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1.浙江中醫(yī)藥大學(xué) 杭州 310053 2.浙江省疾病預(yù)防控制中心

甲型流感病毒是單股負(fù)鏈RNA病毒，常常引起全球范圍內(nèi)的流感爆發(fā)流行[1]。目前臨床用于抗流感病毒的藥物均以流感病毒為靶點(diǎn)，如奧司他韋與金剛烷胺類藥物分別通過抑制流感病毒神經(jīng)氨酸酶與病毒基質(zhì)蛋白M2的離子通道來抑制流感病毒復(fù)制[2-3]。由于流感病毒極易產(chǎn)生抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)換，而且針對(duì)單一靶點(diǎn)的藥物長期使用容易誘導(dǎo)相應(yīng)耐藥毒株產(chǎn)生[4-5]，因此尋求新的多靶點(diǎn)包括以宿主細(xì)胞為靶點(diǎn)的抗流感藥物，是一個(gè)新的研究方向[6]，可有效避免流感病毒產(chǎn)生耐藥性。

中藥含有多種活性成分，具有多組分、多靶點(diǎn)作用的特點(diǎn)，在抗流感病毒的新藥研究方面具有一定的優(yōu)勢。蘭科植物白及（Bletilla striata）是我國的傳統(tǒng)中藥，具有消炎、止血、抗菌等藥理作用[7]。已有研究證實(shí)，白及中聯(lián)芐類化合物具有抑制流感病毒神經(jīng)氨酸酶以及RNA聚合酶中內(nèi)切酶的活性[8-9]，而是否具有以宿主細(xì)胞為靶點(diǎn)的抗病毒活性尚不清楚。因此，本研究以流感病毒A/Sydney/5/97（influenza virus A/Sydney/5/97，H3N2）感染的考克斯班尼犬腎臟（Madin-Darby canine kidney，MDCK）細(xì)胞為模型，探討白及水提物對(duì)流感病毒感染的宿主細(xì)胞基因表達(dá)的影響，進(jìn)一步闡明其抗病毒作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 主要試劑與儀器 MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、L-谷氨酰胺、青-鏈霉素雙抗、0.25%的胰酶溶液、PBS緩沖液均購于美國 Gibco公司（批號(hào)：1917763、1872300、1967368、1728804、1737903、1864553）；Trizol Reagent購于美國Invitrogen公司（批號(hào)：152104）；PrimeScriptTMOne Step反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于TaKaRa公司（批號(hào)：AK4801）。QuanStudio 12K Flex型熒光定量PCR儀購于美國Applied Biosystems公司。

1.1.2 流感病毒株與MDCK細(xì)胞 流感病毒株H3N2及MDCK細(xì)胞由浙江省疾病預(yù)防控制中心提供。MDCK細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%雙抗及1%L-谷氨酰胺的MEM培養(yǎng)基中；維持液為含1%雙抗及1%L-谷氨酰胺的無血清MEM培養(yǎng)基。流感病毒接種于9日齡SPF雞胚尿囊腔，連續(xù)傳代3次后，血凝實(shí)驗(yàn)測得病毒原液血凝滴度為1:512，對(duì)MDCK細(xì)胞的半數(shù)組織培養(yǎng)感染量（50%tissue culture infective dose，TCID50）為 10-3.562·0.1mL-1。

