竇雯 李尤 逯欣宇 錢雪梅 沈丹宇

（1. 南京外國語學(xué)校，南京 210008；2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，南京 210095）

全球大規(guī)模商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因作物（Genetically modified crops，GMC）自從1996年以來已有20多年的時間，種植面積現(xiàn)已經(jīng)累計達到23億hm2，涉及大豆、玉米、棉花和油菜等多種作物［1-2］。而在我國允許商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)基因作物只有轉(zhuǎn)基因抗蟲棉花和抗病毒番木瓜［3］。大豆是我國重要的糧食油料作物，同時大豆在榨油后的豆粕也是重要動物飼料來源［4］。我國是大豆消費大國，需求量從1990年的1 100萬t增加到2015年的9 300萬t［5］。但我國種植的大豆總產(chǎn)量遠遠不能滿足國內(nèi)需求，從1996起就開始大規(guī)模進口。據(jù)不完全統(tǒng)計，我國大豆的進口量從1996年的111萬t持續(xù)增加到2017年的近億噸，其中主要是從巴西、美國和阿根廷進口的轉(zhuǎn)基因大豆［6-7］。盡管目前中國還沒有開放轉(zhuǎn)基因大豆的商業(yè)化種植，但每年進口的轉(zhuǎn)基因大豆已經(jīng)占據(jù)了我國大豆市場的90%［8］。按照國家規(guī)定進口轉(zhuǎn)基因大豆只能作為榨油和飼料用途，而日常消費直接食用的大豆為非轉(zhuǎn)基因大豆。因此，開發(fā)轉(zhuǎn)基因大豆的快速檢測方法對轉(zhuǎn)基因大豆的實時監(jiān)控具有重要意義。

所謂的轉(zhuǎn)基因大豆就是將所需的外源目的基因通過一定的途徑轉(zhuǎn)入到大豆基因組中，與基因組整合并能穩(wěn)定地遺傳和表達，從而改造大豆的生物學(xué)性狀［9］。目前轉(zhuǎn)基因大豆品種主要有抗除草劑、改良大豆油脂的、抗蟲的和復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因大豆［10］。耐除草劑大豆品種含有特異性的抗草甘膦、抗草胺磷或抗磺酰脲類等除草劑的目的基因，能夠高效地去除雜草又確保作物安然無恙［11］。抗蟲的轉(zhuǎn)基因大豆將蘇云金桿菌的殺蟲蛋白Bt基因或其他殺蟲基因轉(zhuǎn)入到大豆基因組中，使得這些轉(zhuǎn)基因大豆能夠有效地預(yù)防害蟲的發(fā)生。復(fù)合性狀的轉(zhuǎn)基因大豆就是把以上兩個或幾個基因同時整合到大豆中［10］。由于這些轉(zhuǎn)基因大豆比非轉(zhuǎn)基因大豆具有出油率高和價格便宜等諸多優(yōu)勢，因此自1996年轉(zhuǎn)基因大豆商業(yè)化種植以來，全球轉(zhuǎn)基因大豆的種植面積連年持續(xù)增加［12］，而我國轉(zhuǎn)基因大豆尚處于前期研究階段，并沒有實際的商業(yè)種植［13］。

根據(jù)檢測原理的不同，目前常用的轉(zhuǎn)基因植物檢測技術(shù)主要有兩大類：一類為蛋白水平的檢測方法，如免疫試紙條法、蛋白質(zhì)芯片和酶聯(lián)免疫吸附法等［14］；另一類為核酸水平上的鑒定方法，如PCR以及PCR相關(guān)的檢測技術(shù)，還有核酸雜交和基因芯片等方法［15］。蛋白質(zhì)水平的檢測是基于所轉(zhuǎn)的目的基因在轉(zhuǎn)基因植株中得到了表達，通過檢測這些蛋白的存在來確定轉(zhuǎn)基因。由于這些鑒定方法只適用于新鮮的和未加工過的轉(zhuǎn)基因材料，并且當(dāng)轉(zhuǎn)入的基因表達量低時也無法檢測，因此這些方法并未得到廣泛采用。DNA水平上的檢測方法主要是基于PCR反應(yīng)，但這些檢測方法都需要熱循環(huán)PCR儀，實驗程序復(fù)雜并且檢測時間較長，難以滿足非實驗室條件下的快速篩查和檢測的需求［16］。最近幾年出現(xiàn)了恒溫條件下的等溫擴增技術(shù)，其中研究較熱的一個技術(shù)就是環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）［17］。LAMP 檢 測 方法快速，能在恒溫65℃下完成整個反應(yīng)且實現(xiàn)了在反應(yīng)管中肉眼對反應(yīng)結(jié)果的判讀，已經(jīng)成功應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因大豆的檢測，但仍然需要恒溫加熱設(shè)備［18］。

