曾通旭，楊波，徐倩，蔡小玲，哈小琴

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省干細胞與基因藥物重點實驗室，甘肅 蘭州 730050)

前期糖尿病(pre-diabetes,Pre-DM)，又稱中度高血糖癥，主要包括空腹血糖受損(impaired fasting glucose，IFG)和葡萄糖耐量受損(impaired glucose tolerance，IGT)，是血糖水平高于正常值又低于糖尿病閾值的一種高風險狀態(tài).Ⅱ型糖尿病(T2DM)又稱成人發(fā)病型糖尿病，是一種非胰島素依賴型糖尿病，其主要原因是胰島素抵抗與分泌不足.據(jù)不完全統(tǒng)計，全球約有4.7億人處于Pre-DM，2.1億人患有T2DM.近20多年來，全球的糖尿病患者急劇增加，據(jù)國際糖尿病聯(lián)合會的調(diào)查研究顯示，預計到2030年全球T2DM患者將達到4.72億，其中在東南亞及太平洋地區(qū)上升較快.我國是T2DM的高發(fā)地區(qū)，發(fā)病率位居全球首位[1].胰島素抵抗過程中，首先激活的是先天性免疫反應，該反應能產(chǎn)生炎癥因子.當巨噬細胞、抗原提呈細胞、內(nèi)皮細胞受到體內(nèi)外各種有害因素干擾時，使NF-κB信號通路激活，加劇釋放相關(guān)的炎癥因子如TNF-α、IL-6、hs-CRP以及炎癥介質(zhì)，進而引起胰島素抵抗與胰島素分泌不足.Hotamisligi[2]研究發(fā)現(xiàn)，炎癥與胰島素抵抗存在相關(guān)性，并推測該因素是引起胰島素抵抗相關(guān)疾病的主要原因之一.鼠類因自身的特點,以及經(jīng)濟、易于基因修飾等優(yōu)點常被選為T2DM動物模型.T2DM模型主要分為3大類：自發(fā)性T2DM模型、誘導性T2DM模型和轉(zhuǎn)基因/基因敲除T2DM模型.通過飲食能制備存在胰島素抵抗的動物模型，但其周期長，血糖升高用時長且不明顯.若只用化學藥物來誘導，能夠制備出具有胰島素分泌障礙型的模型小鼠，但其胰島素抵抗癥狀與T2DM不符.鏈脲佐菌素(STZ)為一種特效的抗菌藥，主要作用于試驗小鼠的胰島β細胞，由于小劑量STZ可以破壞部分胰島β細胞，但不會完全破壞，是目前應用最廣的造模方法.本文采用高脂飲食制備Pre-DM模型.采用飲食和化學藥物誘導聯(lián)合最終造出周期短，且具有胰島素抵抗和胰島素分泌不足的T2DM動物模型.本文的創(chuàng)新點是通過Per-DM與T2DM的動物模型的制備，研究免疫與Per-DM與T2DM的相關(guān)性，嘗試從免疫方面阻止前期糖尿病發(fā)展為糖尿病，以期為臨床方向的干預提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗動物

本試驗采用5周齡C57BL/6J雄性小鼠，于2016年11月購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司(SCXK(京)2016～0011).實驗動物飼養(yǎng)于解放軍蘭州軍區(qū)總醫(yī)院動物實驗中心清潔級動物房，溫度(22±2)℃，濕度(50±10)%.分組之前適應性飼喂一周，分組時血糖與體質(zhì)量無差異性.造模期間，試驗動物自由進食飲水.試驗期間所有操作符合蘭州軍區(qū)總醫(yī)院倫理委員會的要求.

1.2 試驗設備及試劑

STZ(貨號S0130)購自美國Sigma公司.美國BIOTEK酶標儀.美國BD公司FACSCantoⅡ流式細胞儀、BD流式細胞分析用溶血素(349202)、BD小鼠T淋巴細胞亞類分析抗體合劑含同型對照抗體(7228925).瑞士梅特勒-托利多電子分析天平.高糖高脂飼料由北京博泰宏達生物技術(shù)有限公司提供(HD001).ACCU-CHEK血糖儀及配套血糖試紙均購于Roche公司.日立生化儀由蘭州軍區(qū)總醫(yī)院醫(yī)學檢驗中心提供.胰島素Elisa試劑盒購于上海酶聯(lián)生物科技有限公司.顯微鏡用Olympus.檸檬酸鹽緩沖溶液配制方法：檸檬酸2.1 g定容至100 mL(0.1 mol/L)配制A液;檸檬酸鈉2.94 g定溶至100 mL(0.1 mol/L)配制B液.A∶B=11.4∶8.6,配制檸檬酸鈉緩沖溶液，pH≈4.5.20%葡萄糖配制：準確稱取20 g葡萄糖，先少量水溶解，然后定容至100 mL.

