曾本和，王萬良，周建設(shè)，張忭忭，王金林， 劉海平，牟振波

(1.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院水產(chǎn)科學(xué)研究所，西藏 拉薩 850032；2.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院，西藏 拉薩 850000)

異齒裂腹魚(SchizothoraxoconnoriLloyd)隸屬鯉科(Cyprindiae)裂腹魚亞科(Schizothracinae)裂腹魚屬(Schizothorax)，別名棒棒魚，分布于雅魯藏布江上、中游的干支流及附屬水體，占雅魯藏布江漁獲物的35%～42%[1]，為產(chǎn)區(qū)主要經(jīng)濟(jì)魚類之一[2-4].雅魯藏布江屬于高原河流，餌料較少，生態(tài)脆弱；同時水溫低，魚生長慢，性成熟周期長.如果魚類生態(tài)被破壞，將極難恢復(fù).目前雅魯藏布江水域生態(tài)正遭受嚴(yán)峻的考驗(yàn)，首先，雅魯藏布江上的水電站建成將導(dǎo)致水域環(huán)境改變，生境片段化，極大威脅到土著魚類.其次，隨著經(jīng)濟(jì)、旅游業(yè)的發(fā)展和內(nèi)地人口的遷入，近年來對西藏魚類需求越來越大，出現(xiàn)了過度捕撈的現(xiàn)象，同時生活污水的排入，極大影響了西藏土著魚類資源量.再者，近年來雅魯藏布江外來物種入侵嚴(yán)重，導(dǎo)致西藏本土魚生存空間大大減少，土著魚類資源量嚴(yán)重縮減.20世紀(jì)70年代末，雅魯藏布江的裂腹魚類體質(zhì)量為500～1 000 g/尾，2010年漁獲物體質(zhì)量為200～709 g/尾[1]，這說明雅魯藏布江裂腹魚資源量正在小型化.雖然異齒裂腹魚人工繁殖成功，但規(guī)?；庇钠款i尚未攻坡.人工繁育過程中水霉嚴(yán)重，導(dǎo)致魚卵孵化率極低，造成大量經(jīng)濟(jì)損失.

水霉病是淡水魚繁育過程中的常見病害之一，其病原是水霉(Saprolegnia)，隸屬于茸鞭生物界(Stramenopila)水霉目(Saprolegniales)水霉科(Sprolegniaceae)[5].孔雀石綠是治療水霉病的有效藥物，但由于該藥具有高毒性，高殘留等問題[8-9]，2002年被農(nóng)業(yè)部列入《食品動物禁用的獸藥及其它化合物清單》.生產(chǎn)上雖然也使用過氧化氫、臭氧、氯化鈉、福爾馬林、腐植酸等化學(xué)藥物，但是這些藥物缺乏高效性，并且安全風(fēng)險較高而未得到廣泛認(rèn)可[10-12].中草藥具有安全、有效、毒副作用小、無二次污染、不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn).有關(guān)中草藥防治水產(chǎn)動物水霉病已有先例報道[13-14].

本試驗(yàn)以異齒裂腹魚魚卵為研究對象，選擇5種中藥設(shè)置梯度試驗(yàn)，從異齒裂腹魚魚卵到孵化出膜，每天用不同濃度的5種中藥浸泡，計算孵化率、畸形率、死卵率、水霉致死率和其他因素致死率，探討5種中草藥預(yù)防水霉傳染效果，為異齒裂腹魚水霉病防治提供參考依據(jù).

1 材料與方法

1.1 魚卵及孵化條件

異齒裂腹魚魚卵取自2017年4月在西藏自治區(qū)拉薩市曲水縣西藏土著魚類增殖育種場繁殖的同一批魚卵5.4萬粒(2條魚的混合魚卵)，平均受精率87%，為非粘性卵.將魚卵平均分為27組，每組2個平行，每個平行1 000粒卵.將魚卵放入孵化框放在4.3 m×2.7 m×0.5 m的水泥池中孵化.孵化用水為井水，井水在蓄水池中充分曝氣，曝氣后井水溶氧為8.5～9.9 mg/L；孵化水泥池微流水，水體每30 min交換1次，使孵化水體溶氧保持在6 mg/L以上；孵化期間井水水溫保持恒定，為(13.3±0.2)℃.

