施豪波，余一凡，羅苑芬，馬 玲，王余峰，歐陽寒明，陳茂東，張向群南方醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，廣東 廣州 5035；南方醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，廣東 廣州 5055

動脈粥樣硬化（AS）是心腦血管事件及外周血管性疾病的基本病理學(xué)基礎(chǔ)，準(zhǔn)確檢測粥樣硬化斑塊的形成是防治心腦血管疾病發(fā)生的關(guān)鍵，動脈血流導(dǎo)致不穩(wěn)定的流體動力學(xué)在動脈粥樣硬化形成有明顯相關(guān)性[1-4]。其中，動脈局部血管壁切應(yīng)力（WSS）作為一項(xiàng)重要的血流動力學(xué)因素，其相關(guān)參數(shù)與動脈粥樣硬化之間的相關(guān)性已經(jīng)有研究證實(shí)[5-8]。目前，常用磁共振血管成像技術(shù)[9]、高分辨率磁共振成像[10]、三維容積各向同性快速自旋回波[11]、超聲等技術(shù)對AS進(jìn)行評估，但上述方法均無法測量血管內(nèi)整個(gè)橫截面上的平面速度的空間分布[12-13]。PC-MRI技術(shù)可以利用血液流動產(chǎn)生的相位變化測量血流速度，既能顯示血管解剖結(jié)構(gòu)，又能提供血流方向、血流速度及流量等血流動力學(xué)信息[14-15]。因此，可以利用PCMRI和計(jì)算流體力學(xué)方法分析、評估動脈血流動力學(xué)在動脈粥樣硬化形成過程中的作用[16]。既往研究均采用體外理想化模型，同時(shí)量化WSS[12]，無法模擬復(fù)雜的人體內(nèi)環(huán)境。本研究擬通過建立動物模型，模擬實(shí)際個(gè)體之間的解剖和流動環(huán)境，通過PC-MRI技術(shù)分析及評估在體的血流動力學(xué)與動脈粥樣硬化之間的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

購買南方醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心健康新西蘭白兔13只，6月齡，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，雌雄各半。本實(shí)驗(yàn)已獲得南方醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院倫理委員會審核并通過。

1.2 動物模型的建立

高膽固醇飼料配方：蛋黃粉（14%）,豬油（5%）,膽固醇（1%）；基礎(chǔ)飼料配方：粗蛋白（21.1%）、粗纖維（10.3%）、粗灰分（7.4%）、水分（9%）、鈣（1.3%）、磷（0.73%）；以上飼料均由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

喂養(yǎng)方式：動物適應(yīng)環(huán)境2周后，隨機(jī)分為A、B、C、D、E組，每組2～3只，再高膽固醇飼料喂養(yǎng)2、3、4、5、6月。每組給料量相同,為120～150 g/d；分2次喂料，1次/12 h，自由飲水。

1.3 PC-MRI檢測動脈粥樣硬化

所有兔子PC-MRI檢查掃描前均抽7 mL血進(jìn)行檢驗(yàn)，觀察血脂變化。所有PC-MRI檢查均在1.5 T掃描儀（Signa Excite，GE Medical Systems）上完成，用戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔內(nèi)注射麻醉，使用回顧性心電門控，使數(shù)據(jù)采集涵蓋整個(gè)心動周期，促發(fā)延遲時(shí)間選擇最短。先行定位掃描，再行2D快速電影PC序列掃描，掃描參數(shù)：TR/TE=自動選擇最小重復(fù)時(shí)間/最小回波時(shí)間，翻轉(zhuǎn)角20°，視野20 cm×20 cm，矩陣256×256，ETL：1，激勵次數(shù)：1，帶寬31.25 kHz，掃描層厚7 mm,掃描時(shí)相60。模擬心率選擇230次/min。固定相位編碼數(shù)值為150 cm/s，固定相位編碼方向?yàn)镾lice，將實(shí)際流速設(shè)定為150 cm/s為中位值，向上、向下分別遞增、遞減10%，遞增、遞減各4組，共獲得60組流速測定數(shù)據(jù)。以兔腎動脈分叉上方1 cm處主動脈為靶血管，采用PC-MRI定量血流測定技術(shù),運(yùn)用以上校正后的參數(shù)進(jìn)行掃描。