1.1.3 白及提取物的制備 白及由浙江中醫(yī)藥大學(xué)丁志山教授提供并鑒定。白及塊莖洗凈后，35℃烘箱烘干，然后粉碎，過40目篩。準(zhǔn)確稱取200g白及粉末，以3 000mL蒸餾水回流提取2h，減壓抽濾，再向?yàn)V渣中加入1 500mL蒸餾水回流提取并抽濾。將兩次濾液合并，減壓濃縮，干燥備用。白及提取物以PBS配制成生藥質(zhì)量濃度為0.8g·mL-1的儲(chǔ)備液。測得其對(duì)MDCK細(xì)胞作用24h的最大無毒濃度（the maximum non-toxic concentration，TC0）為 40.0mg·mL-1。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 白及提取物對(duì)病毒感染細(xì)胞的影響 收集MDCK細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個(gè)/mL，將細(xì)胞懸液按每孔1.0mL的體積接種于24孔板中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待24孔板中的MDCK細(xì)胞完全貼壁形成單層后，棄去培養(yǎng)基，以PBS洗滌3次后，在病毒對(duì)照組與藥物處理組中分別接種1.0mL含100TCID50的病毒液，吸附1h后，棄去病毒液，再以PBS洗滌3次。分別向正常細(xì)胞組與病毒對(duì)照組加入1.0mL細(xì)胞維持液，藥物處理組則加入1.0mL含有白及提取物的維持液，白及提取物終濃度為40.0mg·mL-1。各組細(xì)胞置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞內(nèi)總RNA的提取與完整性鑒定 培養(yǎng)24h后，吸去24孔板中的維持液，以PBS洗滌細(xì)胞2次，加入Trizol裂解液，以移液器反復(fù)吸打數(shù)次，待細(xì)胞層溶解完全后，-80℃保存?zhèn)溆谩２⒉捎肨rizol法提取各組細(xì)胞內(nèi)的總RNA[10]，熒光定量PCR定量后并用瓊脂糖甲醛變性凝膠電泳檢測總RNA完整性。

1.2.3 基因表達(dá)譜分析以及最佳差異基因篩選 總RNA完整樣品由北京博奧晶典生物技術(shù)公司進(jìn)行表達(dá)譜分析。對(duì)表達(dá)譜散點(diǎn)圖進(jìn)行比對(duì)后，將發(fā)生差異變化的基因進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）功能聚類分析，包括細(xì)胞組分（cellular component，CC）、分子功能（mlecular function，MF）、生物學(xué)過程（biological process，BP）3個(gè)方面，并采用京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）綜合數(shù)據(jù)庫分析甲型流感病毒通路、磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B（phosphoinositide-3-kinase-protein kinase B,PI3K-AKT）信號(hào)通路、視黃酸誘導(dǎo)基因-1樣受體（retinoic acid inducible gene-1-like receptor,RIG-1-like）信號(hào)通路這3條細(xì)胞信號(hào)通路中的差異基因。差異基因篩選采用blindDe-scription 統(tǒng)計(jì)學(xué)模型，以變化倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）≥2或者≤0.5為篩選標(biāo)準(zhǔn)。FC≥2為上調(diào)基因，≤0.5為下調(diào)基因。

1.2.4 熒光定量PCR驗(yàn)證相關(guān)基因差異表達(dá) 對(duì)顯著差異表達(dá)的基因設(shè)計(jì)引物，引物序列見表1。通過熒光定量PCR得到樣品基因的CT值并計(jì)算ΔCT與ΔΔCT，ΔCT=目的基因的CT值-內(nèi)參基因的CT值，ΔΔCT=藥物處理組 ΔCT-病毒對(duì)照組 ΔCT。以 2∣ΔΔCT∣計(jì)算各組間基因差異表達(dá)倍數(shù)[11]。其中ΔΔCT＜0表示基因上調(diào)；ΔΔCT＞0表示基因下調(diào)。選取其中基因差異表達(dá)倍數(shù)＞5倍的基因，比較白及提取物作用0、4、8、16、24h后其mRNA表達(dá)量。所有樣品基因均經(jīng)內(nèi)參基因GAPDH的均一化處理。以2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量[12]。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以±s表示，各組間差異采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用顯著差異法（LSD-t）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白及提取物抑制流感病毒感染MDCK細(xì)胞的基因表達(dá) 利用基因表達(dá)譜芯片進(jìn)行表達(dá)譜分析，以藥物處理組熒光值與病毒對(duì)照組熒光值的比值表示差異表達(dá)。結(jié)果如圖1所示。黑色散點(diǎn)表示沒有發(fā)生顯著變化的基因，紅色散點(diǎn)表示表達(dá)上調(diào)2倍以上的基因，綠色散點(diǎn)表示下調(diào)0.5倍以上的基因。通過分析，獲得856個(gè)上調(diào)基因，占總基因的2.62%；1 158個(gè)下調(diào)基因，占總基因的3.54%。

