。Tang等［50］在磁珠表面修飾了Pb2+的切割核酶序列，并利用滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)和標(biāo)記有CdS QDs的信號(hào)探針設(shè)計(jì)了檢Pb2+的電化學(xué)生物傳感器，當(dāng)Pb2+存在時(shí)發(fā)生切割從而引發(fā)滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增出來(lái)的重復(fù)序列與CdS QDs信號(hào)探針互補(bǔ)，再利用磁珠分離，硝酸溶解之后進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)，其檢測(cè)限可達(dá)7.8 pmol/L。Yang等［51］基于Ni2+的切割核酶和CdSe QDs檢測(cè)Ni2+，檢測(cè)限是6.67 nmol/L。QDs作為電信號(hào)分子具有通用性，且背景信號(hào)不高，具有很大的應(yīng)用前景。

圖4 納米材料類電信號(hào)分子

3.2 氧化石墨烯及其復(fù)合物

氧化石墨烯（Graphene oxide，GO）是石墨烯的氧化物，氧化后其表面含氧官能團(tuán)增多而使其性質(zhì)較石墨烯更加活潑。GO的親水性很強(qiáng)，而且在水中有良好的分散性。GO和還原性氧化石墨烯（Reduced graphene oxide，rGO）具有高導(dǎo)電性，生物兼容性和表面修飾功能。GO可與ssDNA通過(guò)π-π作用結(jié)合，而對(duì)于雙鏈DNA沒(méi)有該作用。GO中具有一些可還原的基團(tuán)，Park等［52］把GO作為電信號(hào)物質(zhì)，通過(guò)測(cè)量電化學(xué)還原GO的過(guò)程中產(chǎn)生的電流來(lái)檢測(cè)Hg2+濃度。但是GO和rGO更多的是與金納米粒子（AuNPs）等納米材料結(jié)合使用，用于電極的修飾，通過(guò)增加核酸探針的搭載量來(lái)實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大的作用［53-55］。使用較多，但是修飾的過(guò)程復(fù)雜且價(jià)格較高，不利于普及。

3.3 金屬有機(jī)框架

金 屬 有 機(jī) 框 架（Metal-organic frameworks，MOFs），即金屬-有機(jī)配位聚合物，它是通過(guò)配位鍵、共價(jià)鍵和分子間弱鍵（π-π堆積、范德華力、氫鍵及其他靜電作用等）將金屬離子與有機(jī)配體自組裝形成的具有無(wú)限規(guī)整并無(wú)限擴(kuò)展的周期性網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的晶體材料［56］。該類配合物有著豐富的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，較高的比表面積，金屬離子與配體間既有較強(qiáng)的成鍵作用又包含分子間弱相互作用，既整合了金屬中心的導(dǎo)電、熒光、氧化還原和催化等特性，又有著有機(jī)分子材料優(yōu)良的溶解性能、柔性及成型性能。MOFs是一種具有良好的穩(wěn)定性，巨大的孔隙率和比表面積的納米材料，在氣體儲(chǔ)存，藥物輸送和傳感器方面受到極大的關(guān)注。由于MOFs具有內(nèi)在的過(guò)氧化物酶催化活性，因此在電化學(xué)生物傳感器中也有應(yīng)用。Xu等［57］基于以Fe制備的MOFs，即MIL-101（Fe）和Pb2+適配體構(gòu)建了一個(gè)Pb2+電化學(xué)生物傳感器，MIL-101（Fe）作為電信號(hào)分子，將雙金屬銀鉑納米粒子（AgPtNPs）與之聯(lián)用，增加了其電導(dǎo)率和電催化活性，靈敏度達(dá)到0.032 pmol/L。MOFs雖具有酶的活性有利于提高靈敏度，但是其合成過(guò)程較為復(fù)雜，且修飾的過(guò)程的表征也很復(fù)雜，因此不適于常規(guī)使用。

