白 天，何葉艷，高旭龍，趙阿勇，何 珂

（浙江農(nóng)林大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，浙江 杭州 311300）

網(wǎng)紋蟒Python reticulatus屬于蛇亞目Serpentes原蛇附目Henophidia蟒科Pythonidae，廣泛分布于東南亞，在印度尼西亞存在海島變體［1］，其皮張被認(rèn)為是皮毛產(chǎn)業(yè)奢侈品的來源，是東南亞重要的經(jīng)濟(jì)自然資源。目前，該物種被世界自然保護(hù)聯(lián)盟評(píng)估為易危等級(jí)（vulnerable species，VU）［2］，屬于瀕危動(dòng)植物種國際貿(mào)易公約附錄Ⅱ物種。受捕獵影響，該物種在東南亞各國不同地區(qū)的種群遺傳多樣性已遭到破壞，亟待有計(jì)劃的種群復(fù)蘇和保護(hù)工作［3］。蛇類進(jìn)化歷史久遠(yuǎn)，生存環(huán)境復(fù)雜多樣，但其形態(tài)特征相對(duì)較為保守，加上趨同進(jìn)化，造成可用于蛇類系統(tǒng)學(xué)研究的形態(tài)方面信息較少，因此，依據(jù)形態(tài)學(xué)信息很難解決蛇類系統(tǒng)關(guān)系。生物分子所具有的信息量大、完全不相同、較為真實(shí)記錄生物進(jìn)化信息等特點(diǎn)，可彌補(bǔ)形態(tài)學(xué)信息的不足，越來越多地被應(yīng)用到蛇類系統(tǒng)發(fā)生的研究中［4］。研究認(rèn)為：作為一個(gè)與能量代謝有關(guān)的細(xì)胞器，真核生物的線粒體具有相對(duì)獨(dú)立的遺傳物質(zhì)即線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA），研究線粒體基因組并利用線粒體DNA全序列分析進(jìn)行系統(tǒng)建樹，能夠克服單個(gè)基因僅能帶來的有限信息，更加全面地揭示物種進(jìn)化與系統(tǒng)發(fā)生。目前關(guān)于網(wǎng)紋蟒的分子生物學(xué)研究僅集中在幾個(gè)線粒體基因相關(guān)的系統(tǒng)分析上［3］，在線粒體全基因組方面上存在欠缺。本研究擬采用無損傷性取樣，提取網(wǎng)紋蟒線粒體DNA，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增拼接得到線粒體基因組全序列，以評(píng)估非入侵式采樣在蛇類研究中的可行性；以網(wǎng)紋蟒線粒體基因組序列信息和結(jié)構(gòu)特征分析為依據(jù)，結(jié)合GenBank中近緣物種（蟒科，蚺科Boidae和閃鱗蛇科Xenopeltidae）已發(fā)現(xiàn)的線粒體基因組序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，探討蛇亞目的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系，并結(jié)合蛇亞目線粒體基因組不同的排列順序來討論蛇亞目線粒體基因組的重排。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品

試驗(yàn)所用網(wǎng)紋蟒的蛇蛻和新鮮糞便均來源于杭州動(dòng)物園，于每日喂食時(shí)觀察并收集得到。糞便用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇浸泡，蛇蛻用體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇固定，帶回實(shí)驗(yàn)室后保存于-20℃的冰箱中備用。

1.2 基因組DNA的提取

糞便樣品分剝離表面和內(nèi)層部分2種，蛇蛻樣品剪碎后一部分室溫下研磨，另一部液氮研磨至粉碎。各樣品取3次重復(fù)，基因組DNA提取參考文獻(xiàn)［5］方法。經(jīng)NanoDropTM3300檢測(cè)計(jì)算質(zhì)量濃度和純度D（260）/D（280）。

1.3 片段擴(kuò)增

根據(jù)親緣物種的線粒體基因組序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，采用高保真酶（PhantaSuper Fidelity DNA Polymerase，諾唯贊，南京）進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳確定大小符合要求時(shí)，交由上海博尚生物公司測(cè)序。若PCR產(chǎn)物呈現(xiàn)多條帶，則采用割膠回收試劑盒獲取目的大小片段，用pMD-19T質(zhì)粒（TaKaRa，大連）連接，選取陽性克隆后送出測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