1.4 MRI血流數(shù)據(jù)分析

使用南方醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院的血流動力學(xué)參數(shù)處理軟件對所得包含血流動力學(xué)信息的圖像進(jìn)行后處理。首先在相位圖上勾畫血管邊界，將容差值（最大信號強(qiáng)度與血管邊界像素的信號強(qiáng)度之差）設(shè)為80%，計(jì)算機(jī)根據(jù)信號閾值的差別自動找到邊界點(diǎn)，擬合為圓形。將此設(shè)為血管的初始邊界，并自動復(fù)制至相應(yīng)時(shí)相的相位圖上。進(jìn)而應(yīng)用相位圖進(jìn)行動脈血流參數(shù)的計(jì)算，包括血管斷面面積、每時(shí)相最大速度、平均血流速度、及瞬時(shí)血流速度。利用MATLAB軟件繪出時(shí)間－流率曲線。血流率最大值、最小值所在時(shí)相對應(yīng)為收縮峰值期和舒張末期。以合作單位建立的三維拋物面模型血流分析軟件和WSS計(jì)算方法為基礎(chǔ)，精確計(jì)算靶血管WSS。

1.5 病理標(biāo)本的制作

第2月解剖A組兔輔主動脈全程，取材于兔腎動脈分叉上方1 cm處的主動脈，采用冷凍切片常規(guī)HE染色方法，5 μm不連續(xù)切片，4 ℃冰丙酮同定30 s水洗，蘇木精液染色40～60 s后水洗5～10 s（必要時(shí)1%鹽酸酒精分化溫水返藍(lán)），伊紅滴后速洗，梯度酒精脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片，每條動脈組織隨機(jī)抽取4張切片，光鏡下觀察血管壁細(xì)胞核的形態(tài)及分布，用AutoCad圖像分析軟件測量血管內(nèi)徑、壁厚和壁厚內(nèi)徑比。第3月按上述方法處理B組兔，以此類推，第6月處理E組兔；染色后切片由病理學(xué)專家判斷有無斑塊形成。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

利用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理，利用PCMRI獲得的各組數(shù)據(jù)，著重分析高脂喂養(yǎng)前、后兔主動脈壁WSS之間的差異，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血脂的變化

兔的正常血膽固醇1.59 mmo/L，甘油三酯1.99 mmol/L，高密度脂蛋白0.39 mmol/L，低密度脂蛋白0.62 mmol/L。5只兔于高脂喂養(yǎng)、麻醉過程中死亡，死亡后解剖病理為脂肪肝、腹水。剩余8只經(jīng)耳緣靜脈采血驗(yàn)血膽固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白（表1），按喂養(yǎng)時(shí)間排序。

2.2 空白組及實(shí)驗(yàn)組的PC-MRI檢測結(jié)果

利用PC-MRI獲得的兔主動脈血流信號后處理得高脂喂養(yǎng)前、后主動脈壁WSS的大小，并與其相對應(yīng)主動脈AS程度（按喂養(yǎng)時(shí)間排序）。對照組的WSS為（17.03±1.14）×10-2Pa，實(shí)驗(yàn)組兔的WSS為（28.79±3.50）×10-2Pa，對照組與實(shí)驗(yàn)組主動脈WSS差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表2）。對照組兔流速12.28±2.51 cm/s，實(shí)驗(yàn)組兔流速22.31±6.24 cm/s，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3.19，P=0.01，表3）。對照組與實(shí)驗(yàn)組主動脈的血流率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（4.51±1.13 mL/svs5.79±1.89 mL/s，F(xiàn)=0.66，P=0.24，表4）。