3.4 銀納米粒子

基于銀納米粒子（AgNPs）的功能核酸電化學(xué)生物傳感器其電信號(hào)的產(chǎn)生主要是源于 Ag/AgCl之間的反應(yīng)。Tang等［58］利用在羥胺存在下T-Hg2+-T的結(jié)合將氯金酸還原，并生成金汞齊，而金汞齊可以將Ag+還原并形成AgNPs，增強(qiáng)其電化學(xué)信號(hào)，基于此設(shè)計(jì)的Hg2+電化學(xué)生物傳感器的檢測(cè)限達(dá)到0.002 nmol/L并且具有很高的特異性。Miao等［59］基于正四面體DNA和莖環(huán)結(jié)構(gòu)構(gòu)建了一個(gè)檢miRNA的電化學(xué)傳感器，并用AgNPs標(biāo)記在信號(hào)探針上，當(dāng)靶物質(zhì)存在時(shí)，打開的莖環(huán)結(jié)構(gòu)導(dǎo)致體系的電化學(xué)阻抗顯著增加，但是由于AgNPs的存在，與AgCl電極之間的氧化還原反應(yīng)使得阻抗大幅度降低，從而實(shí)現(xiàn)高靈敏度檢測(cè)miRNA，其檢測(cè)限可達(dá)0.4 fmol/L。AgNPs作為電信號(hào)分子其背景信號(hào)低，且修飾過(guò)程相對(duì)于其他的納米材料較為簡(jiǎn)單。

4 類過(guò)氧化氫酶類電信號(hào)分子

類過(guò)氧化氫酶類的電信號(hào)分子的一個(gè)主要特征就是具有氯化血紅素（Hemin）和富含腺嘌呤的核酸鏈形成的四聯(lián)體結(jié)構(gòu)（G4）組成的復(fù)合物。當(dāng)Hemin嵌入G4結(jié)構(gòu)中，該復(fù)合物（hemin /G4）會(huì)具有辣根過(guò)氧化物酶的催化活性［60］。把hemin /G4與一些底物結(jié)合會(huì)觸發(fā)一些氧化還原反應(yīng)發(fā)生，并發(fā)生電子的轉(zhuǎn)移。

圖5 hemin/G4的形成過(guò)程

4.1 Hemin /G4+H2O2 +苯胺

苯胺（An）在hemin /G4的催化活性下在H2O2溶液中即使在溫和條件下也會(huì)形成聚苯胺（PAn）。PAn是一種有用的導(dǎo)電聚合物，其優(yōu)良的導(dǎo)電性和氧化還原性在電催化和電化學(xué)傳感器領(lǐng)域得到了廣泛的研究。Zhu等［61］通過(guò)An到PAn的反應(yīng)將PAn沉積到電極表面形成納米膜，吸附核酸至電極表面，之后進(jìn)行電催化反應(yīng)以此來(lái)檢測(cè)靶DNA。Zhang等［62］基于HCR和苯胺和hemin /G4形成的長(zhǎng)納米線構(gòu)建了一個(gè)檢Pb2+的電化學(xué)生物傳感器，其檢測(cè)限可達(dá)32 pmol/L。

4.2 Hemin /G4+H2O2 +硫堇

硫堇（Thionine，TH）是一種芳香族氧化還原染料，由于其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，如高水溶性，可逆的電化學(xué)響應(yīng)和合適的氧化還原電位，已被廣泛用作電分析化學(xué)領(lǐng)域的電活性探針。Gao等［63］利用硫堇和Pb2+適配體構(gòu)建了Pb2+電化學(xué)傳感器，并利用硫堇與石墨烯的結(jié)合放大了電信號(hào)，因?qū)崿F(xiàn)了較高的靈敏度，其檢測(cè)限可達(dá)3.2×10-14mol/L，且具有良好的重建性和選擇性。Zhou等［64］基于Pb2+的脫氧核酶和hemin/G4及硫堇構(gòu)建了一個(gè)檢Pb2+的電化學(xué)傳感器。Hemin/G4復(fù)合物具有過(guò)氧化物酶活性，可以催化硫堇的氧化態(tài)與還原態(tài)之間的轉(zhuǎn)換從而產(chǎn)生電子的轉(zhuǎn)移，他們還通過(guò)金鈀雙金屬納米粒子進(jìn)行信號(hào)放大，而實(shí)現(xiàn)靈敏度的提高。

4.3 Hemin /G4

除了上述的一些與G4/hemin聯(lián)用的電信號(hào)分子之外，由于hemin本身也存在電子轉(zhuǎn)移，因此有研究人員僅用G4/hemin復(fù)合物所產(chǎn)生檢測(cè)一些靶生物分子（凝血酶，miRNA等）［65-66］。