1.2 中藥的制備

5種中草藥購自于重慶長圣醫(yī)藥公司中藥部.分別稱取5種中藥，加10倍量的水浸泡1 h，文火煎煮1 h，60目紗布過濾，濾液保存；藥渣加10倍重量水，進(jìn)行第2次文火煎煮45 min，60目紗布過濾，濾液保存.藥渣再加10倍重量水，進(jìn)行第3次文火煎煮30 min，60目紗布過濾，濾液保存.將3次濾液合并，得到5種中藥的提取物.

1.3 試驗(yàn)設(shè)計

5種中藥均設(shè)置5個濃度梯度，同時設(shè)置1個陰性對照(空白對照，沒有任何藥物浸泡)和1個陽性對照(質(zhì)量濃度為4 mg/L孔雀石綠)，分組設(shè)置如表1所示.將藥液換算為中藥重量，按照表格中的比例在孵化盆中配備，將孵化框轉(zhuǎn)移到孵化盆中浸泡35 min[15]，浸泡過程中曝氣增氧，使水體溶氧含量保持在6 mg/L以上，浸泡結(jié)束再將孵化框轉(zhuǎn)移到孵化池中.

表1 試驗(yàn)分組

1.4 指標(biāo)測定

從魚卵形成至出膜期間，每天浸泡1次(9∶30～10∶05).每日藥浴前進(jìn)行活卵、水霉致死死卵(解剖鏡鏡檢，卵膜有水霉穿透)及其他因素致死(解剖鏡鏡檢，卵膜及胚胎沒有發(fā)現(xiàn)水霉)計數(shù).試驗(yàn)結(jié)束后，對每組出膜魚苗及畸形魚苗(身體畸形)進(jìn)行計數(shù)，孵化魚卵總數(shù)為試驗(yàn)開始時投放魚卵數(shù).

孵化率(%)=孵化魚苗數(shù)/孵化魚卵總數(shù)×100%

死卵率(%)=死卵數(shù)/孵化魚卵總數(shù)×100%

水霉致死率(%)=水霉致死卵數(shù)/孵化魚卵總數(shù)×100%

其他因素致死率(%)=其他因素致死卵數(shù)/孵化魚卵總數(shù)×100%

畸形率(%)=畸形魚苗數(shù)/出膜魚苗數(shù)×100%

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示.試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件中One-way ANOVA進(jìn)行方差分析，若組間差異顯著，再用Duncan氏進(jìn)行多重比較，差異顯著水平為α=0.05.

2 結(jié)果與分析

2.1 五倍子對異齒裂腹魚魚卵水霉的防治效果

對照組對異齒裂腹魚魚卵的作用見圖1.五倍子對異齒裂腹魚魚卵水霉防治效果見圖2.五倍子浸泡組魚卵孵化率及魚苗畸形率(表2)均顯著高于陰性對照組，低于陽性對照組(P<0.05)；水霉致死率均顯著低于陰性對照組，高于陽性對照組(P<0.05).不同濃度五倍子浸泡組中，1.5 g/L五倍子組水霉致死率最低，與2.4 g/L五倍子組效果差異不顯著(P>0.05)，顯著低于0.7、1.1和1.9 g/L五倍子組(P<0.05).0.7 g/L五倍子組孵化率最高，與1.1、2.4 g/L五倍子組差異不顯著(P>0.05)，顯著高于其他試驗(yàn)組(P<0.05).0.7 g/L五倍子組魚苗畸形率最低，與1.1 g/L五倍子組差異不顯著(P>0.05)，顯著低于其他試驗(yàn)組(P<0.05).綜合考慮異齒裂腹魚魚卵水霉致死率、孵化率及魚苗畸形率，五倍子適宜浸泡濃度為0.7、1.1、1.5 g/L.

表2 各試驗(yàn)組死卵率、孵化率及畸形率統(tǒng)計表

同列相同小寫字母或沒有字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05).

