郭洪耀，喬軍波，林 斌，沙樹奎

1)南陽市中醫(yī)院燒傷整形科 河南南陽 473000 2)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院血管瘤外科 鄭州 450052

瘢痕疙瘩是一種在皮膚組織受損后發(fā)生異常愈合的良性皮膚瘤[1-3]。皮膚成纖維細(xì)胞過度增殖、細(xì)胞膠原分泌過剩以及相關(guān)細(xì)胞因子過量表達(dá)，可導(dǎo)致結(jié)締組織過度增生和變形，進(jìn)而引發(fā)瘢痕的形成[4-5]。瘢痕疙瘩的形成往往伴隨著皮膚疼痛和異常瘙癢，不僅破壞皮膚美觀，還會給患者帶來心理壓力，嚴(yán)重影響人們的身心健康。目前，瘢痕疙瘩的主要治療方法有藥物、手術(shù)、激光、放射、冷凍等，然而單一的治療手段效果不理想，復(fù)發(fā)率高[6]。瘢痕疙瘩形成的主要效應(yīng)細(xì)胞為成纖維細(xì)胞。研究[7]表明誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞的凋亡以及抑制成纖維細(xì)胞的增殖和膠原合成有助于改善瘢痕疙瘩。DKK3屬于DKK家族中的一員，是一種重要的腫瘤抑制因子[8]。據(jù)報道[9-10]，DKK3在多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)其表達(dá)能夠抑制癌細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡。本研究探索DKK3過表達(dá)對人皮膚瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖和凋亡的影響,以期為瘢痕疙瘩的防治提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1標(biāo)本來源選取南陽市中醫(yī)院燒傷整形科2011年1月至2017年12月21例瘢痕手術(shù)患者的皮膚瘢痕疙瘩組織；其中男12例，女9例，年齡15～30歲，病程6～12個月；取材部位：胸前4例，上肢11例，耳垂6例。所有患者均無瘢痕疙瘩治療史，無合并皮膚病、結(jié)締組織病，局部皮膚無感染和潰瘍。正常皮膚組織20例取自同時期因燒傷進(jìn)行皮膚移植術(shù)后的剩余皮膚；其中男13例，女7例，年齡23～35歲；取材部位：上肢內(nèi)側(cè)或腹部。所有患者均對本研究知情同意。

1.2主要試劑DEME-F/12培養(yǎng)基和胎牛血清(美國Gibco公司)，CCK-8試劑(北京Solarbio科技有限公司)，cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Invitrogen公司)，Annexin V-FITC/PI試劑盒(大連Meilunbio生物技術(shù)有限公司)，DKK3、CAPDH一抗和HRP羊抗兔二抗(美國Abcam公司)，Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑盒(美國Thermo Fisher公司)，pcDNA3.0質(zhì)粒(BioVector NTCC典型培養(yǎng)物保藏中心)，引物由Invitrogen合成。

1.3正常皮膚和瘢痕疙瘩組織中DKK3mRNA檢測取凍存組織置預(yù)冷研缽，加液氮后研磨至粉末，移入勻漿器中，Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以GAPDH為參照基因進(jìn)行qRT-PCR。DKK3引物序列：上游5’-ACAGCCACAGCCTGGTGTA-3’，下游5’-CCTCCATGAAGCTGCCAAC-3’；GAPDH引物序列：上游5’-GACCACAGTCCATGCCATCAC-3’，下游5’-GTCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火延伸30 s。用2-ΔΔCt計算DKK3 mRNA相對表達(dá)水平。

1.4人皮膚瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的獲取和培養(yǎng)將去除表皮和皮下脂肪的瘢痕組織剪成1 mm3大小的組織塊，用含有100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，于體積分?jǐn)?shù)5%CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3～4 d換液1次。待原代培養(yǎng)的細(xì)胞生長至單層時加入2.5 g/L胰蛋白酶消化，繼續(xù)傳代培養(yǎng)。選取第4～6代的成纖維細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.5DKK3過表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和細(xì)胞轉(zhuǎn)染使用Primer Premier 6.0設(shè)計含有HindⅢ和BamHⅠ酶切位點的DKK3引物，上游為5’-CCCAAGCTTATG CAGCGGCTTGGGGC-3’，下游為5’-CGCGGATC CCTAAATCTCTTCCCCTCCCAGCAGT-3’。以cDNA為模板擴(kuò)增，之后使用酶切酶連的方式構(gòu)建pcDNA3.0-DKK3質(zhì)粒。成纖維細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.0空質(zhì)粒(pcDNA組)或pcDNA3.0-DKK3質(zhì)粒(DKK3組)，未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為對照組，每組設(shè)3個復(fù)孔。使用Lipofectamine 3000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，操作步驟見說明書。