（1）網(wǎng)紋蟒線粒體基因組各基因、tRNA長度和基因起始密碼子分析。用Dnastar軟件包拼接測(cè)序序列， 用 tRNA scan（http：//lowelab.ucsc.edu/tRNAscan-SE/）確定 tRNA 的位置和類型， 采用 OGDRAW（https：//chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/OGDraw.html）繪制網(wǎng)紋蟒線粒體結(jié)構(gòu)及基因結(jié)構(gòu)圖。在分析過程中，網(wǎng)紋蟒記為 RP，以蟒科的緬甸蟒Python bivittaus（PB，NC_021479），印度蟒Python molurus（PM，NC_015812）和球蟒Python regius（PR， NC_007399）作為對(duì)比。 （2）根據(jù)相關(guān)基因、 控制區(qū)（control region）和線粒體基因組全序列建樹分析蟒科、蚺科和閃鱗蛇科的進(jìn)化關(guān)系。用Mega 5.0軟件［6］比對(duì)序列及構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，蟒科物種為緬甸蟒、印度蟒和球蟒，蚺科物種為紅尾蚺Boa constrivtor（BC，NC_007398）和玫瑰蚺Charina trivirgat a（CT， GQ200595）， 閃鱗蛇科物種為閃鱗蛇Xenpeltis unicolo r（XU，NC_007402），以原蛇亞目的圓環(huán)蛇Anilius scytale（AS，GQ200593）作為外類群。（3）蛇類具有多種線粒體結(jié)構(gòu)排布次序，采用OGDRAW軟件繪制各蛇類線粒體基因結(jié)構(gòu)圖可清楚地分析線粒體基因在進(jìn)化過程中的變動(dòng)。對(duì)分屬不同科屬的11個(gè)物種構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，分別為緬甸蟒、球蟒、紅尾蚺、閃鱗蛇和存在1個(gè)控制區(qū)和tRNA-WQANCY基因簇的細(xì)盲蛇科Leptotyphlopidae物種西南細(xì)盲蛇Rena humilis（RH，NC_005961），含有2個(gè)控制區(qū)和存在tRNA-P復(fù)制的蝰科Viperidae物種沖繩烙鐵頭Ovophis okinavensis（OO，NC_007397）和美洲蝮Agkistrodon piscivorus（AP，EF669477），含有2個(gè)控制區(qū)和存在tRNA-P復(fù)制的游蛇亞科Colubridae物種北美玉米蛇Pantherophis slowinskii（PS，NC_009769）和半棱鱗鏈蛇Dinodon semicarinatus（DS，NC_001945），rRNA 長度存在增加和含有 tRNA-L（Q）M和 tRNA-W（ANCY）結(jié)構(gòu)的疣鱗蛇科Acrochordidae物種疣鱗蛇Acrochordus granulatus（AG，NC_007400）和管蛇科Cylindrophiidae物種紅尾管蛇Cylindrophis ruffus（CR， NC_007401）。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品基因組檢測(cè)

對(duì)提取到的DNA的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，蛇蛻樣品DNA質(zhì)量濃度最高，糞便表層次之，糞便內(nèi)層最低；糞便內(nèi)層樣品D（260）/D（280）最高， 說明樣品 DNA 純度較差， 其他樣品的D（260）/D（280）均為 1.7～1.8， 符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求（表1）。PCR擴(kuò)增試驗(yàn)顯示：室溫或液氮研磨，蛇蛻樣品中提取的基因組DNA均能擴(kuò)增出長度為1 000～1 500 bp的片段；而來源于糞便表層或內(nèi)層樣品的基因組擴(kuò)增得到700～1 000 bp片段和1 000～1 500 bp片段的效果均不佳。

表1 所采用的樣品類型提取DNA和擴(kuò)增情況Table 1 Genomic DNA extracted from different types of samples and the success rate of PCR