The same letter or no letter in the same column indicate no significant difference(P>0.05)，the different letters indicate significant difference (P<0.05).

2.2 大黃對異齒裂腹魚魚卵水霉防治效果

大黃對異齒裂腹魚魚卵水霉防治效果如圖3所示.大黃浸泡組魚卵孵化率及魚苗畸形率均顯著高于陰性對照組(表2)，低于陽性對照組(P<0.05)；水霉致死率均顯著低于陰性對照組，高于陽性對照組(P<0.05).不同濃度大黃浸泡組中，0.4 g/L大黃組水霉致死率最低，與0.7 g/L大黃組差異不顯著(P>0.05)，顯著低于其他試驗(yàn)組(P<0.05).0.4 g/L大黃組孵化率最高，與0.1 g/L大黃組差異不顯著(P>0.05)，顯著高于其他試驗(yàn)組(P<0.05).0.1 g/L大黃組魚苗畸形率最低，顯著低于其他試驗(yàn)組(P<0.05)；其次為0.4 g/L大黃組，顯著高于0.1 g/L大黃組(P<0.05)，顯著低于其他試驗(yàn)組(P<0.05).綜合考慮異齒裂腹魚魚卵水霉致死率、孵化率及魚苗畸形率，大黃適宜浸泡濃度為0.1、0.4 g/L.

圖1 陰性和陽性對照組異齒裂腹魚魚卵情況Figure 1 The situation ofSchizothorax oconnorifertilized eggs between negative and positive control groups

圖2 五倍子對異齒裂腹魚魚卵水霉防治效果Figure 2 The prevention and treatment effects ofRhus Chinensison fertilized eggs'SaprolegniaofSchizothorax oconnori

圖3 大黃對異齒裂腹魚魚卵水霉防治效果Figure 3 The prevention and treatment effects of Chinese rhubarb onSaprolegniaofSchizothorax oconnori

2.3 山蒼子對異齒裂腹魚魚卵水霉防治效果

山蒼子對異齒裂腹魚魚卵水霉防治效果如圖4所示.山蒼子浸泡組魚苗畸形率均顯著高于陰性對照組(表2)，低于陽性對照組(P<0.05)；水霉致死率均顯著低于陰性對照組，高于陽性對照組(P<0.05)；魚卵孵化率部分高于陽性對照組.不同濃度山蒼子浸泡組中，0.6 g/L山蒼子組水霉致死率最低，與1.1、1.6、2.1 g/L山蒼子組差異不顯著(P>0.05)，顯著低于0.1 g/L山蒼子組(P<0.05).0.6 g/L山蒼子組孵化率最高，與1.1、1.6 g/L山蒼子組差異不顯著(P>0.05)，顯著高于其他試驗(yàn)組(P<0.05).0.6 g/L山蒼子組魚苗畸形率最低，顯著低于其他試驗(yàn)組(P<0.05).綜合考慮異齒裂腹魚魚卵水霉致死率、孵化率及魚苗畸形率，山蒼子適宜浸泡濃度為0.6 g/L.

圖4 山蒼子對異齒裂腹魚魚卵水霉防治效果Figure 4 The prevention and treatment effects ofLitsea cubebaon fertilized eggs'SaprolegniaofSchizothorax oconnori

2.4 黃芩對異齒裂腹魚魚卵水霉防治效果

黃芩對異齒裂腹魚魚卵水霉防治效果如圖5所示.黃芩浸泡組魚卵孵化率及魚苗畸形率均顯著高于陰性對照組(表2)(P<0.05)；水霉致死率均顯著低于陰性對照組，高于陽性對照組(P<0.05).不同濃度黃芩浸泡組中，1.5 g/L黃芩組水霉致死率最低，顯著低于其他試驗(yàn)組(P<0.05).1.2 g/L黃芩組孵化率最高，顯著高于其他試驗(yàn)組(P<0.05).0.6 g/L黃芩組魚苗畸形率最低，顯著低于其他試驗(yàn)組(P<0.05).綜合考慮異齒裂腹魚魚卵水霉致死率、孵化率及魚苗畸形率，黃芩適宜浸泡濃度為0.6、0.9、1.2、1.5 g/L.