表1 兔血中膽固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白的變化（mmo1/L）

表2 兔高脂喂養(yǎng)前、后主動脈壁WSS的比較及病理對照表

表3 兔高脂喂養(yǎng)前、后主動脈血流平均流速比較（cm/s）

表4 兔高脂喂養(yǎng)前、后主動脈血流率比較（mL/s）

C2兔高脂喂養(yǎng)前血流呈層流分布，最大血流流速位于管腔中心；高脂喂養(yǎng)后最大血流流速大于高脂喂養(yǎng)前最大血流流速，高脂喂養(yǎng)后血流流速分布中心發(fā)生偏移；三維血流流速圖可以更直觀觀察（圖1）。

圖1 C2兔高脂喂養(yǎng)前、后血流流速分布的重構(gòu)圖形及主動脈橫軸位圖

2.3 病理標(biāo)本的觀察

13只兔高脂飲食飼養(yǎng)中途，其中5只兔子死亡，剩下的8只兔分別在高脂喂養(yǎng)，分別于高脂飲食喂養(yǎng)2、3、4、5、6月后取病理。兔子麻醉固定后，切開腹部暴露主動脈血管觀察：隨著高脂飲食飼養(yǎng)時(shí)間延長，兔主動脈動脈管壁逐漸變厚，顏色由紫紅色向黃色過渡；縱向剪開血管，高脂飲食喂養(yǎng)3月或更長時(shí)間的兔子主動脈可見多個(gè)黃色斑塊附著于血管壁。取出大體標(biāo)本后用甲醛溶液固定，采用冷凍切片常規(guī)HE染色方法，顯微鏡下觀察主動脈血管。主動脈血管內(nèi)膜明顯增厚，增厚的內(nèi)膜主要由平滑肌細(xì)胞組成，內(nèi)可見多簇泡沫細(xì)胞積聚，血管內(nèi)腔狹窄。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)成功利用高脂喂養(yǎng)建立兔動脈粥樣硬化模型，利用PC-MRI技術(shù)得高脂喂養(yǎng)前兔的WSS為（17.03±1.14）×10-2Pa，高脂喂養(yǎng)后兔的WSS為（28.79±3.50）×10-2Pa，高脂喂養(yǎng)后的WSS大于高脂喂養(yǎng)的WSS，證明AS的形成與WSS具有一定相關(guān)性，WSS的增加是AS形成的重要因素之一。而有學(xué)者在研究人頸動脈粥樣硬化斑塊局部血流動力學(xué)改變時(shí)也提出斑塊周圍管壁切應(yīng)力呈不均勻升高[16]。這與部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果[17-18]相反，其原因可能是本實(shí)驗(yàn)探討血管壁WSS與AS的關(guān)系，而文獻(xiàn)[17-18]探討整個(gè)動脈管腔內(nèi)或一個(gè)區(qū)域內(nèi)的WSS平均值與AS的關(guān)系。此外，本研究發(fā)現(xiàn)高脂喂養(yǎng)后，兔主動脈的平均流速出現(xiàn)顯著增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與高脂喂養(yǎng)后兔的心臟負(fù)荷、主動脈的管腔改變、血液的粘稠度有關(guān)；高脂喂養(yǎng)后兔的血液呈高脂血癥改變，其中增加的正常血膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白等分子與血液粘稠度之間的關(guān)系，還需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步明確。

