趙虹沃立科胡袁媛王安妮盧德趙

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 杭州 310006 2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院

乳腺癌的發(fā)病率逐年上升，目前已占據(jù)女性惡性腫瘤的首位，病死率僅次于肺癌[1]，其中三陰乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是一類雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）以及人表皮生長(zhǎng)因子受體-2（human epidermal growth factor receptors-2，HER-2）均為陰性的乳腺癌，其發(fā)病率占乳腺癌總發(fā)病率的15%～25%。TNBC具有侵襲能力強(qiáng)、復(fù)發(fā)率高、總體預(yù)后差等臨床特征[1-3]。由于TNBC的特殊生物學(xué)特性和病理特征，使得放療、內(nèi)分泌治療或抗HER-2的生物靶向治療均未能取得很好的效果[4-5]。因此，探索新的治療靶點(diǎn)及開發(fā)相應(yīng)的藥物成為TNBC臨床和基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)。

黃連素又名小檗堿，是從黃連、黃柏、三顆針等藥用植物中提取出來(lái)的天然生物堿，具有抗菌、抗炎、抗氧化、降血糖等多種藥理活性[6]。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，黃連素能夠提高乳腺癌細(xì)胞的藥物敏感性，抑制乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，并可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡[7]。本實(shí)驗(yàn)擬以MDA-MB-231細(xì)胞為對(duì)象，研究黃連素對(duì)TNBC細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并從葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose regulated protein 78，GRP78）調(diào)控的角度探討其分子機(jī)制，為黃連素的臨床應(yīng)用提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株 TNBC細(xì)胞株MDA-MB-231細(xì)胞由南京醫(yī)科大學(xué)惠贈(zèng)。

1.2 藥物和試劑 黃連素購(gòu)于天津一方科技有限公司（批號(hào)：AB271B），以二甲基亞砜溶解備用；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于 Hyclone公司（批號(hào)：15112708）；GRP78、Bax、Bcl-2抗體均購(gòu)于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司（批號(hào)：11587-1-AP、50599-2-Ig、12789-1-AP）；AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)BD公司（批號(hào)：3352555）；免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白誘導(dǎo)劑X（immunoglobulin heavy chain binding protein inducer X，BiX） 購(gòu)于 Atomax Chemicals公司（批號(hào)：101714-41-4）；MTT購(gòu)于上海麥克林生化科技有限公司（批號(hào)：C10111913）。

1.3 主要儀器 3111型CO2培養(yǎng)箱購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；SpectraMax190酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó) Molecular Devices公司；Power PacTMHCBIORAD電泳儀為美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品；5427R高速冷凍離心機(jī)為德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品；Becton-Dickinson流式細(xì)胞儀購(gòu)于美國(guó)BD FACS Calibur公司。

1.4 方法

1.4.1 MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng) MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)使用含10%胎牛血清、100mg·L-1青霉素和100mg·L-1鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基。將細(xì)胞置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以0.25%胰酶消化傳代。傳代后3d處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 MTT檢測(cè)MDA-MB-231細(xì)胞增殖活力 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰酶消化后接種于96孔板中，細(xì)胞密度為1×104/孔，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。常規(guī)培養(yǎng)24h后棄去原有培養(yǎng)基，以200μL分別含終濃度為 0、20、40、60、80、100μmol·L-1黃連素的培養(yǎng)基處理細(xì)胞，24h后加入 5mg·mL-1MTT溶液20μL，繼續(xù)孵育4h，棄去培養(yǎng)基，每孔加入二甲基亞砜150μL，以微量振蕩器振蕩10min使結(jié)晶物充分溶解，酶標(biāo)儀于490nm波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的吸光度值。計(jì)算各組細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率（%）=AR/A0×100%，AR 為各組的吸光度值，A0 為對(duì)照組（黃連素濃度為 0μmol·L-1）細(xì)胞的吸光度值。

1.4.3 AnnexinⅤ/PI檢測(cè)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡情況 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞，以2×105/孔的細(xì)胞密度接種于6孔板中，常規(guī)培養(yǎng)24h后分組如下：（1）對(duì)照組：不加入黃連素；（2）黃連素組：分別加入 20、40、60μmol·L-1的黃連素；（3）Bix 組：加入 1μmol·L-1BiX；（4）BiX 聯(lián)合 40μmol·L-1黃連素組：加入 1μmol·L-1BiX 聯(lián)合 40μmol·L-1黃連素；（5）BiX 聯(lián)合 60μmol·L-1黃連素組：加入 1μmol·L-1BiX聯(lián)合60μmol·L-1黃連素。各組培養(yǎng)24h后棄去培養(yǎng)基，胰酶消化后，3000r/min離心5min收集細(xì)胞，加入RNA酶后37℃水浴1h，再置于冰浴冷卻，按說(shuō)明書要求加入適量的PI和AnnexinⅤ，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況[8]。

