田永貴，張 震，尹 婕，申春一，張 毅

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生物細(xì)胞治療中心 鄭州 450052 2)河南省腫瘤免疫與生物治療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 鄭州 450052 3)鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 鄭州 450001 4)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤中心 鄭州 450052

惡性腫瘤嚴(yán)重威脅人類生命健康，雖然傳統(tǒng)治療方法取得了一定的療效，但仍存在局限性，患者預(yù)后仍較差。以過繼性細(xì)胞免疫治療為代表的免疫療法為腫瘤患者帶來了新的希望。過繼性細(xì)胞免疫治療是將患者體內(nèi)的免疫活性細(xì)胞經(jīng)體外擴(kuò)增和功能鑒定后，回輸給患者，其重要特征是免疫記憶性，但是輸注的T細(xì)胞大部分處于終末分化狀態(tài)，在腫瘤微環(huán)境中易凋亡且抗腫瘤效應(yīng)差，影響療效[1]。CD8+T細(xì)胞是機(jī)體抗腫瘤的主要效應(yīng)細(xì)胞，活化的CD8+T細(xì)胞可釋放顆粒酶、穿孔素、TNF-α、IFN-γ等細(xì)胞因子。CD8+T細(xì)胞分為初始T細(xì)胞(Tn)、中心記憶性T細(xì)胞(Tcm)、效應(yīng)記憶性T細(xì)胞(Tem)和效應(yīng)性T細(xì)胞(Teff)[2-3]。記憶性T細(xì)胞(Tcm和Tem)是具有自我更新能力的多能細(xì)胞，可維持機(jī)體免疫記憶功能，并參與再次免疫應(yīng)答[4-5]。其中Tcm是長壽的記憶性T細(xì)胞，有很強(qiáng)的增殖潛力和細(xì)胞因子生成能力，抗腫瘤能力優(yōu)于Tem 細(xì)胞[6-7]。T細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中，隨著激活性標(biāo)志物(如CD69、CD28)的表達(dá)上調(diào)，耗竭性標(biāo)志物PD-1的表達(dá)也會(huì)上調(diào)，并影響T細(xì)胞的分化和功能[8]。如何在體外獲得大量記憶性T細(xì)胞是目前研究的熱點(diǎn)。該研究通過檢測不同亞群CD8+T細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)，確定記憶性T細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)譜，為體外誘導(dǎo)記憶性T細(xì)胞的形成提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要材料及試劑無菌條件下采集健康受試者外周血，4 ℃保存(不超過6 h)，外周血的采集獲得本人知情同意。人外周血淋巴細(xì)胞分離液購自天津市灝洋生物制品科技有限公司，細(xì)胞免疫磁珠分選材料(CD8 免疫磁珠、MACS 緩沖液和LS柱)均購自德國Miltenyi Biotec公司，RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國HyClone公司，Trizol和SYBR Green染料購自TaKaRa公司，CD3、CD8、CD45RA、CCR7、CD69、CD28、PD-1、IFN-γ和IL-2流式抗體購自BD公司。

1.2外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)的分離將10 mL健康受試者外周血轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，加入PBS至35 mL。另取一個(gè)50 mL離心管，加入15 mL淋巴細(xì)胞分離液，將稀釋的血液緩慢倒入該離心管中，2 500 r/min離心25 min。無菌吸管吸取淋巴細(xì)胞白膜層至另一個(gè)無菌離心管中，加入適量PBS，1 500 r/min離心10 min，棄上清便可得PBMCs。

1.3CD8+T細(xì)胞的分選及培養(yǎng)在PBMCs中加入適量4 ℃MACS 緩沖液，1 500 r/min離心10 min，棄上清；加入適量4 ℃緩沖液重懸細(xì)胞，并加入適量CD8免疫磁珠混勻，4 ℃避光孵育15～20 min，期間混勻2次；加入3 mL 4 ℃緩沖液，1 500 r/min離心10 min，棄上清，加入 500 μL 4 ℃緩沖液重懸細(xì)胞；將LS柱固定在磁場中，加入緩沖液潤洗1次，然后緩慢加入細(xì)胞懸液，待柱內(nèi)無液體后，再使用適量緩沖液潤洗柱子3次。加入5 mL緩沖液后，將柱子移出磁場，然后迅速使用活塞將細(xì)胞壓出至新離心管中，得到的細(xì)胞為CD8+T細(xì)胞。分離的CD8+T細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清和青/鏈霉素雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)。

1.4CD8+T細(xì)胞亞群的分選在CD8+T細(xì)胞中加入CD3-PE-Cy7、CD8-APC-Cy7、CD45RA-PerCP、CCR7-FITC流式抗體，4 ℃避光孵育15 min，利用流式分選儀(BD FACSAria Ⅱ)分選CD8+T細(xì)胞亞群Tn(CD45RA+CCR7+)、Tcm(CD45RA-CCR7+)、Tem(CD45RA-CCR7-)和Teff(CD45RA+CCR7-)。記錄各亞群的比例。