重組酶聚合酶擴增技術(shù)（Recombinase polymerase amplification，RPA）是2006年 Piepenburg等［19］研發(fā)出的一種等溫擴增技術(shù)，它能在37-42℃恒溫條件下快速完成數(shù)十億DNA擴增［20］。RPA反應(yīng)體系中主要包括重組酶（uvsX）、單鏈結(jié)合蛋白（Gp32）和鏈置換DNA聚合酶Bsu，其反應(yīng)原理不同于體外DNA復(fù)制的PCR技術(shù)，重組酶uvsX在常溫下就能打開DNA雙鏈進行變性，因此不需要熱循環(huán)PCR儀［21-22］。RPA反應(yīng)技術(shù)靈敏度高，反應(yīng)快速，并且通過試紙條可以直接進行觀察，方法簡便易行。因此，本文的目的是建立一個轉(zhuǎn)基因大豆的RPA快速檢測技術(shù)，利用試劑條顯色反應(yīng)實現(xiàn)肉眼鑒定樣品中是否含有轉(zhuǎn)基因成分，并對日常接觸到的大豆食品和種植的大豆進行初步應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗中所需的引物由金斯瑞生物科技有限公司合成并提供。待檢測的豆芽、新鮮毛豆和大豆植株是隨機從市場購買或田間采集。作為陽性對照的轉(zhuǎn)基因大豆，含有花椰菜花葉病毒CaMV35S啟動子和根癌農(nóng)桿菌NOS終止子序列的轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒載體pBinGFP2 DNA（50 ng/μL）由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植保學(xué)院提供。

1.2 方法

1.2.1 大豆材料基因組DNA提取 各種大豆材料的基因組DNA提取均采用“DNAsecure新型植物基因組DNA提取試劑盒 ”（天根，北京，貨號DP320），并按使用說明書操作。

1.2.2 PCR擴增和反應(yīng)產(chǎn)物的檢測 PCR試劑盒購自諾唯贊（Vazyme），貨號為P505-d1/d2/d3。50 μL 反應(yīng)體系中包括 25 μL 2×Phanta Max Buffer、1 μL dNTP Mix、1 μL Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase、2 μL DNA 模板，10 μmol/L 上下游引物各 2.0 μL。PCR 反應(yīng)程序為 ：95℃ 預(yù)變性 3 min；95℃變性15 s，63℃退火 15 s，72℃延伸 30 s，35次循環(huán)；72℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后取出PCR 管，對PCR 擴增產(chǎn)物進行2% 瓊脂糖電泳檢測。

1.2.3 RPA引物的設(shè)計 現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因作物中大都有花椰菜花葉病毒CaMV35S啟動子和根癌農(nóng)桿菌NOS終止子［10］，通過對這些保守DNA序列分析可以設(shè)計RPA引物。RPA引物長度一般在30-35 nt，擴增片段長度最好在100-200 bp，利用Primer3軟件（http：//primer3.ut.ee/），設(shè)計了5對RPA引物用作RPA試劑條引物的初步篩選（表1）。

表1 RPA試劑條檢測引物設(shè)計及序列

1.2.4 RPA試劑條引物和探針設(shè)計 RPA反應(yīng)體系包括一對特異性引物和一條nfo探針，其中下游引物修飾有生物素B，nfo探針修飾有fluorescein isothiocyanate熒光素FITC。根據(jù)Nos終止子以及Nos163引物的序列，我們設(shè)計了Nos163的RPA引物和探針，序列見表2。如果反應(yīng)體系中的模板DNA為轉(zhuǎn)基因大豆基因組DNA，擴增產(chǎn)物會含有生物素B和FITC，擴增產(chǎn)物通過毛細作用從試紙條的加樣點由下而上流動時，試紙條上會顯現(xiàn)control band 和test band兩條條帶。當(dāng)為非轉(zhuǎn)基因模板DNA或其他DNA時，試紙條上只顯示control band一條帶。

