刁小琴 關(guān)海寧 喬秀麗 劉東琦 劉 旺

(綏化學院食品與制藥工程學院，黑龍江 綏化 152061)

肌原纖維蛋白是豬肌肉的重要組成成分之一，大約占豬肌肉總蛋白的55%，它不僅賦予肉制品特有的風味、口感和營養(yǎng)，還具有持水性、乳化性以及凝膠性等多重功能特性，決定產(chǎn)品的最終品質(zhì)[1]。肌原纖維蛋白具有親水親油基團，是一種天然的表面活性物質(zhì)，在乳化型肉制品中，蛋白向脂肪球靠攏后吸附在脂肪球表面，最后蛋白分子經(jīng)過構(gòu)象改變包裹在脂肪顆粒的外層，有效地阻止脂肪顆粒的聚集[2]，減少肉制品加工過程中跑水、跑油現(xiàn)象的發(fā)生。

超聲波技術(shù)因具有效率高、成本低、操作簡單、污染小、安全性高等優(yōu)點，近些年在食品加工、保藏、提取等領(lǐng)域被廣泛應用[3-4]。超聲波通過產(chǎn)生的機械、空化、熱和化學4種效應對食品中的生物大分子進行改性，效果顯著[5-6]。常海霞等[7]研究發(fā)現(xiàn)，應用超聲波技術(shù)對草魚肌原纖維蛋白進行改性，取得了良好的效果。Hu等[8]研究表明，超聲波能夠使肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)斷裂，進而使魷魚肉嫩度得到提高。Huang等[9]報道大豆分離蛋白經(jīng)超聲處理后，其游離巰基和表面疏水性會提高，進而溶解性和流動性提高。Nazari等[10]報道超聲處理小米濃縮蛋白，其溶解性和乳化活性顯著增加。Sheng等[11]報道，蛋清蛋白經(jīng)過高強度的超聲處理后，溶解性、發(fā)泡性及表面疏水性均有所提高，而黏度和表面張力降低。也有研究[12]報道，使用超聲波處理乳清蛋白，其泡沫穩(wěn)定性和凝膠強度均得到顯著提高。

目前關(guān)于豬肉肌原纖維蛋白經(jīng)超聲波處理后的溶解性與乳化性改善的研究國內(nèi)外尚未見報道。本試驗擬通過超聲波清洗儀對MP進行處理，研究其理化與乳化特性的變化，以期改善豬肉肌原纖維蛋白的功能特性，為將超聲波技術(shù)進一步應用于肌原纖維蛋白的改性提供理論依據(jù)，并為進一步提高乳化型肉糜制品的品質(zhì)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮的豬背最長?。捍鬂櫚l(fā)超市；

乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)：分析純，北京華邁科生物技術(shù)有限責任公司；

十二烷基硫酸鈉(SDS)：分析純，上海源葉生物有限公司；

牛血清蛋白標準品：Sigma公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

超聲波發(fā)生器：KQ-100VDB型，昆山市超聲儀器有限公司；

勻漿機：T18 basic型，德國IKA公司；

激光粒度儀：Mastersizer 3000型，英國馬爾文公司；

ZETA電位儀：Zetasizer Nano型，英國馬爾文公司；

高速冷凍離心機：GL-21M型，湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司；

光學顯微鏡：BX50型，日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 肌原纖維蛋白的制備 參照Xia等[13]的方法，稍作修改，制備方法如下：將明顯的外部脂肪和結(jié)締組織剔除，取一定量的肉樣絞碎稱重，與10 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)以1∶4(g/mL)比例混合，其中磷酸鹽緩沖液要事先預冷，且添加氯化鈉、氯化鎂和 EGTA，其終濃度分別為0.1，2.0，1.0 mmol/L，混合物在勻漿機中勻漿60 s，形成的肉漿在3 500 r/min冷凍(4 ℃)離心15 min，棄掉表層物質(zhì)，留沉淀，依照上述步驟重復提取2次，得到的沉淀即為粗肌原纖維蛋白，接著在此沉淀中加入4倍體積預冷的0.1 mol/L NaCl洗液，勻漿機中勻漿60 s，3 500 r/min冷凍(4 ℃)離心15 min，取沉淀，重復上述操作1次，再取沉淀加入4倍體積0.1 mol/L NaCl 洗液，勻漿60 s，用4層紗布過濾，濾液用0.1 mol/L HCl 調(diào)節(jié)pH值至6.0，依據(jù)前面離心標準再次離心，得到的肌原纖維蛋白2～4 ℃保存，在48 h內(nèi)利用，所有步驟均在 4 ℃條件下進行。