2.2 蟒科蛇類線粒體基因組分析

對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序和序列拼接，得到長度為17 641 bp的網(wǎng)紋蟒線粒體基因組完整序列（GenBank：MH410033）（圖1），序列含2個(gè)rRNA基因，13個(gè)編碼區(qū)，22個(gè)tRNA基因和2個(gè)控制區(qū)（表2）。其中重鏈編碼28個(gè)基因，輕鏈編碼9個(gè)基因。包含的2個(gè)rRNA基因（12S rRNA和16S rRNA）位置和其余蛇類相同。除了NADH6（ND6）之外，其余12個(gè)蛋白編碼基因均位于重鏈上；所有蛋白基因都沒有內(nèi)含子，但和相鄰的基因存在少許重疊或間隔。發(fā)現(xiàn)的22個(gè)tRNA基因存在蛇類特有的LQM和WANCY基因簇。2個(gè)控制區(qū)位于非編碼區(qū)，長度分別為1 271和1 196 bp，序列相似度為96.68%。

對(duì)蟒科物種相關(guān)基因的長度、起始密碼子和終止密碼子的分析發(fā)現(xiàn)，4個(gè)物種之間存在較高的同源性。網(wǎng)紋蟒的NADH2（ND2）終止密碼子和ATP8起始密碼子與其他物種不同，是物種所特有的；NADH6（ND6）基因變異最大，起始密碼子僅2個(gè)物種一致，終止密碼子緬甸蟒不同于其余3個(gè)物種。COX2基因和NADH1（ND1）較為保守，前者4個(gè)物種均以TA為終止密碼子，后者則使用單堿基T作為不完全終止密碼子。

表2 蟒科蛇類的線粒體蛋白質(zhì)基因長度、起始密碼子、終止密碼子和rRNATable 2 Comparion of length,start codon and stop codon in Pythonidae

圖1 網(wǎng)紋蟒線粒體基因組結(jié)構(gòu)示意圖圖1 Schematic diagram of mitochondrial genome structure in Python reticulatus

圖2 蟒科、閃鱗蛇科和蚺科的系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 2 Phylogenetic relationship between Pythonidae,Xenopeltidae and Boidae

2.3 蟒科和蚺科物種進(jìn)化分析

利用相關(guān)基因、控制區(qū)和線粒體基因組全序列構(gòu)建系統(tǒng)樹。分析發(fā)現(xiàn)：用蛋白基因構(gòu)建的系統(tǒng)樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)較為相近；以Cytb基因?yàn)槔▓D2A），蟒科物種聚集的支持率為97%（PR，PM，PB和RP枝），就親緣關(guān)系而言，閃鱗蛇科（XU）比蚺科（BC和CT）更接近蟒科（圖2A）。用線粒體基因組全序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹則表明：蟒科（PR，PM，PB和RP枝）和蚺科（BC和CT枝）各自聚為一枝，支持率都為100%；同樣，閃鱗蛇科比蚺科更接近蟒科（支持率99%）（圖2B）。由于數(shù)據(jù)庫中玫瑰蚺（CT）的2個(gè)控制區(qū)長度僅為288和553 bp，和其他數(shù)據(jù)存在明顯差異，因此刪除該序列后對(duì)其他7個(gè)物種進(jìn)行基于控制區(qū)的系統(tǒng)樹構(gòu)建。分析發(fā)現(xiàn)：各物種的2個(gè)獨(dú)立的控制區(qū)均先聚類，物種間的控制區(qū)聚類關(guān)系表明蟒科的支持率為100%，而閃鱗蛇、蚺科和圓環(huán)蛇則為另外一分支（圖2C）。以上結(jié)果表明：來源于同個(gè)物種的控制區(qū)相似度更高；相較于蚺科，閃鱗蛇科和蟒科的進(jìn)化關(guān)系更接近。