1.5CD8+T細(xì)胞亞群表型及功能分子的檢測取1×106個(gè)CD8+T細(xì)胞，加入適量表面抗體(CD3-PE-Cy7、CD8-APC-Cy7、CD45RA-PerCP、CCR7-APC、CD69-FITC、 CD28-PE、PD-1-FITC)，4 ℃避光孵育15 min；加入1 mL PBS，1 500 r/min離心5 min，棄上清，加入 200 μL PBS，上流式細(xì)胞儀(BD FACS-Canto Ⅱ)檢測CD8+T細(xì)胞的亞群和表型。

將CD8+T細(xì)胞鋪于24孔板中，分別加入PMA(50 mg/L)、離子霉素(750 mg/L)、阻斷劑(BFA)，刺激6 h后收集細(xì)胞于1.5 mL離心管中，用PBS清洗2遍，加入適量表面抗體CD3-PE-Cy7、CD8-APC-Cy7、CD45RA-PerCP、CCR7-FITC，4 ℃避光孵育15 min；加入400 μL固定劑，4 ℃避光孵育30 min；加入400 μL破膜劑，4 ℃避光孵育1 h；加入適量功能分子抗體IFN-γ-FITC、IL-2-PE，4 ℃避光孵育15 min；加入1 mL PBS，1 500 r/min離心5 min，棄上清，加入 200 μL PBS，上流式細(xì)胞儀(BD FACS-CantoⅡ)檢測CD8+T細(xì)胞功能分子的表達(dá)。

1.6CD8+T細(xì)胞分化相關(guān)基因的富集分析采用基因注釋分析工具M(jìn)etascape進(jìn)行分析。打開Metascape的主頁(http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)，提交分化相關(guān)基因列表，選擇物種H.sapiens，點(diǎn)擊Express Analysis進(jìn)行分析，生成富集通路柱狀圖。

1.7CD8+T細(xì)胞亞群中轉(zhuǎn)錄因子、凋亡、干性等相關(guān)基因表達(dá)的qRT-PCR檢測將分選的CD8+T細(xì)胞亞群離心，獲取沉淀，每管加入1 mL Trizol重懸，提取RNA，并用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA；以2 μL cDNA為模板，加入10 μL SYBR Green染料、8 μL 1 μmol/L的上下游引物(引物及序列見表1)混合物。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min延伸。結(jié)果以2-ΔΔCt表示。采用GraphPad Prism 7對(duì)qRT-PCR結(jié)果進(jìn)行分析并生成熱圖。

續(xù)表1

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。采用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)比較CD8+T細(xì)胞不同亞群間表型、功能分子及其分化相關(guān)基因表達(dá)的差異。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1CD8+T細(xì)胞亞群的比例4個(gè)亞群的比例分別為Tn(43.07±16.09)%，Tcm(9.08±3.67)%，Tem(23.59±11.20)%，Teff(24.27±16.08)%。

2.2CD8+T細(xì)胞亞群的表型分析結(jié)果見表2。Tcm中CD69和CD28表達(dá)高于Tem和Teff(P<0.001)，而PD-1表達(dá)則低于Tem和Teff(P<0.05)。

表2 CD8+T細(xì)胞亞群表型分子的表達(dá) %

*：與Tcm組相比，P<0.05

2.3CD8+T細(xì)胞亞群的功能分析結(jié)果見表3。與Tem和Teff相比，Tcm中IFN-γ、IL-2的表達(dá)水平明顯增高(P<0.05)。

表3 CD8+T細(xì)胞亞群的功能分子的表達(dá) %

*：與Tcm組相比，P<0.05

2.4CD8+T細(xì)胞分化相關(guān)基因的富集分析見圖1。CD8+T細(xì)胞分化相關(guān)基因主要富集在分化、凋亡、自我更新、STAT3通路等。

圖1CD8+T細(xì)胞相關(guān)基因的富集通路柱狀圖

2.5CD8+T細(xì)胞亞群中相關(guān)基因mRNA的表達(dá)結(jié)果見圖2。與Tem和Teff相比，Tcm中趨化因子受體(CCR7、CXCR4)、STAT3通路相關(guān)基因(IL-21、STAT3)、自我更新的干性基因(C-myc、Lin28)、抗凋亡基因(Bcl-2)的表達(dá)水平增高(P<0.05)，見表4、5。

圖2 CD8+T細(xì)胞亞群中分化相關(guān)基因的表達(dá)熱圖

*：與Tcm組相比，P<0.05

表5 CD8+T細(xì)胞各亞群中自我更新及抗凋亡相關(guān)基因的表達(dá)