1.4.4 Western blot檢測(cè)GRP78、Bax和Bcl-2的蛋白表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以2×105/孔的細(xì)胞密度接種于6孔板中，常規(guī)培養(yǎng)24h后分組同1.4.3。培養(yǎng)24h后棄去培養(yǎng)基，以預(yù)冷PBS洗滌2次，離心收集細(xì)胞后加入適量裂解液冰上裂解40min，4℃下12 000r/min離心30min，將上清液轉(zhuǎn)移至新離心管，BCA法檢測(cè)蛋白濃度后，調(diào)整蛋白濃度，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)PVDF膜，脫脂奶粉封閉2h，分別加入一抗（1:1 000），4℃孵育過(guò)夜，洗膜后加入二抗（1:8 000）孵育2h，洗膜，ESL化學(xué)顯影、曝光，分析各條帶光密度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖活性比較 MTT結(jié)果提示，與對(duì)照組（黃連素濃度為0μmol·L-1）比較，黃連素濃度≥40μmol·L-1時(shí)，MDA-MB-231 細(xì)胞存活率明顯下降（P＜0.01，P＜0.001）。見(jiàn)表 1。

2.2 各組細(xì)胞GRP78蛋白表達(dá)比較 與對(duì)照組比較，20μmol·L-1黃連素對(duì) GRP78 表達(dá)無(wú)顯著影響（P＞0.05），40、60μmol·L-1黃連素組 GRP78 表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.01）；與 20μmol·L-1黃連素比較，40μmol·L-1黃連素組 GRP78 表達(dá)降低（P＜0.01）；與 40μmol·L-1黃連素比較，60μmol·L-1黃連素組 GRP78表達(dá)降低（P＜0.01）。見(jiàn)圖1。說(shuō)明黃連素對(duì)GRP78表達(dá)的影響具有一定的量效關(guān)系，因此后續(xù)研究中以40μmol·L-1和60μmol·L-1作為黃連素濃度，進(jìn)一步檢測(cè)黃連素對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。

表1 各組MDA-MB-231細(xì)胞存活率比較（%）Tab.1 Comparison of cell survival rate in each group(%)

圖1 各組細(xì)胞GRP78蛋白表達(dá)比較Fig.1 Comparison of expression of GRP78 in each group

2.3 各組細(xì)胞凋亡情況比較 與對(duì)照組比較，40、60μmol·L-1黃連素組細(xì)胞凋亡率顯著增加（P＜0.01），而BiX組細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.05），說(shuō)明GRP78的激活可以抑制MDA-MB-231細(xì)胞凋亡，黃連素能促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡。與BiX組比較，BiX聯(lián)合 40、60μmol·L-1黃連素組細(xì)胞凋亡率增加 （P＜0.01）。與 BiX 聯(lián)合 40μmol·L-1黃連素組比較，BiX 聯(lián)合60μmol·L-1黃連素組MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率增加（P＜0.01），說(shuō)明黃連素可以逆轉(zhuǎn)BiX對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用，促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡。見(jiàn)圖2。

2.4 各組細(xì)胞GRP78和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較與對(duì)照組比較，40μmol·L-1和 60μmol·L-1黃連素組中Bax蛋白表達(dá)均增高（P＜0.01），而GRP78和Bcl-2蛋白表達(dá)均減低（P＜0.01）；BiX組細(xì)胞中Bax表達(dá)減低（P＜0.05），而 GRP78和 Bcl-2表達(dá)增高（P＜0.01，P＜0.001）。與 BiX 組比較，BiX 聯(lián)合 40μmol·L-1黃連素組和BiX聯(lián)合60μmol·L-1黃連素組細(xì)胞中Bax表達(dá)均顯著增加（P＜0.01），GRP78和Bcl-2的表達(dá)均降低（P＜0.01）。40μmol·L-1和 60μmol·L-1黃連素組比較，以上蛋白表達(dá)組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。Bix聯(lián)合 40μmol·L-1黃連素組和 Bix 聯(lián)合 60μmol·L-1黃連素組比較，以上蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖3。

圖2 各組細(xì)胞凋亡情況比較Fig.2 Comparison of cell apoptosis in each group

圖3 各組細(xì)胞GRP78和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較Fig.3 Comparison of expression of GRP78 and apoptosis related proteins in each group