2.2 差異表達(dá)基因GO功能聚類分析 與病毒對(duì)照組比較，白及提取物處理后，與細(xì)胞的生理過程相關(guān)的基因出現(xiàn)顯著上調(diào)或下調(diào)。其中涉及細(xì)胞組分的有：軸絲（axoneme）、睫狀漿（ciliary plasm）、膜區(qū)（membrane region）、核亞端粒異染色質(zhì)（nuclear subtelomeric heterochromatin）、軸膜（axolemma）等；涉及分子功能的有：鳥苷酸結(jié)合（guanyl nucleotide binding）、鳥嘌呤核苷酸結(jié)合（guanyl ribonucleotide binding）、細(xì)胞因子活性（cytokine activity）、白細(xì)胞介素-10受體活性（interleukin-10 receptor activity）和核心啟動(dòng)子近區(qū)DNA結(jié)合（core promoter proximal region DNA binding）等；涉及生物學(xué)過程的有：病毒基因組復(fù)制的負(fù)調(diào)控（negative regulation of viral genome replication）、對(duì)病毒的防御反應(yīng)（defense response to virus）、病毒生命周期調(diào)控（regulation of viral life cycle）、蛋白質(zhì)代謝過程的正調(diào)控（positive regulation of protein metabolic process）、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1（extracellular regulated protein kinase 1,ERK1）和ERK2的級(jí)聯(lián)調(diào)控（regulation of ERK1 and ERK2 cascade）和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控（regulation of intracellular signal transduction）。見圖 2、3。

圖1 白及提取物抑制流感病毒感染MDCK細(xì)胞的基因表達(dá)譜散點(diǎn)圖Fig.1 Scatter diagram of gene expression profile of the extracts from the Bletilla Striata inhibit influenza virus infection of MDCK cells

2.3 差異基因的KEGG通路圖結(jié)果 甲型流感病毒通路中有11個(gè)差異基因上調(diào)，分別是熱休克蛋白70（heat-shock proteins 70，HSP70）、磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphoinositide-3-kinase，PI3K）、核因子 κB 抑制因子（inhibitor of nuclear factor κB,IκB）、白細(xì)胞介素-1（interleukin-1，IL-1）等；15 個(gè)基因下調(diào)，分別是黑色素瘤分化相關(guān)抗原5（melanoma differentiationassociated antigen 5，MDA5）、雙鏈 RNA 依賴的蛋白激酶（double-stranded RNA-dependent protein kinase，PKR）、Toll樣受體 3（Toll-like receptor 3，TLR3）、干擾素調(diào)節(jié)因子 7（interferon regulatory factor 7，IRF7）、腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）等。見圖 4、5。PI3K-AKT信號(hào)通路中有15個(gè)基因上調(diào)，分別是受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）、PI3K、P21、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK）、周期蛋白依賴性激酶（cyclindependent kinases，CDK）、細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）等；RIG-1-like信號(hào)通路中有9個(gè)基因下調(diào)，分別是MDA5、視黃酸誘導(dǎo)基因-1（retinoic acid inducible gene-1，RIG-1）、MEK 激酶 1（MEK kinase 1，MEKK1）、Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域（Fas-associated death domain，F(xiàn)ADD）、干擾素 κ（interferon κ，IFN κ）、干擾素誘導(dǎo)蛋白-10（interferon-inducible protein-10，IP-10）等。見圖 6、7。

2.4 熒光定量PCR的驗(yàn)證結(jié)果 熒光定量PCR檢測證實(shí)，與病毒對(duì)照組比較，白及提取物作用24h后，MHCⅡ類轉(zhuǎn)錄激活因子（MHC classⅡ transactivator,CⅡTA）、HSP70、PI3K、IκB 等基因的表達(dá)上調(diào)，而IRF7、TLR3、RIG、MDA5、PKR 等基因下調(diào)。上調(diào)基因CⅡTA、HSP70、PI3K、IκB 表達(dá)分別上升 4.32 倍、12.13 倍、17.88倍、18.25 倍；下調(diào)基因 IRF7、TLR3、RIG、MDA5、PKR 表達(dá)分別下降 2.50 倍、1.83 倍、20.53倍、2.37倍、6.23倍。見表2。

圖2 GO功能聚類分析顯示上調(diào)的基因條目Fig.2 Up-regulated genes on GO function luster analysis