2.4 蛇亞目物種線粒體結(jié)構(gòu)排步分析

和其他脊椎動(dòng)物線粒體基因組全序列的比較發(fā)現(xiàn)，蛇亞目物種長度大小變化較大，主要原因?yàn)榭刂茀^(qū)的長度和數(shù)量不同，基因組上存在一些重復(fù)序列區(qū)域。對(duì)不同物種線粒體結(jié)構(gòu)序列進(jìn)行分析并構(gòu)建系統(tǒng)樹（圖3），結(jié)果發(fā)現(xiàn)存在3種不同的基因結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)一主要存在于蟒科（RP和PR），閃鱗蛇科（XU），蚺科（BC）和疣鱗蛇科（AG 和 CR）中，含有 2 個(gè)控制區(qū)及 tRNA-L（Q）M和 tRNA-W（ANCY）結(jié)構(gòu)； 結(jié)構(gòu)二存在于蝮亞科（OO和AP）和游蛇科（DS和PS），和結(jié)構(gòu)一的差異在于在tRNA-I和控制區(qū)1中多了1個(gè)tRNA-P；相比于結(jié)構(gòu)二，結(jié)構(gòu)三的tRNA-L（Q）M基因簇中，tRNA-Q產(chǎn)生了基因輕重鏈的轉(zhuǎn)化，形成了tRNA-LQM；而結(jié)構(gòu)四（代表為盲蛇總目RH）則為僅存在1個(gè)控制區(qū)，tRNA-L產(chǎn)生了移位，挪動(dòng)至ND1前，而tRNA-L（Q）M和 tRNA-W（ANCY）通過移位分別轉(zhuǎn)變?yōu)?tRNA-IM和 tRNA-W（QANCY）。

圖3 不同基因結(jié)構(gòu)的線粒體基因組系統(tǒng)進(jìn)化樹及基因結(jié)構(gòu)示意圖Figure 3 Phylogenetic tree of mitochondrion based on different gene structures and the rank of variable area

3 討論

3.1 非入侵式采樣在蛇類研究中的應(yīng)用

在野生瀕危動(dòng)物中采集血液和臟器等常規(guī)樣品非常困難，要建立瀕危動(dòng)物的物種基因庫，亟待尋找新的采樣方法。研究認(rèn)為：通過提取糞便DNA或其他生物痕跡DNA等非入侵式采樣方法能夠?yàn)檫z傳學(xué)和生態(tài)學(xué)研究提供有效信息，在檢測(cè)種群大小、物種飲食結(jié)構(gòu)和大量物種的激素信息上具有現(xiàn)實(shí)意義［7］。蛇類的蛻皮行為為非入侵式采樣提供了實(shí)例。KHEDKAR等［8］提取92份蛇蛻樣品基因組，通過DNA條形碼技術(shù)鑒定出了23種蛇類，但部分樣品不能有效進(jìn)行擴(kuò)增。石林春等［9］在利用蛇蛻鑒定中藥材中的蛇類物種來源時(shí)發(fā)現(xiàn)，采用線粒體細(xì)胞色素C氧化酶I亞基（COI）作為引物，擴(kuò)增片段不超過1 000 bp。網(wǎng)紋蟒是目前已知最長的蟒蛇，在東南亞國家捕殺嚴(yán)重，已被列為易危等級(jí)。本研究以糞便樣品和新鮮蛇蛻為材料提取基因組DNA，發(fā)現(xiàn)相較糞便樣品，蛇蛻樣品擴(kuò)增得到的片段長度更長（1 000～1 500 bp），液氮研磨能有效提高DNA的提取品質(zhì)，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。糞便樣品由于提取的DNA品質(zhì)和質(zhì)量濃度不佳，在長片段擴(kuò)增中效率低下，因此不建議使用。

3.2 蟒科和蚺科物種進(jìn)化

本研究第1次完整地解析了網(wǎng)紋蟒的線粒體全基因組結(jié)構(gòu)，填補(bǔ)了網(wǎng)紋蟒線粒體基因組全序列的空白。分析發(fā)現(xiàn)：網(wǎng)紋蟒的基因結(jié)構(gòu)、tRNA順序和控制區(qū)位置等均與蟒科物種一致，但也發(fā)現(xiàn)存在物種特異的特征，如NADH2以AGA作為終止密碼子，ATP8以GTG作為起始密碼子，NADH6以ATA作為起始密碼子，這3點(diǎn)均不同于其他蟒科已報(bào)道的物種（表2）。

關(guān)于蟒科和蚺科物種的分子系統(tǒng)相關(guān)研究，主要采用部分線粒體基因結(jié)合核基因進(jìn)行；由于線粒體全基因不能通過簡單擴(kuò)增得到，在分析物種進(jìn)化過程中尚未廣泛使用［4,10］。但線粒體全基因組包含的信息更多，在解釋進(jìn)化關(guān)系時(shí)更具有說服力［11］。本研究結(jié)合多個(gè)線粒體基因（Cytb，12S和16S）和多個(gè)核基因的序列，分析蟒科和蚺科物種的進(jìn)化關(guān)系，認(rèn)為蚺科在這3個(gè)物種中先分化出來，而蟒科和閃鱗蛇科始終聚成姐妹群關(guān)系。單基因和線粒體基因組的系統(tǒng)進(jìn)化分析同樣得到上述研究結(jié)果 （圖2A，圖2B），進(jìn)一步確定了蟒科、閃鱗蛇科和蚺科三者之間的進(jìn)化關(guān)系［10］。