*：與Tcm組相比，P<0.05

3 討論

記憶性T細(xì)胞在維持機(jī)體免疫記憶及抗腫瘤效應(yīng)中發(fā)揮重要作用。CD8+T細(xì)胞各亞群具有不同的基因表達(dá)譜和抗腫瘤能力。Tcm高表達(dá)與記憶相關(guān)的基因，具有自我更新能力以及向腫瘤部位趨化的能力。Tem高表達(dá)效應(yīng)相關(guān)的基因，但是增殖能力和自我更新能力較Tcm差。Tcm抗腫瘤能力優(yōu)于Tem，將Tcm應(yīng)用到腫瘤免疫治療中，可提高患者的治療效果。記憶性T細(xì)胞的分化受到多種因素的調(diào)控，如轉(zhuǎn)錄因子、代謝檢查點(diǎn)、免疫檢查點(diǎn)和信號(hào)通路分子等[9]。鑒定不同T細(xì)胞亞群的差異基因表達(dá)，尋找與記憶性T細(xì)胞分化相關(guān)的基因，可為體外誘導(dǎo)培養(yǎng)記憶性T細(xì)胞提供新策略。

CD8+T細(xì)胞表達(dá)的共刺激分子(如CD69和CD28)與其對(duì)應(yīng)的配體結(jié)合，引起CD8+T細(xì)胞的活化[10]；CD69活化刺激IL-2和IFN-γ的分泌，進(jìn)一步促進(jìn)CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒性功能[11]。共抑制信號(hào)由共抑制分子與其配體(如PD-1與其配體PD-L1/PD-L2)之間的相互作用觸發(fā)；這種相互作用導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生的效應(yīng)細(xì)胞因子下調(diào)[12]。本研究結(jié)果顯示，Tn和Tcm中共刺激分子CD69、CD28表達(dá)高于Tem、Teff，而PD-1表達(dá)則低于Tem和Teff。說明Tcm有優(yōu)于Tem、Teff的活化及增殖潛力，當(dāng)再次暴露于抗原時(shí)，Tcm能迅速活化、擴(kuò)增，并產(chǎn)生大量細(xì)胞因子(IFN-γ、IL-2)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡。

本研究檢測了CD8+T細(xì)胞各亞群的差異基因，并采用基因富集分析發(fā)現(xiàn)這些基因主要富集在分化、凋亡、自我更新、STAT3通路等。趨化因子可以由樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生，對(duì)CD8+T細(xì)胞的遷移和功能具有共刺激或共抑制的影響[13]。本研究結(jié)果顯示趨化因子受體CCR7、CXCR4在Tcm中表達(dá)上調(diào)。CCR7是重要的淋巴結(jié)歸巢標(biāo)記，Tcm細(xì)胞表達(dá)這種淋巴結(jié)歸巢受體分子，有利于它們在淋巴組織中的轉(zhuǎn)移和保留[5-6]。CD8+T細(xì)胞通過TCR和CXCR4的刺激，增加激活性標(biāo)志物CD69、CD25和CD154的表達(dá)，從而促進(jìn)T細(xì)胞生長及IL-2、IFN-γ、IL-4的產(chǎn)生。本研究結(jié)果還顯示STAT3通路相關(guān)基因在Tcm中表達(dá)水平增高。STAT3通路的IL-21信號(hào)可以使CD8+T細(xì)胞免于過度的炎癥刺激，阻礙效應(yīng)性CD8+T細(xì)胞的分化和衰竭，促進(jìn)記憶性T細(xì)胞的形成[14]。干性相關(guān)基因(如C-myc、Lin28)在記憶性T細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，可以促進(jìn)記憶性T細(xì)胞的維持和自我更新。Bcl-2在T細(xì)胞中的表達(dá)不僅能夠抑制T細(xì)胞的凋亡，同時(shí)也參與調(diào)控T細(xì)胞與記憶性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(如 FoxO1 和 Eomes)以及糖代謝相關(guān)基因(如HK2和Glut)的表達(dá)。

腫瘤浸潤的CD8+T細(xì)胞發(fā)揮了重要的抗腫瘤作用，然而，由于腫瘤微環(huán)境的免疫抑制作用，CD8+T細(xì)胞的功能受到抑制，使得多種有效的腫瘤免疫療法療效受到影響[15]。因此，通過調(diào)節(jié)與T細(xì)胞分化相關(guān)的基因及其通路，可以促進(jìn)記憶性CD8+T細(xì)胞的形成。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，分化、抗凋亡、自我更新及STAT3通路等相關(guān)基因在Tcm細(xì)胞中表達(dá)水平較高。本研究探明了記憶性T細(xì)胞基因表達(dá)的特點(diǎn)，為體外誘導(dǎo)記憶性T細(xì)胞的形成提供了新思路。