這些基于Hemin /G4所構(gòu)建的電化學(xué)生物傳感器，首先有個(gè)問(wèn)題就是hemin本身的非特異性吸附會(huì)導(dǎo)致背景信號(hào)過(guò)高；其次，若結(jié)合了其他底物的氧化還原反應(yīng)，底物本身的特異性吸附也會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

5 有機(jī)小分子類電信號(hào)分子

有機(jī)小分子類的電信號(hào)分子是基于上述4種電信號(hào)分子分類之后，將不屬于上述4類的電信號(hào)分子歸為一類，因此它們之間沒(méi)有一個(gè)共同的特征。

5.1 蒽醌類物質(zhì)

蒽醌（Anthraquinone，AQ）是經(jīng)常用于生物分子電化學(xué)標(biāo)記的氧化還原活性分子。通過(guò)直接連接或通過(guò)乙炔或更長(zhǎng)的柔性連接物連接的多種AQ衍生物被多次用于嘌呤或嘧啶核苷的標(biāo)記，甚至通過(guò)亞磷酰胺合成化學(xué)摻入到DNA中以研究通過(guò)DNA的電荷轉(zhuǎn)移［67］。

Zhang等［68］用 AQ的衍生物，蒽醌 -2，6-二磺酸二鈉（Anthraquinone-2，6-disulfonate，AQDS）作為電活性物質(zhì)，結(jié)合金納米簇設(shè)計(jì)了檢測(cè)痕量汞的電化學(xué)生物傳感器。AQDS具有獨(dú)特的蒽環(huán)結(jié)構(gòu)，可以嵌入dsDNA中，電化學(xué)檢測(cè)中有醌/氫醌氧化還原電對(duì)的可逆雙電子轉(zhuǎn)移過(guò)程。Zhou等［69］也利用AQDS 和多孔納米金設(shè)計(jì)了檢測(cè)Ag+的電化學(xué)生物傳感器。

蒽醌-2-磺酸鈉鹽（AQMS）作為AQ的衍生物，也作為電活性物質(zhì)被用在電化學(xué)生物傳感器中。Bala等［70］把MB和AQMS作為電信號(hào)分子分別標(biāo)記在核酸上用于檢Pb2+，發(fā)現(xiàn)陰離子嵌入劑的檢測(cè)效果要比陽(yáng)離子嵌入劑MB的檢測(cè)效果好，這是因?yàn)閐sDNA和ssDNA都帶有負(fù)電荷，與陽(yáng)離子嵌入劑會(huì)因?yàn)殪o電吸引作用結(jié)合。而陽(yáng)離子嵌入劑和dsDNA之間的相互作用是靜電吸引，嵌入和可能的物理吸附的協(xié)同作用的結(jié)果。因此，會(huì)有很高的背景信號(hào)。特別是當(dāng)靜電引力成為相互作用中的主導(dǎo)力時(shí)，很難區(qū)分dsDNA和ssDNA。

值得一提的是AQDS屬于陰離子嵌入劑，其產(chǎn)生的背景信號(hào)要比陽(yáng)離子嵌入劑低。由于AQ與DNA都是帶負(fù)電的分子，因此AQ的嵌入過(guò)程很慢，但是高鹽濃度的緩沖液可以暫時(shí)屏蔽其靜電排斥而加快其嵌入。