3 討論

乳腺癌是嚴(yán)重影響女性健康的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率逐年上升，是世界發(fā)病率排名第二的腫瘤性疾病。同其他大多數(shù)國(guó)家一樣，目前乳腺癌已成為我國(guó)婦女最常見(jiàn)的癌癥，而且其發(fā)病率正不斷增高[1]。TNBC是一種具有高侵襲性、高復(fù)發(fā)性的乳腺癌病理亞型[9]，由于ER、PR和HER-2均呈陰性，TNBC缺乏明確的治療靶點(diǎn)，臨床上患者術(shù)后多使用含有蒽環(huán)類或紫杉醇類的藥物輔助化療。TNBC對(duì)致DNA損傷或抑制DNA損傷修復(fù)的藥物敏感，但易產(chǎn)生耐藥性，被認(rèn)為是預(yù)后最差的乳腺癌亞型之一[10]。因此探索安全、不良反應(yīng)小、效用性強(qiáng)的治療藥物和方案成為TNBC研究中亟待解決的問(wèn)題。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)在腫瘤防治中發(fā)揮了重要作用，現(xiàn)代研究也表明許多中藥復(fù)方和單味藥均具有良好的抗腫瘤活性[11]，故從中藥中篩選安全、有效、價(jià)格合適的藥用成分用于腫瘤治療和預(yù)防的研究成為熱點(diǎn)。

既往臨床研究中，黃連素主要用于治療腹瀉、痢疾、瘧疾等胃腸道感染性疾病，近年來(lái)體內(nèi)和體外研究表明，黃連素對(duì)乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌等都有抗腫瘤作用，其機(jī)制與抑制腫瘤細(xì)胞增殖，并能誘導(dǎo)腫瘤來(lái)源的細(xì)胞凋亡有關(guān)[12-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，黃連素作用24h后，MDA-MB-231細(xì)胞增殖受到抑制，細(xì)胞凋亡率增加。蛋白質(zhì)是生物學(xué)功能的執(zhí)行者，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫印跡技術(shù)檢測(cè)了凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，40、60μmol·L-1黃連素處理 MDA-MB-231 細(xì)胞24h后，促凋亡基因Bax的蛋白表達(dá)上調(diào)，凋亡抑制基因Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)，表明黃連素能調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡。

GRP78是熱休克蛋白家族的成員之一，又稱免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白（immunoglobulin heavy chain binding protein，Bip），是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特征性蛋白[15]，不僅參與腫瘤內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，幫助未折疊蛋白折疊，還可參與細(xì)胞表面信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)控細(xì)胞凋亡[16]。腫瘤組織生長(zhǎng)過(guò)快，易發(fā)生缺血缺氧，導(dǎo)致內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)失衡，從而促使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)的未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白積累，這種現(xiàn)象最終激活未折疊蛋白反應(yīng)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，誘導(dǎo)GRP78表達(dá)，促使過(guò)表達(dá)的GRP78與未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白疏水性殘基端以及鈣離子識(shí)別結(jié)合，減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白積累，維持鈣離子平衡，恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)生理功能[17]。此外，GRP78還可與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活的促凋亡受體結(jié)合，抑制其信號(hào)表達(dá)，從而保護(hù)細(xì)胞，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[18]。研究表明，腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，往往伴有GRP78表達(dá)上調(diào)，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡并促進(jìn)腫瘤發(fā)生耐藥、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)，隨著乳腺癌臨床分期的延后，GRP78表達(dá)不斷增高[19]。研究已證實(shí)，在各種癌細(xì)胞系，以及實(shí)體瘤組織和活組織檢查標(biāo)本中GRP78表達(dá)升高[20-21]。研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者中GRP78的過(guò)表達(dá)與化療耐藥相關(guān)[22]。在乳腺癌細(xì)胞中，GRP78的表達(dá)在細(xì)胞凋亡通路調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用[23]，提示GRP78不僅可以作為指示乳腺癌發(fā)生的一個(gè)指標(biāo)，還可以作為乳腺癌治療的一個(gè)靶點(diǎn)?，F(xiàn)有研究表明，黃連素能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，并可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡[7]。本研究提示，BiX誘導(dǎo)GRP78的過(guò)表達(dá)能夠?qū)е翸DA-MB-231細(xì)胞凋亡率降低，促進(jìn)Bcl-2表達(dá)，抑制Bax表達(dá)，說(shuō)明GRP78表達(dá)與TNBC細(xì)胞凋亡有關(guān)。而與BiX組比較，BiX聯(lián)合40、60μmol·L-1黃連素處理后，細(xì)胞凋亡率增加，細(xì)胞中GRP78表達(dá)受到抑制，Bax表達(dá)增加，Bcl-2的表達(dá)下調(diào)，說(shuō)明了黃連素能夠抑制GRP78的表達(dá)，從而逆轉(zhuǎn)BiX對(duì)凋亡的調(diào)控作用，促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，黃連素可能通過(guò)下調(diào)MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)GRP78的表達(dá)，增加促凋亡基因Bax的表達(dá)，并抑制凋亡抑制基因Bcl-2表達(dá)，從而促進(jìn)MDAMB-231細(xì)胞凋亡。