2.5 苦參對異齒裂腹魚魚卵水霉防治效果

苦參對異齒裂腹魚魚卵水霉防治效果如圖6所示.苦參浸泡組魚苗畸形率及魚卵孵化率均顯著高于陰性對照組(表2)(P<0.05)；水霉致死率均顯著低于陰性對照組，高于陽性對照組(P<0.05).不同濃度苦參浸泡組中，1.2 g/L苦參組水霉致死率最低，顯著低于其他試驗(yàn)組.1.5 g/L苦參組孵化率最高，但各試驗(yàn)組差異不顯著(P>0.05).0.9 g/L苦參組魚苗畸形率最低，顯著低于其他試驗(yàn)組(P<0.05).綜合考慮異齒裂腹魚魚卵水霉致死率、孵化率及魚苗畸形率，苦參適宜浸泡濃度為0.9、1.2、1.5 g/L.

圖5 黃芩對異齒裂腹魚魚卵水霉防治效果Figure 5 The prevention and treatment effects ofScutellaria baicalensison fertilized eggs'SaprolegniaofSchizothorax oconnori

圖6 苦參對異齒裂腹魚魚卵水霉防治效果Figure 6 The prevention and treatment effects ofSophora flavescenson fertilized eggs'SaprolegniaofSchizothorax oconnori

3 討論

3.1 五倍子對異齒裂腹魚魚卵水霉防治效果

五倍子有效成分包含鞣質(zhì)、沒食子酸、槲皮素、黃芩苷、蘆薈大黃素、大黃素和1,8-二羥基蒽醌等[16]，抑制真菌生長[17].對多鱗鏟頜魚(Varicorhinusmacrolepis)水霉病的藥物篩選及其藥效研究發(fā)現(xiàn)五倍子無論是單獨(dú)用藥還是聯(lián)合用藥，都有較好的抗水霉菌效果[18].0.64 mg/mL的五倍子水提取物可有效抑制水霉孢子萌發(fā)[13]，對致病水霉菌的抑菌率可達(dá)37.92%[19].在本試驗(yàn)中，五倍子試驗(yàn)組魚卵孵化率較陰性對照組提高了17.22%～25.12%，水霉感染致死率較陰性對照組降低了26.11%～31.35%，并且五倍子對魚卵影響小，魚苗畸形率與陰性對照組差異不顯著，因此五倍子在未來的抗水霉藥物研發(fā)中有較大的應(yīng)用潛力，可用于水霉病的防控及治療.

3.2 大黃對異齒裂腹魚魚卵水霉防治效果

大黃有效成分提取物中含大黃素、大黃酸、大黃酚等物質(zhì)[20]，具有抗病原菌、抗炎、抑制真菌生長等藥理作用[21].研究發(fā)現(xiàn)大黃對山女鱒(Oncorhynchusmasou)水霉病病原具有較好的抑制及殺滅效果.馬江耀[19]研究發(fā)現(xiàn)大黃對致病水霉菌的抑菌率可達(dá)40.76%.在本試驗(yàn)中大黃實(shí)驗(yàn)組魚卵水霉致死率均顯著低于陰性對照組，0.1、0.4 g/L大黃組魚卵孵化率顯著高于陰性對照組.因此，大黃可作為異齒裂腹魚魚卵水霉防治參考藥物.

3.3 山蒼子對異齒裂腹魚魚卵水霉防治效果

山蒼子果實(shí)可提煉出山蒼子精油，其檸檬醛含量約為60%～80%，山蒼子精油具有很好的抗氧化和抗菌性能，已被國內(nèi)外較多學(xué)者證實(shí)[22].沈琦[23]在對羅非魚(Oreochromisspp)和鰻鱺(AnguillajaponicaTemminck et Schlegel)研究時發(fā)現(xiàn)山蒼子具有較好抑殺水霉能力.馬江耀[19]研究發(fā)現(xiàn)山蒼子對致病水霉菌的抑菌率可達(dá)46.75%.在本試驗(yàn)中，山蒼子試驗(yàn)組魚卵孵化率較陰性對照組提高了24.20%～34.58%，水霉感染致死率較陰性對照組降低了27.92%～31.42%.因此山倉子可作為防治魚卵水霉的特效中藥.