依據(jù)差異表達(dá)倍數(shù) 2∣ΔΔCT∣≥5，來選擇與抗流感病毒作用相關(guān)顯著的基因。白及提取物作用后，基因HSP70、PI3K、IκB 表達(dá)上調(diào)，RIG、PKR4 表達(dá)下調(diào)，其差異表達(dá)倍數(shù)2∣ΔΔCT∣≥5，因此認(rèn)為以上基因與以宿主細(xì)胞為靶點(diǎn)的抗病毒作用相關(guān)性顯著；而基因CⅡTA上調(diào)以及基因IRF7、TLR3、MDA5下調(diào)，其差異表達(dá)倍數(shù) 2∣ΔΔCT∣＜5，則認(rèn)為與抗病毒作用相關(guān)性不顯著。

表2 不同差異基因ΔΔCT值以及表達(dá)倍數(shù)變化Tab.2 ΔΔCT values and expression fold changes of differential genes

圖3 GO功能聚類分析顯示下調(diào)的基因條目Fig.3 Down-regulated genes on GO function luster analysis

進(jìn)一步在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)相關(guān)性顯著的基因進(jìn)行的表達(dá)量分析。結(jié)果表明，與正常細(xì)胞組比較，病毒對(duì)照組基因HSP70、IκB和PI3K的相對(duì)表達(dá)量隨著作用時(shí)間延長緩慢增高，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；隨著藥物作用時(shí)間延長，藥物處理組HSP70、IκB和PI3K基因的相對(duì)表達(dá)量明顯增高，與同時(shí)點(diǎn)病毒對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與正常細(xì)胞組比較，病毒對(duì)照組基因RIG、PKR4的相對(duì)表達(dá)量隨著作用時(shí)間延長逐漸增高，作用16、24h時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；隨著藥物作用時(shí)間延長，藥物處理組RIG、PKR4的mRNA表達(dá)受到抑制，與同時(shí)點(diǎn)病毒對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。表明熒光定量PCR的驗(yàn)證結(jié)果與基因表達(dá)譜相一致。見圖8-12。

3 討論

流感病毒復(fù)制過包括病毒的吸附、穿入、復(fù)制、顆粒的組裝和釋放等過程，流感病毒的復(fù)制增殖需要宿主蛋白、細(xì)胞因子和細(xì)胞信號(hào)通路的參與，根據(jù)流感病毒的這一復(fù)制特點(diǎn)，抗流感病毒的藥物可從以下幾個(gè)方面發(fā)揮作用：（1）阻斷流感病毒血凝素（hemagglutinin，HA）吸附于宿主細(xì)胞膜上的糖蛋白唾液酸（sialic acid，SA）受體，禁止其通過SA受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞；（2）抑制流感病毒的轉(zhuǎn)錄和遺傳物質(zhì)復(fù)制；（3）抑制子代病毒從宿主細(xì)胞表面釋放；（4）調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的信號(hào)通路。流感病毒感染后，可誘導(dǎo)宿主細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路發(fā)生一系列變化，而抗流感病毒藥物，尤其是多組分多作用靶點(diǎn)的中藥，可以通過調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的信號(hào)通路，從而干擾病毒與宿主間的相互作用來達(dá)到抗病毒的目的。

圖4 甲型流感病毒通路中相關(guān)上調(diào)基因Fig.4 Up-regulated genes in influenza virus A pathway

圖5 甲型流感病毒通路中相關(guān)下調(diào)基因Fig.5 Down-regulated genes in influenza virus A pathway

圖6 PI3K-AKT信號(hào)通路中相關(guān)上調(diào)基因Fig.6 Up-regulated genes in PI3K-AKT signaling pathway

圖7 RIG-1-like信號(hào)通路相關(guān)下調(diào)基因Fig.7 Down-regulated genes in RIG-1-like signaling pathway