國內(nèi)外多數(shù)有關(guān)WSS對血管內(nèi)AS斑塊形成機(jī)理以及內(nèi)皮細(xì)胞功能和結(jié)構(gòu)作用的研究多是“離體”研究，且通常假定不同部位的血管內(nèi)WSS分布在動脈管壁內(nèi)是恒定一致的，施加平均的切應(yīng)力值對血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行研究。而這個(gè)平均化的剪應(yīng)力定律并不適用于“在體”的復(fù)雜環(huán)境，更是難以直接在“在體”狀態(tài)下對AS斑塊形成與發(fā)展規(guī)律的進(jìn)行揭示[4]。本研究通過高飼喂養(yǎng)建立在體模型，模擬實(shí)際病理內(nèi)環(huán)境下WSS在AS形成過程中的影響，以進(jìn)一步驗(yàn)證WSS在動脈粥樣硬化斑塊形成過程中的重要作用。PC-MRI技術(shù)作為一種非侵入性技術(shù)，可以較好的對動物模型的斑塊MRI特征、血流速度及壁切應(yīng)力進(jìn)行量化分析，從而提高對WSS對AS評估的準(zhǔn)確性，而WSS被認(rèn)為是斑塊形成的重要因素。相關(guān)研究表明，WSS是血管內(nèi)皮細(xì)胞功能與AS相關(guān)基因表達(dá)及血管結(jié)構(gòu)的重要決定因素[4,19-20]，WSS通過誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)[21-22]，引起內(nèi)皮細(xì)胞為適應(yīng)力學(xué)環(huán)境變化發(fā)生形態(tài)和功能的調(diào)整，從而導(dǎo)致血管重塑[23-27]。目前對于動脈硬化的評估不再單純依靠管腔的狹窄，而是更多地考慮是否有斑塊形成、斑塊的形態(tài)和組成成分，是否能夠早期預(yù)測出現(xiàn)AS的可能性；PC-MRI可以早期通過WSS的改變間接發(fā)現(xiàn)斑塊形成或提示AS形成，使得臨床能夠及時(shí)合理地予以治療，減少患者出現(xiàn)更加嚴(yán)重的病情幾率。

本研究發(fā)現(xiàn)利用PC-MRI的流速圖后處理得到血管內(nèi)三維血流流速分布圖，可以更加直觀得到高脂喂養(yǎng)前、后兔血流分布圖，可以看到高脂喂養(yǎng)前兔的血流分布呈層流形式，最大流速位于管腔中央；而AS形成后，兔的最大血流流速均較正常時(shí)增加，流速中心發(fā)生偏移，病理切片時(shí)均可觀察到相應(yīng)動脈管壁下出現(xiàn)較大斑塊的形成，病理分期均為纖維斑塊期或粥樣硬化期。這可能與兔主動脈AS斑塊形成后，局部血管管腔較正常時(shí)有所縮小有關(guān)，導(dǎo)致血流速度有所增加。通過本實(shí)驗(yàn)可初步得出PC-MRI技術(shù)可以有效、早期檢測靶血管的AS程度，而不依賴于管腔斑塊的形成；PC-MRI作為較為新興的MRI技術(shù)，是一種安全無創(chuàng)的檢查手段，信息量大，又能為臨床提供更為準(zhǔn)確的信息，對患者出現(xiàn)較好預(yù)后療效提供一個(gè)堅(jiān)定的影像學(xué)基礎(chǔ)。當(dāng)然，PC-MRI也有不足之處，如掃描時(shí)間相對較長，表面線圈也有待改善，呼吸和心臟大血管運(yùn)動也在一定程度上影響了圖像質(zhì)量。隨著PC-MRI掃描技術(shù)及后處理軟件不斷開發(fā)、完善及改進(jìn)，相信不久將來其可以在無創(chuàng)影像學(xué)檢查方面有更廣泛的應(yīng)用。

本實(shí)驗(yàn)采用MRI技術(shù)無創(chuàng)、在體測定血流WSS的方法研究，開創(chuàng)性的建立一種適于臨床適用的在體無創(chuàng)評估動脈AS的MRI方法。由于本次實(shí)驗(yàn)動物數(shù)量偏少，實(shí)驗(yàn)結(jié)論說服力稍欠強(qiáng)，需在后續(xù)實(shí)驗(yàn)繼續(xù)增加樣本量論證上述結(jié)論。