1.3.2 肌原纖維蛋白含量的測定 采用雙縮脲法[14]，以牛血清蛋白為標準品。

1.3.3 超聲處理肌原纖維蛋白 將得到的肌原纖維蛋白用pH 7.0的緩沖液溶解，配成40 mg/mL的蛋白溶液，分成5份置于超聲波清洗器中，設(shè)置不同的超聲功率(80，140，180，200 W)，超聲處理40 min，冰水浴控制溫度為4～10 ℃，以不做超聲處理的為對照，超聲結(jié)束后，冷凍干燥備用。

1.3.4 溶解度的測定 取10 mg/mL不同超聲處理的MP溶液于離心管中，4 000 r/min離心40 min后，取上清用雙縮脲法測定其吸光值，按式(1)計算溶解度：

(1)

式中：

s——溶解度，%；

m1——上清液中蛋白質(zhì)的含量，mg/mL；

m2——樣品中蛋白質(zhì)含量，mg/mL。

1.3.5 粒徑大小和分布的測定 將超聲處理后的MP用去離子水配成1 mg/mL的溶液，采用激光粒度分析儀測定粒徑大小和分布，測定溫度為室溫(25 ℃)。測量時以蒸餾水作為分散介質(zhì)，分散劑折射率為1.330。測定結(jié)果以d3,2和d4,3表示，按式(2)、(3)計算：

(2)

(3)

式中：

d3,2——表面積等效平均粒徑，μm；

d4,3——體積等效平均粒徑，μm；

di——測定的第i個粒子的直徑，μm；

ni——表示直徑為di的顆粒數(shù)。

1.3.6 乳化液電位的測定 將不同功率超聲處理的MP乳化液50 μL與濃度為10 mmol/L(pH 7.0)的磷酸鹽緩沖液5 mL均勻混合后，轉(zhuǎn)入毛細管吸收池中，用納米電位儀在常溫下測定乳化液的電位。

1.3.7 乳化活性和乳化穩(wěn)定性的測定 參照Diao等[15]的方法，修改如下：在8 mL 10 mg/mL的MP溶液中加入大豆色拉油2 mL，用高速分散均質(zhì)機10 000 r/min勻漿1 min后，用移液器從距離試管底部0.5 cm處取50 μL乳化液放入離心管中，加入5 mL SDS溶液(濃度為1 mg/g)混勻后，倒入比色皿中于500 nm波長下測其吸光度。同時，依照上述方法再次測定室溫放置10 min后的樣品。乳化活性(EAI)和乳化穩(wěn)定性(ESI)按式(4)、(5)計算：

(4)

(5)

式中：

EAI——乳化活性，m2/g;

ESI——乳化穩(wěn)定性，%；

C——乳化前的蛋白濃度，g/mL；

φ——乳化液中油的體積比；

dilution——稀釋倍數(shù)；

A0——初始乳化液的吸光度(500 nm)；

A10——10 min后乳化液的吸光度(500 nm)。

1.3.8 光學顯微鏡觀察 將上述乳化液分別取1滴均勻涂布在載玻片上，用蓋玻片蓋好，10倍物鏡下觀察。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

每個試驗結(jié)果均用平均數(shù)±SD表示。差異顯著性分析采用Statistix 8.1軟件進行，差異性顯著用不同字母表示(P≤0.05)，差異性不顯著用相同字母表示(P≥0.05)，采用Sigmaplot 12.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲處理對肌原纖維蛋白溶解度的影響

評價蛋白質(zhì)乳化特性的一個重要指標是溶解性，它也是衡量蛋白質(zhì)變性和聚集的一種方法[16]。肌原纖維蛋白的溶解性越高，說明更多的蛋白質(zhì)會被溶出，它們通過疏水相互作用附著在脂肪顆粒四周形成界面膜，因此溶解性高的蛋白其乳化性也高。肌原纖維蛋白經(jīng)不同超聲功率處理后其溶解度的變化見圖1。隨著超聲功率的增強，溶解度由19.17%(0 W)增加到35.03%(180 W)(P≤0.05)，而后又顯著下降到28.92%(200 W)(P≤0.05)?？赡苁浅曁幚硎沟鞍踪|(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變，形成可溶性的蛋白聚集物，也可能是內(nèi)部的親水基團暴露，增加了蛋白質(zhì)與水的相互作用，進而導致溶解度增加。Maity等[17]報道超聲的機械空化效應，打斷了分子間的疏水相互作用，進而提高了蛋白質(zhì)的溶解度，然而隨著超聲功率的增加，蛋白分子逐漸展開，暴露出更多的疏水基團和巰基基團，進而使溶解度降低。Wang等[18]利用超聲功率為240 W 的超聲波處理雞肉肌原纖維蛋白的研究中發(fā)現(xiàn)，當超聲時間為6 min時，溶解度達到最大，隨著超聲時間的延長，溶解度也表現(xiàn)出下降的趨勢。