圖6 蒽醌類電信號(hào)分子

5.2 α-環(huán)糊精和4-［4-（二甲基氨基）苯偶氮］苯甲酸

環(huán)糊精（Cyclodextrin，CD），又稱為環(huán)狀直鏈淀粉，它是由6-8個(gè)D-葡萄糖以α-1，4-糖苷鍵連接成環(huán)狀的低聚糖，分別稱為α、β或γ-環(huán)糊精。環(huán)糊精分子呈環(huán)形圓筒狀。由于具有“內(nèi)疏水，外親水”的特殊分子結(jié)構(gòu)，能作為“宿主”包絡(luò)眾多不同種類的“客體”化合物，形成包絡(luò)物。目前已經(jīng)發(fā)展成為超分子化學(xué)最重要的主體。dabcyl是最常用的深色淬滅劑之一，用于標(biāo)記寡核苷酸和多肽。它所形成的偶聯(lián)物廣泛地用于制備診斷探針，例如分子標(biāo)記和蛋白酶底物。Fan等［71］利用α-CD與dabcyl的分子識(shí)別作用和PbS納米粒子構(gòu)建了電化學(xué)生物傳感器來(lái)檢測(cè)DNA，并具有良好的選擇性，可識(shí)別單堿基錯(cuò)配。這種基于主客體識(shí)別應(yīng)用于FNAs-EB中的研究較少，而CD可與很多分子實(shí)現(xiàn)主客體識(shí)別，因此具有很廣闊的應(yīng)用前景。

6 總結(jié)與展望

本文從電信號(hào)分子的化學(xué)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)的角度把電信號(hào)分子分為5大類，包括染料類、金屬有機(jī)配合物類、納米材料類、類過(guò)氧化氫酶類和有機(jī)小分子類，并對(duì)每一大類下的不同電信號(hào)分子的電信號(hào)的產(chǎn)生方式和應(yīng)用以及優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了闡述。對(duì)于染料類的電信號(hào)分子而言，不僅具有電活性，而且具有熒光特性，這對(duì)于發(fā)展同時(shí)具有電信號(hào)和熒光信號(hào)這兩種輸出信號(hào)的生物傳感器方面具有應(yīng)用前景，但是目前染料類電信號(hào)分子使用較多的只有MB。對(duì)于金屬有機(jī)配合物類的電信號(hào)分子，根據(jù)其化學(xué)組成而言仍有很多過(guò)渡金屬可被發(fā)展為電信號(hào)分子，目前使用較多的是［Fe（CN）6］3-/4-和［Ru（NH3）6］3+，金屬有機(jī)配合物類的電信號(hào)分子有個(gè)明顯的優(yōu)點(diǎn)是無(wú)需標(biāo)記，只需要溶于溶液即可。納米材料的電信號(hào)分子由于具有良好的電子傳遞效率頗受關(guān)注，但是其合成復(fù)雜且成本較高。類過(guò)氧化氫酶類的電信號(hào)分子在使用過(guò)程中容易出現(xiàn)電極對(duì)于hemin的非特異性吸附，但是酶底物的存在可以放大電信號(hào)，因此使用也較多。有機(jī)小分子類的電信號(hào)分子還有很多，基于環(huán)糊精和dabcyl的電化學(xué)傳感器的成功構(gòu)建也說(shuō)明超分子化學(xué)在新的電信號(hào)分子發(fā)現(xiàn)具有很大的發(fā)展前景。

電信號(hào)分子的選擇直接關(guān)系到FNAs-EB的檢測(cè)限的高低、線性檢測(cè)范圍的大小、成本及應(yīng)用領(lǐng)域。因此，電信號(hào)分子的發(fā)展對(duì)于FNAs-EB發(fā)展具有很重要的推動(dòng)和促進(jìn)作用。目前文獻(xiàn)中所提到的電信號(hào)分子都存在各種各樣的問(wèn)題而導(dǎo)致其不能應(yīng)用在實(shí)際生活中的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)、實(shí)時(shí)檢測(cè)以及快速檢測(cè)。對(duì)于那些與單雙鏈均可結(jié)合的電信號(hào)分子將其用于構(gòu)建FNAs-EB，均存在背景信號(hào)過(guò)高的問(wèn)題；對(duì)于基于hemin/G4的電信號(hào)分子，hemin本身的非特異性吸附問(wèn)題所帶來(lái)的電信號(hào)對(duì)于陽(yáng)性組本身的電信號(hào)干擾太大也是目前一個(gè)亟待解決的問(wèn)題；對(duì)于一些小眾的電信號(hào)分子（三聚氰胺-Cu2+、CV等），它們使用的局限性導(dǎo)致其通用性有限。這些問(wèn)題目前是構(gòu)建FNAs-EB亟待解決的問(wèn)題，解決這些問(wèn)題對(duì)于功能核酸介導(dǎo)的電化學(xué)生物傳感器的發(fā)展將是一個(gè)很大的突破。