3.3 蛇亞目線粒體基因組的重排

線粒體基因排列次序在進(jìn)化過程中較為穩(wěn)定，但在兩棲類、魚類和一些有袋類等類群中發(fā)現(xiàn)存在基因重復(fù)、基因重排和基因缺失等現(xiàn)象［11-12］。蛇類線粒體基因組在演化過程中出現(xiàn)了某些基因排列順序的變化，如OL缺失、tRNA-LQM基因簇和tRNA-WANCY基因簇中的基因重排、控制區(qū)重復(fù)、tRNA-L移位和tRNA-P的功能缺失等［11］，進(jìn)化程度高級(jí)的新蛇附目Caenophidia中重排更加多樣［13］。由此認(rèn)為：具有共同基因重排順序的物種很有可能具有共同的祖先，因?yàn)椴煌锓N間共享的基因排列順序，不可能是通過趨同進(jìn)化而獨(dú)立產(chǎn)生的。

蟒科在分類上屬于蛇亞目原蛇附目。結(jié)合基因結(jié)構(gòu)和順序分析，蟒科目前已報(bào)道的3個(gè)物種和本研究所報(bào)道的網(wǎng)紋蟒線粒體結(jié)構(gòu)均體現(xiàn)出真蛇類物種的線粒體基因結(jié)構(gòu)類型，存在tRNA-LQM基因簇和tRNA-WANCY基因簇，并且沒有發(fā)生tRNA-P的假基因化現(xiàn)象，存在2個(gè)控制區(qū)，且結(jié)構(gòu)基本統(tǒng)一。tRNA-LQM基因簇由早期真蛇類的tRNALeu發(fā)生移位形成。本研究發(fā)現(xiàn)：除細(xì)盲蛇科物種（RH）外，所列舉的物種均含有該基因；而tRNA-WQANCY基因簇由tRNAGln移位生成，僅存在于細(xì)盲蛇科（RH）；真蛇類tRNAPro假基因的出現(xiàn)，則表現(xiàn)為控制區(qū)2附近的tRNAPro假基因化（OO和AP）和控制區(qū)1附近的tRNAPro缺失（RH）。雙控制區(qū)在其他爬行動(dòng)物［14］、 兩棲類［13］和鳥類［15］中也有存在， 重復(fù)控制區(qū)認(rèn)為可能是功能上（使得可以從多個(gè)位點(diǎn)啟動(dòng)復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，提高效率）和進(jìn)化選擇上的優(yōu)勢(shì)，多次復(fù)制和插入形成并維持雙控制區(qū)［12］。

對(duì)控制區(qū)的聚類分析發(fā)現(xiàn)：物種中獨(dú)立存在的2個(gè)控制區(qū)在系統(tǒng)發(fā)生過程中并非按排列的位置成簇聚集，而是在各物種間聚成一枝（圖3C），這和之前其他蛇類中描述的結(jié)果保持一致［12］?？刂茀^(qū)重復(fù)事件認(rèn)為發(fā)生在7 000萬a前［12］：在原始類群蠕蛇附目Scolecophidia和細(xì)盲蛇科中僅存在1個(gè)控制區(qū)，隨著蛇類演化，真蛇類線粒體中出現(xiàn)了控制區(qū)重復(fù)的事件，而在此基礎(chǔ)上基因重排演化出tRNA的移位和轉(zhuǎn)化。但聚類結(jié)果中2個(gè)控制區(qū)并沒有按照2個(gè)分布進(jìn)行聚類，主要原因則是因?yàn)樵谖锓N進(jìn)化過程中發(fā)生了協(xié)同進(jìn)化，導(dǎo)致同個(gè)物種的2個(gè)控制區(qū)形成了較高的同源性，相似度達(dá)100%［12］。