圖8 PI3K基因mRNA表達(dá)水平變化Fig.8 Changes of mRNA expression level of PI3K gene

圖9 IκB基因mRNA表達(dá)水平變化Fig.9 Changes of mRNA expression level of IκB gene

圖10 HSP70基因mRNA表達(dá)水平變化Fig.10 Changes of mRNA expression level of HSP70 gene

圖11 RIG基因mRNA表達(dá)水平變化Fig.11 Changes of mRNA expression level of RIG gene

圖12 PKR4基因mRNA表達(dá)水平變化Fig.12 Changes of mRNA expression level of PKR4 gene

相關(guān)研究表明，PI3K-AKT信號(hào)通路對(duì)流感病毒感染宿主細(xì)胞具有雙向調(diào)控機(jī)制，激活PI3K可刺激干擾素產(chǎn)生，說明激活PI3K-AKT信號(hào)通路可以發(fā)揮抗病毒作用；而病毒感染晚期通過負(fù)向調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號(hào)通路和c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）通路抑制感染細(xì)胞的凋亡，從而阻止病毒的擴(kuò)散，同時(shí)還能夠抑制流感病毒復(fù)制[13-14]，因而通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號(hào)通路中的相關(guān)基因表達(dá)可發(fā)揮抗流感病毒作用。另一重要信號(hào)通路為絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）信號(hào)通路，可分為Ras/ERK信號(hào)通路、JNK信號(hào)通路、p38信號(hào)通路幾個(gè)部分。有研究表明，在細(xì)胞膜表面聚集流感病毒HA能促使MAPK信號(hào)通路的活化，使核蛋白有效運(yùn)出，因此抑制MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激活也是抑制流感病毒感染的一個(gè)重要途徑[15-17]。核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號(hào)通路也與流感病毒感染相關(guān)，NF-κB抑制劑除了有直接的抗病毒作用外，還會(huì)抑制高致病性流感病毒感染細(xì)胞后細(xì)胞因子和趨化因子的過度產(chǎn)生[18]。

細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體包括RIG-1和MDA5以及Toll樣受體，其中RIG-1與病毒RNA聚合酶的PB2、PB1、PA三種亞基組成有關(guān)，調(diào)節(jié)RIG-1的表達(dá)量可以抑制流感病毒的復(fù)制[19-21]。此外，病毒的雙鏈RNA可以與RIG-1和PKR結(jié)合并使之激活。PKR激活后，真核細(xì)胞起始因子2α（eukaryotic initiation factor 2α，eIF2α）也一并被激活，還可以磷酸化并激活NF-κB的抑制物IκB[22]；從而進(jìn)一步將信號(hào)傳導(dǎo)至MAPK家族，激活MAPK-p38信號(hào)通路或MAPK-JNK信號(hào)通路，通過下調(diào)病毒感染后表達(dá)升高的p38和JNK，進(jìn)而發(fā)揮抗病毒作用[23]。由此表明，RIG-1-like信號(hào)通路、PKR信號(hào)通路相關(guān)基因都可以成為抗流感病毒藥物發(fā)揮抗病毒作用的靶點(diǎn)。

HSPs是一種應(yīng)激蛋白，其中HSP70的基因結(jié)構(gòu)最為保守，在病毒感染過程中作用也最為重要。HSP70在流感病毒生命周期各階段均發(fā)揮一定的調(diào)控作用，其作用涵蓋流感病毒的入侵、轉(zhuǎn)錄、核轉(zhuǎn)位以及病毒粒子的形成過程，可與細(xì)胞凋亡蛋白激活因子-1（apoptosis protease-activating factor-1，Apaf-1）結(jié)合，進(jìn)而抑制感染流感病毒的宿主細(xì)胞凋亡[22,24]，抑制病毒擴(kuò)散，從而達(dá)到抗流感病毒的效果。

本研究通過基因表達(dá)譜技術(shù)分析甲型流感通路、PI3K-AKT信號(hào)通路、RIG-1-like信號(hào)通路的差異表達(dá)基因，并利用熒光定量PCR進(jìn)行驗(yàn)證，證實(shí)與病毒對(duì)照組和正常細(xì)胞組比較，白及提取物處理后差異表達(dá)基因 HSP70、IκB、PI3K 明顯上調(diào)，RIG、PKR4 明顯下調(diào)。已有研究證實(shí)，以上三條信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)水平與流感病毒感染有一定的相關(guān)性[25-27]。因此筆者推測，白及提取物可以通過調(diào)控宿主細(xì)胞相關(guān)基因通路中的基因表達(dá)水平來發(fā)揮抗流感病毒作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，白及提取物作用于甲型流感病毒H3N2感染的MDCK細(xì)胞，通過調(diào)控PI3KAKT信號(hào)通路、RIG-1-like信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、Toll樣信號(hào)通路以及NF-κB信號(hào)通路中的差異基因表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮抗流感病毒作用。但由于上述信號(hào)通路涉及較多基因，且有關(guān)調(diào)控機(jī)制較為復(fù)雜，因此，白及提取物以宿主細(xì)胞為靶點(diǎn)抗流感病毒的深入機(jī)制有待進(jìn)一步研究。