3.4 黃芩對異齒裂腹魚魚卵水霉防治效果

黃芩有效成分提取物中含黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素，具有抗病原菌、抗炎、抑制真菌生長等作用[20].藺凌云等[13]研究發(fā)現(xiàn)0.64 mg/mL的黃芩水提取物可有效抑制水霉孢子萌發(fā).甄珍[24]研究表明黃芩對山女鱒水霉病病原具有較好的抑制及殺滅效果.在本試驗(yàn)中，黃芩試驗(yàn)組魚卵孵化率較陰性對照組提高了19.24%～32.40%，水霉感染致死率較陰性對照組降低了29.55%～31.62%.因此黃芩可作為防治魚卵水霉的特效中藥.

3.5 苦參對異齒裂腹魚魚卵水霉防治效果

苦參有效成分提取物中含有苦楝素物質(zhì)具有抑制真菌生長的作用[21,25].劉榮軍[26]、沈琦等[23]研究均發(fā)現(xiàn)苦參對水霉病病原具有較好的抑制及殺滅效果.在本試驗(yàn)中，黃芩組魚卵孵化率較陰性對照組提高了19.24%～31.44%，水霉感染致死率較陰性對照組降低了27.09%～32.07%.但甄珍[27]研究發(fā)現(xiàn)苦參對山女鱒水霉菌絲幾乎無抑制作用.可能是因?yàn)榧逯蠓椒▽?dǎo)致藥液中有效成分失活，或者是水霉品種不同，而苦參對異齒裂腹魚魚卵水霉菌絲有抑制和殺滅作用，但對山女鱒水霉菌絲無效.

3.6 5種中草藥對異齒裂腹魚魚卵水霉防治效果比較

本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),1.5 g/L五倍子組，0.4、0.7 g/L大黃組，0.6、1.1、1.6 g/L山蒼子組，本試驗(yàn)所有濃度黃芩組，1.2、1.5、1.8 g/L苦參組魚卵水霉致死率較低，與陽性對照組差異不顯著(P>0.05).0.7 g/L五倍子組，0.1、0.4 g/L大黃組，本試驗(yàn)所有濃度山蒼子組，1.2、1.5、1.8 g/L黃芩組，本試驗(yàn)所有濃度苦參組魚卵孵化率均較高，與陽性對照組差異不顯著(P>0.05).本試驗(yàn)所有濃度五倍子組，0.1、0.4、0.7 g/L大黃組，0.6 g/L山蒼子組，0.6、0.9 g/L黃芩組，0.9、1.2 g/L苦參組魚苗畸形率均較低.平均孵化率苦參組>山蒼子組>黃芩組>五倍子組>大黃組；魚苗畸形率五倍子組<大黃組<山蒼子組<苦參組<黃芩組.中草藥成分較為復(fù)雜，其部分組成成分對魚卵具有危害，導(dǎo)致異齒裂腹魚魚卵孵化率及魚苗畸形率存在差異，其具體原因有待進(jìn)一步研究.因此，為了避免中草藥部分成分對異齒裂腹魚魚卵及魚苗造成損傷，下一步需要對中草藥成分進(jìn)行分離，探索可以防治其魚卵水霉的有效成分以及對其魚卵及魚苗造成損傷的成分，從而推動異齒裂腹魚魚卵水霉防治特效藥開發(fā).

4 結(jié)論

五倍子、大黃、山蒼子、黃芩、苦參對異齒裂腹魚魚卵水霉均具有很好的抑制和殺滅效果，最佳浸泡濃度為 0.7、1.1、1.5 g/L五倍了組，0.1、0.4 g/L大黃組，0.6 g/L山蒼子組，0.6、0.9、1.2、1.5 g/L黃岑組，0.9、1.2、1.5 g/L苦參組.在孔雀石綠被禁用的現(xiàn)實(shí)情況下，這幾種藥可作為防治異齒裂腹魚魚卵水霉提供參考依據(jù).