目前，基于功能核酸的電化學(xué)生物傳感器存在著一個(gè)很大的問(wèn)題就是核酸在界面修飾的不穩(wěn)定性問(wèn)題，這種不穩(wěn)定性主要來(lái)源于非均相界面的特異性吸附導(dǎo)致無(wú)法確保核酸鏈在電極表面處于直立狀態(tài)；再者，ssDNA是非剛性的結(jié)構(gòu)，在電極表面的形態(tài)也具有不確定性。這些不確定性導(dǎo)致產(chǎn)生的電信號(hào)的不穩(wěn)定性，同時(shí)也導(dǎo)致所構(gòu)建的電化學(xué)生物傳感器不具有可重復(fù)性。解決電化學(xué)的穩(wěn)定性問(wèn)題對(duì)于電化學(xué)生物傳感器的發(fā)展將是一個(gè)質(zhì)的飛躍。很多學(xué)者通過(guò)改變?cè)陔姌O表面固定的核酸的結(jié)構(gòu)來(lái)提高電極的穩(wěn)定性，如Li等［72］把具有剛性結(jié)構(gòu)的DNA納米結(jié)構(gòu)（正四面體DNA）固定在電極表面以降低電極表面的非特異性吸附和提高電極的穩(wěn)定性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明電極表面固定正四面體DNA可以降低背景信號(hào)。電信號(hào)分子同樣是FNAs-EB的重要組成部分，能否通過(guò)對(duì)于電信號(hào)分子進(jìn)行化學(xué)修飾來(lái)改善電極的穩(wěn)定性也是我們需要探究的地方。

目前文獻(xiàn)中所提到的電信號(hào)分子既有無(wú)機(jī)分子，又有有機(jī)分子；既有普通材料又有納米材料。電信號(hào)分子的多樣性為電化學(xué)生物傳感器的多重檢測(cè)提供了可能，可以利用不同電信號(hào)分子的出峰電位不同開發(fā)用于多重檢測(cè)的電化學(xué)生物傳感器，也可以利用電信號(hào)分子產(chǎn)生電信號(hào)的方式的差異性來(lái)進(jìn)行多重傳感設(shè)計(jì)。

微型電極是近些年來(lái)比較熱門的一個(gè)話題，微型電極的發(fā)展對(duì)于發(fā)展用于快速檢測(cè)、現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的電化學(xué)生物傳感器至關(guān)重要。而微型電極由于其“微”的特性，其表面可以修飾的核酸的量便受到了限制，因此電極材料就必須選擇比表面積大且能夠更多地搭載核酸的材料，因此多孔的納米材料（石墨烯或氧化石墨烯等）就成為一個(gè)優(yōu)先選擇。除了電極材料之外，選擇適用于微型電極的電信號(hào)分子也是增強(qiáng)其電信號(hào)提高靈敏度的一種方法。微型電極的發(fā)展是將電化學(xué)生物傳感器用于高通量檢測(cè)、細(xì)胞檢測(cè)或體內(nèi)檢測(cè)前提。因此，尋找更適合微型電極的電信號(hào)分子至關(guān)重要。

目前，關(guān)于電信號(hào)分子的專門研究仍較少，而且很多具有氧化還原電活性的信號(hào)分子尚未被應(yīng)用在電化學(xué)中。很多過(guò)渡金屬離子具有多種價(jià)態(tài)，將其與環(huán)狀分子（如環(huán)糊精）結(jié)合構(gòu)建新的電信號(hào)分子是有可能的；對(duì)于一些有顏色變化的氧化還原反應(yīng)，如果可以將其用作電信號(hào)分子，可實(shí)現(xiàn)可視化與電信號(hào)的兩種輸出方式；許多金屬有機(jī)配合物離子尚未被應(yīng)用于電化學(xué)領(lǐng)域中，篩選出具有電化學(xué)活性的其他金屬有機(jī)配合物離子作為電信號(hào)分子也有可能。電信號(hào)的產(chǎn)生主要是發(fā)生了氧化還原反應(yīng)，因此，那些可發(fā)生氧化還原反應(yīng)且可以與核酸作用的化學(xué)小分子都有可能應(yīng)用在FNAs-EB中，這在發(fā)展低成本的電化學(xué)生物傳感器方面具有廣闊前景。