2.2 超聲處理對肌原纖維蛋白粒徑的影響

粒徑分布可以反映蛋白的聚集程度。由圖2看出，超聲處理顯著影響MP的粒度分布，超聲未處理的MP呈現(xiàn)單峰分布，且粒度較大，經(jīng)超聲處理后的蛋白粒徑分布變寬，而且隨著超聲功率的增加，粒度均朝著粒徑減小的方向移動，這和超聲處理對粒子直徑的變化結(jié)果相一致(表1)，可能是超聲波的空化效應將肌原纖維蛋白之間的非共價鍵打斷，使其形成更小的可溶性蛋白聚集物。王靜宇等[19]研究發(fā)現(xiàn)，隨著超聲功率的增加，雞肉肌原纖維蛋白的粒徑顯著降低。然而Vera等[20]報道高強度的超聲波處理會使藜麥蛋白的粒度增加，可能是超聲功率越大，疏水基團暴露的越多，分子間產(chǎn)生的疏水相互作用使蛋白發(fā)生了聚合。本研究也發(fā)現(xiàn)當超聲功率為200 W時，平均粒徑整體反而高于180 W處理得到的蛋白的平均粒徑。體積等效平均粒徑(d4,3)通?？梢苑从车鞍椎木奂⒎纸饣蛐跄某潭?。表1看出，與未經(jīng)超聲處理的樣品比較，超聲處理使d4,3顯著降低(P≤0.05)，然而當超聲功率達到200 W時，d4,3又略有升高，但與經(jīng)180 W超聲處理的樣品差異不顯著(P≥0.05)。

圖1 超聲處理對肌原纖維蛋白溶解度的影響Figure 1 Effect of ultrasound treatment on solubility of MP

圖2 超聲處理對肌原纖維蛋白粒徑分布的影響Figure 2 Effect of ultrasound treatment on particle size distribution of MP

2.3 超聲處理對肌原纖維蛋白電位的影響

電位可以反映粒子在溶液中的表面帶電性質(zhì)，能夠描述粒子之間的靜電相互作用，進而決定粒子在溶液中的分散和聚集狀態(tài)。一般來說，蛋白溶液體系中帶正電荷的氨基酸數(shù)量比帶負電荷的氨基酸數(shù)量高時，蛋白溶液的電位即呈現(xiàn)正值[21]。圖3所示，所有蛋白樣品的電位均呈現(xiàn)負值，說明蛋白表面帶負電荷氨基酸的數(shù)量高于帶正電荷的氨基酸數(shù)量，而且隨著超聲功率的增加，肌原纖維蛋白電位的絕對值逐漸增加，說明蛋白質(zhì)所帶的負電荷逐漸增多，蛋白分子的聚集可能被破壞，分子展開，更多的帶負電荷的氨基酸暴露。當超聲功率為180 W 時，肌原纖維蛋白表面的電位絕對值最大，粒子間產(chǎn)生的較強靜電排斥力抑制了蛋白質(zhì)的聚集，進而提高了蛋白質(zhì)的分散性，使蛋白的溶解度增強，與蛋白溶解度測定結(jié)果一致。然而當超聲功率達到200 W時，電位的絕對值又顯著下降(P≤0.05)，可能是較強的超聲功率促進了蛋白的聚集。

表1 超聲功率對肌原纖維蛋白粒徑的影響?Table 1 Effect of ultrasound treatment on particle size of MP

?d10指蛋白的粒徑累計達到10%時所對應的粒徑大小，d50和d90同。

圖3 超聲功率對肌原纖維蛋白電位的影響Figure 3 Effect of ultrasound treatment on zeta potential of MP