1.2.5 RPA試劑條檢測反應(yīng) RPA試劑盒（TwistAmp nfo）和 Milenia Hybridtech 1 strips（no nfo kits）試紙條均購自南京沃博生物科技有限公司，貨號分別為TANFO02KIT和MILENIA01。RPA反應(yīng)體系按試劑盒說明書進行混合，為了保證反應(yīng)同時進行，2.5 μL 280 mmol/L醋酸鎂溶液應(yīng)該最后加在八連管的蓋子上，小心翻轉(zhuǎn)蓋上，然后上下顛倒八連管混勻，離心。整個操作過程要在冰上進行。RPA反應(yīng)在39℃恒溫下反應(yīng)4 min后，取出反應(yīng)管進行渦旋震蕩，點動離心，再在39℃恒溫下反應(yīng)26 min，反應(yīng)結(jié)束后取5 μL擴增產(chǎn)物滴加至試紙條檢測區(qū)，再將95 μL試紙條檢測buffer加入到1.5 mL EP管中，最后將試紙條垂直放入試紙條檢測buffer中，以質(zhì)控線出現(xiàn)明顯條帶即可，3 min左右，待試紙條晾干后拍照。

表2 轉(zhuǎn)基因大豆的RPA試紙條引物和探針序列

2 結(jié)果

2.1 PCR篩選特異性RPA引物

為了篩選特異性且擴增效率高的RPA檢測引物，我們首先利用常規(guī)PCR技術(shù)對5對RPA引物分別進行擴增，陽性對照模板DNA為含有CaMV35S啟動子和NOS終止子的質(zhì)粒載體pBinGFP2 DNA（50 ng/μL），陰性對照采用超純水。如圖1所示，引物35s266和35s157對pBinGFP2 DNA擴增出兩條或兩條以上的條帶（3和9），但從水中也擴增出條帶（4），說明有污染。Nos183擴增的產(chǎn)物條帶（1）較弱擴增效率低，且陰性對照條帶有污染（2）。而Nos156和Nos163引物條帶清晰（5和7）且沒有污染（6和8），說明用Nos156和Nos163引物擴增DNA反應(yīng)特異性強能夠產(chǎn)生單一的條帶，且擴增效率高，產(chǎn)物濃度高，因此選擇這2對引物進行后續(xù)的RPA檢測。

圖1 五對RPA引物的常規(guī)PCR檢測

2.2 PCR檢測RPA引物靈敏度

為了進一步檢測引物Nos156和Nos163反應(yīng)的靈敏性，分別利用稀釋后不同濃度的質(zhì)粒pBinGFP2DNA作為模板進行PCR反應(yīng)，如圖2所示引物Nos163的PCR反應(yīng)比Nos156更為敏感，在相同template DNA濃度下，PCR條帶更為明顯，因此我們最終選擇Nos163引物用來設(shè)計RPA試劑條。

圖2 引物Nos156和Nos163的PCR靈敏度檢測

2.3 RPA試劑條檢測體系的建立與優(yōu)化

2.3.1 RPA檢測反應(yīng)體系的簡單優(yōu)化

為了進一步優(yōu)化RPA反應(yīng)體系，以質(zhì)粒載體pBinGFP2作為模板DNA進行了不同溫度和反應(yīng)時間的試劑條檢測，如圖3-A所示，RPA體系反應(yīng)溫度為25-45℃，但最合適的反應(yīng)溫度為大約40℃。反應(yīng)時間圖3-B所示從10 min-50 min都可以進行，最適合的反應(yīng)時間大約為40 min。

圖3 RPA反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間的優(yōu)化

2.3.2 RPA體系與常規(guī)PCR靈敏度的比較 以轉(zhuǎn)基因大豆基因組DNA作為模板，反應(yīng)溫度為39℃，時間為40 min進行RPA反應(yīng)，實驗結(jié)果見圖4-A所示隨著模板DNA濃度的降低，RPA條帶濃度逐漸減弱，當(dāng)模板DNA濃度從100 pg-100 ag 時，RPA方法都能檢測出轉(zhuǎn)基因DNA。利用同樣濃度的轉(zhuǎn)基因大豆DNA進行PCR反應(yīng)，結(jié)果如圖4-B所示，只有DNA為1 ng時PCR才能檢測出轉(zhuǎn)基因DNA的存在。PCR和RPA方法比較說明RPA反應(yīng)靈敏度更高，在模板DNA濃度微量時（＜ 1 ng）RPA檢測比PCR方法具有顯著的檢測優(yōu)勢。