1.6Western blot檢測3組細(xì)胞中DKK3蛋白的表達(dá)水平取轉(zhuǎn)染48 h的各組細(xì)胞，離心收集沉淀，加入裂解液充分裂解后收集上清液，BCA法蛋白定量，沸水處理10 min后置冰中備用。取50 μg蛋白行120 g/L的SDS-PAGE，90 V電泳30 min，120 V至結(jié)束。將蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜，200 mA恒流轉(zhuǎn)膜45 min。使用50 g/L牛血清蛋白封閉3 h，加1∶1 000稀釋的一抗反應(yīng)過夜，加1∶5 000稀釋的二抗室溫孵育1 h，化學(xué)發(fā)光法顯色，拍照保存并使用Image J軟件分析。以目的蛋白與GAPDH條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達(dá)水平。

1.7CCK-8檢測3組細(xì)胞增殖情況分別取轉(zhuǎn)染24、26、48、72 h的3組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×104個/mL，接種于96孔板，每組設(shè)3個復(fù)孔。37 ℃培養(yǎng)48 h后，加入10 μL的CCK-8試劑，酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處的光密度(OD)值。

1.8Annexin V-FITC/IP雙染法檢測3組細(xì)胞凋亡情況取轉(zhuǎn)染48 h的各組細(xì)胞，離心去除培養(yǎng)液，加入胰蛋白酶消化，離心收集沉淀，使用預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，重復(fù)2次。最后加入Annexin V-FITC和IP染液，24 h內(nèi)上流式儀檢測。

1.9統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 17.0分析，瘢痕疙瘩和正常皮膚組織中DKK3 mRNA表達(dá)水平的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗，3組細(xì)胞增殖和凋亡情況比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗， 檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1瘢痕疙瘩和正常皮膚組織中DKK3mRNA的表達(dá)瘢痕疙瘩和正常皮膚組織中DKK3 mRNA的相對表達(dá)水平分別為(0.53±0.13)和(1.00±0.11)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.780，P=0.009)。

2.2各組細(xì)胞中DKK3蛋白的表達(dá)結(jié)果見圖1和表1。DKK3組細(xì)胞中DKK3蛋白的表達(dá)水平顯著上調(diào)。

1～3：分別為對照組、pcDNA組和DKK3組

組別nDKK3蛋白對照組31.00±0.06pcDNA組31.09±0.10DKK3組32.98±0.32?

F=96.991，，P<0.001；*：與其他兩組比較，P<0.05

2.3各組細(xì)胞增殖情況結(jié)果見表2。DKK3組細(xì)胞增殖能力降低(P<0.05)。

表2 各組細(xì)胞增殖情況比較(n=3)

*：與其他兩組比較，P<0.05

2.4各組細(xì)胞凋亡情況對照組、pcDNA組和DKK3組細(xì)胞凋亡率分別為(15.5±1.2)%、(16.4±1.3)%和(26.3±0.2)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=100.793，P<0.001)，DDK3組高于對照組和pcDNA組(P<0.05)。

3 討論

瘢痕疙瘩是一種由成纖維細(xì)胞的異常增殖和膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)的異常沉積造成的病理性疙瘩。近些年來，人們逐漸發(fā)現(xiàn)在瘢痕疙瘩中成纖維細(xì)胞的過度增殖和膠原的堆積沉淀可能與某些原癌基因和抑癌基因的突變有關(guān)[11-12]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)DKK3 mRNA在瘢痕組織中的表達(dá)水平下調(diào)，與Hahn等[13]報道的結(jié)果相一致。該研究結(jié)果提示DKK3可能在成纖維細(xì)胞的異常增殖中發(fā)揮著重要作用。

DKK3是近些年來新發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因，可以與Wnt信號傳導(dǎo)因子競爭性結(jié)合從而參與調(diào)控該通路的功能。在DKK3的蛋白結(jié)構(gòu)中包含兩個富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域Cys-1和Cys-2，該區(qū)域是抑制Wnt通路的主要活性中心[14]。當(dāng)細(xì)胞中Wnt與受體結(jié)合后，促使β-catenin從降解復(fù)合物上解離下來，β-catenin累積到一定量后進(jìn)入細(xì)胞核中與TCF/LEF結(jié)合，Wnt/β-catenin通路被活化，進(jìn)而發(fā)揮對靶基因的調(diào)控作用[15]。Wnt/β-catenin為Wnt的經(jīng)典途徑，參與了細(xì)胞增殖、凋亡等多種生物過程[16]。由此可見，DKK3對腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能有著重要影響。過表達(dá)DKK3可抑制肺癌細(xì)胞的增殖和侵襲并誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[17]；在胰腺癌中DKK3表達(dá)顯著下調(diào)，提高其表達(dá)水平能夠抑制腫瘤生長并促進(jìn)其凋亡[18]；在結(jié)腸癌中DKK3同樣對癌細(xì)胞發(fā)揮著抑制作用[19]。該研究結(jié)果顯示，成功上調(diào)DKK3表達(dá)能夠顯著抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡。

綜上所述，DKK3可能抑制瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡，豐富了瘢痕疙瘩發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，也為以DKK3為靶點的瘢痕疙瘩的防治提供了實驗依據(jù)。然而，關(guān)于DKK3在瘢痕成纖維細(xì)胞中介導(dǎo)了哪些信號通路和基因發(fā)揮抑增殖和促凋亡作用的還有待深入研究。