2.4 超聲處理對豬肉肌原纖維蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響

乳化活性(EAI)和乳化穩(wěn)定性(ESI)是評價蛋白質(zhì)乳化性的重要指標。EAI是指單位質(zhì)量蛋白質(zhì)在促進油水互溶時，穩(wěn)定油水界面的大小，ESI是指維持油水混合不分離時，蛋白質(zhì)抵抗外界條件的能力[22]。由圖4可知，與未經(jīng)超聲波處理的肌原纖維蛋白樣品相比，超聲處理后，肌原纖維蛋白的EAI和ESI顯著增加(P≤0.05)，且隨著超聲功率的增加，二者均顯著增加(P≤0.05)，當超聲功率超過180 W時，乳化能力開始下降，說明超聲處理能夠改變肌原纖維蛋白的乳化特性。肌原纖維蛋白經(jīng)適當強度的超聲波處理后，局部變性或結(jié)構(gòu)變得無序，增加了其在油水界面的吸附潛力。然而較高功率的超聲波處理，可能會產(chǎn)生大量的可溶性聚集體，進而使乳化活性和乳化穩(wěn)定性下降。Caessens等[23]研究表明超聲波處理能夠減少蛋白質(zhì)粒徑的大小，使其吸附比例增大。有研究[24]報道，蛋白吸附于油水界面后，其結(jié)構(gòu)會發(fā)生改變，乳化能力會受到影響。超聲處理會使肌原纖維蛋白分子結(jié)構(gòu)發(fā)生重排，進而使其具有不同的乳化能力。

圖4 超聲處理對肌原纖維蛋白乳化活性和乳化穩(wěn)定性的影響Figure 4 Effect of ultrasound treatment on emulsifying activity and emulsion stability of MP

2.5 乳化液的顯微觀察

為進一步驗證不同超聲處理的肌原纖維蛋白乳化液的乳化特性，未經(jīng)超聲處理的對照組與經(jīng)不同超聲處理的肌原纖維蛋白制備的乳化液的光學顯微鏡觀察結(jié)果見圖5。隨著超聲功率的增加，乳化液的液滴顆粒大小明顯小于對照組，且隨著超聲功率的增加，液滴顆粒大小明顯下降，在超聲功率達180 W時，乳化液液滴顆粒最小，然而當超聲功率增加到200 W時，乳化液液滴顆粒大小增加，液滴大小與之前乳化活性、電位以及粒徑大小和分布結(jié)果相一致。

2.6 相關(guān)性分析

由表2看出，超聲功率與體積等效平均粒徑(d4,3)極顯著負相關(guān)(P≤0.01)，與溶解度、電位、乳化活性及乳化穩(wěn)定性顯著正相關(guān)(P≤0.01)，溶解度與乳化活性和乳化穩(wěn)定性之間存在極顯著相關(guān)性(P≤0.01)，與d4,3和電位之間存在顯著相關(guān)性(P≤0.05)，乳化活性與乳化穩(wěn)定性之間也存在極顯著相關(guān)性(P≤0.01)。由此可見，超聲波對MP的理化及乳化特性有顯著的影響，且理化性與乳化性之間也存在一定的相關(guān)性。

圖5 不同超聲處理的肌原纖維蛋白乳化液的光學顯微鏡圖Figure 5 Optical microscopy images of MP emulsions treated with different ultrasound

表2 超聲波與MP理化乳化性之間的相關(guān)性?Table 2 Correlation of ultrasound,physicochemical property of MP and emulsifying property

? *表示顯著相關(guān)(P≤0.05)，**表示極顯著相關(guān)(P≤0.01)。

3 結(jié)論

MP的理化特性(溶解度、粒徑和電位)和乳化特性受超聲處理的影響顯著。一定功率的超聲處理能促進MP適度伸展，使顆粒粒徑下降，大小分布更加均勻，溶解度、乳化活性及乳化穩(wěn)定性提高。當超聲功率超過180 W時，較強的超聲功率又促進了蛋白的聚集，進而使各性質(zhì)指標下降。因此，采用適宜的超聲功率可以提高肌原纖維蛋白的理化及乳化性，然而關(guān)于超聲作用時間、超聲作用頻率等超聲波改性技術(shù)對MP功能特性及結(jié)構(gòu)的影響有待進一步研究。另外，有研究[25]表明較高濃度的鹽溶液也能夠提高肌原纖維蛋白的理化特性和加工特性，然而較高食鹽的攝入，會影響人類的健康，本研究采用的超聲波改性技術(shù)對肌肉蛋白質(zhì)加工特性的影響能否替代鹽離子的作用有待進一步探究。