2.4 RPA檢測體系的實際應(yīng)用

為驗證上述RPA技術(shù)的實用性，選取市場銷售的豆芽菜，新鮮毛豆夾以及田間采摘的大豆樣品共6種材料進行檢測，實驗過程中以2株已確定轉(zhuǎn)基因的大豆作為陽性對照和1株已知非轉(zhuǎn)基因大豆為陰性對照，結(jié)果（圖5-A）顯示，兩株轉(zhuǎn)基因大豆（Transgenic1和2）均顯示明顯的兩條帶，為陽性，而非轉(zhuǎn)基因大豆（WT）只有一條帶，為陰性。所有的大豆樣品均為陰性，顯示為非轉(zhuǎn)基因，說明南京周邊檢測到的市售大豆新鮮產(chǎn)品和種植的大豆沒有轉(zhuǎn)基因成分?，F(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因大豆檢測技術(shù)中最常用的為PCR，為了驗證RPA檢測體系的準(zhǔn)確性，我們利用這些樣品進行PCR檢測，結(jié)果（圖5-B）顯示，只有兩株轉(zhuǎn)基因大豆（Transgenic 1和Transgenic 2）顯示為陽性，其他樣品均為陰性，此結(jié)果與RPA檢測相一致，進一步證明RPA技術(shù)的可靠性。

圖4 RPA反應(yīng)體系與常規(guī)PCR靈敏度比較

圖5 RPA和PCR檢測豆芽菜和大豆樣品

3 討論

轉(zhuǎn)基因大豆的大量進口和使用，對于緩解我國大豆短缺的問題具有重要意義，同時對進口轉(zhuǎn)基因大豆的監(jiān)控提出新的挑戰(zhàn)。為了防止轉(zhuǎn)基因大豆國內(nèi)的非法種植和流通，因此迫切需要簡便可行的轉(zhuǎn)基因大豆快速檢測方法。

現(xiàn)已建立的轉(zhuǎn)基因大豆檢測方法主要包括PCR和實時定量熒光PCR［25-26］。但這些方法都需要PCR儀或?qū)崟r定量熒光PCR儀以及瓊脂糖電泳，操作繁瑣，檢測過程長達幾個小時，不適合實時快速監(jiān)測。環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法是近年來應(yīng)用較多的不依賴于復(fù)雜昂貴的儀器設(shè)備、簡便快速DNA檢測方法，并已應(yīng)用于大豆的檢測［27］。但環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法需60-65℃等溫條件，并要設(shè)計4種引物。根據(jù)現(xiàn)有轉(zhuǎn)基因大豆檢測上的優(yōu)缺點和RPA技術(shù)不需要專門的儀器，常溫下能進行目的基因特異性擴增的優(yōu)勢，本研究設(shè)計建立轉(zhuǎn)基因大豆的RPA試劑條快速檢測技術(shù)，通過對不同濃度的轉(zhuǎn)基因大豆基因組DNA擴增實驗結(jié)果表明，該方法比常規(guī)PCR方法更靈敏，在微量的模板DNA濃度下（＜1 ng），PCR無法檢測時RPA也能檢測到轉(zhuǎn)基因DNA的存在。同時利用此方法對市場隨機購買的豆芽和毛豆樣品以及田間種植的大豆樣品進行檢測，未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因大豆的存在，此結(jié)果和常規(guī)PCR檢測結(jié)果一致，進一步證明了本體系的可靠性和準(zhǔn)確性。與環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法相比本方法具有無需恒溫加熱儀器的優(yōu)點，RPA可以在25-45℃之間反應(yīng)，簡單的保溫杯或人體溫度甚至常溫就可以實現(xiàn)。同時RPA的引物設(shè)計簡單和PCR引物設(shè)計方法相似，無需復(fù)雜的分析，而環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法需要設(shè)計4種引物。總之，本文中的轉(zhuǎn)基因大豆RPA快速檢測方法具有常溫下反應(yīng)靈敏度高和結(jié)果可靠等優(yōu)勢，可以用于國內(nèi)大豆的監(jiān)控。

4 結(jié)論

本研究建立的轉(zhuǎn)基因大豆的RPA試劑條快速分子檢測方法，簡便易操作，無需PCR和電泳儀等昂貴的實驗器材，檢測周期短，試劑條結(jié)果肉眼可見。應(yīng)用此方法初步檢測南京市田間和市場大豆，在待檢測的樣品中沒有發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因成分。