1.3 Pre-DM與T2DM模型的制備

根據(jù)前期預試驗結(jié)果，將80只小鼠隨機分為4組，每組20只，入組之前體質(zhì)量、血糖無顯著差異(P>0.05).用高糖高脂(HC)飼料進行飼喂，選取0 d(A組)、40 d(B組)、80 d(C組)為Pre-DM組；高糖高脂飼喂聯(lián)合小劑量多次注射STZ為糖尿病組(D組)，D組每次以40 mg/kg的劑量進行腹腔注射STZ.造模前需12 h禁食不禁水，注射完畢需禁食2 h之后再進行高脂飼喂.多次注射之后，每周測定1次空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)，用眼科剪剪約0.5 cm尾進行尾靜脈采血，第1滴用無菌棉擦去，第2滴測定FBG，血與試紙接觸時間不少于5 s.若空腹血糖值>12.3 mmol/L，則判定T2DM模型制備成功.

1.4 腹腔注射糖耐量試驗(IPGTT)

STZ腹腔注射3周之后做IPGTT試驗.12 h禁食不禁水，采用20%的葡萄糖以2 g/kg的劑量進行腹腔注射.分別在0、0.25、0.5、1、1.5、2 h尾靜脈采血測血糖值.藥動學AUC是衡量藥物在人體內(nèi)被利用程度的一個重要藥動學參數(shù).以時間為橫坐標，以體內(nèi)的葡萄糖濃度為縱坐標，求得藥-時曲線圖中函數(shù)曲線下面積(AUC).用AUC來反映糖耐量與胰島素抵抗程度.AUC越大表示攝入的葡萄糖越多，表示其糖耐量在下降.其計算公式是：AUC=0.25×(0 min值)+0.5×(30 min值)+0.75×(60 min值)+0.5×(90 min值)+0.25×(120 min值)[3].

1.5 組織病理學形態(tài)檢查

胰島與肝臟采樣時一半取分子樣，備用.一半以4%組織固定液固定10 d，期間更換2次組織固定液.由本院病理科做石蠟包埋，病理切片厚度約10 μm，染色用蘇木素-伊紅.胰島及肝臟病理切片的檢測結(jié)果用光學顯微鏡來觀察，進一步分析在前期糖尿病及糖尿病發(fā)生過程中是否伴隨器官的損傷.

1.6 生理生化指標的測定

應用流式細胞術(shù)檢測T淋巴細胞亞群分型，Elisa法測定胰島素、IL-6、TNF-α的水平及生化指標的上機測定.根據(jù)分組，在不同的時間點取材，采血之前，尾靜脈測FBG，用摘眼球的方法處死采血，抗凝血采用免疫比濁法來測定超敏C反應蛋白.有研究表明，免疫功能可用T淋巴細胞亞群的比例進行評價[4].用流式儀檢測T淋巴細胞亞群CD3+、CD3+CD8+、 CD3+CD4+的分型，通過白細胞計數(shù)確定流式管中加入抗體20 μL、樣本50 μL，陰性對照與避光孵育15 min，加溶血素反應10 min使細胞完全裂解，之后加PBS 1 000 r/min，5 min，連續(xù)2次，上機檢測.根據(jù)說明書，設置流式細胞儀PE-CyTM偶聯(lián)CD3+，PE偶聯(lián)CD4+，F(xiàn)ITC偶聯(lián)CD8+，然后對淋巴細胞作FITC、PE和PE-CyTM的熒光強度檢測.促凝血離心，3 000 r/min,15 min.用來做生化指標的檢測及用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(Elisa)法檢測小鼠胰島素、IL-6、TNF-α的表達水平.尿素(UREA)、肌酐(CRE)、尿酸(UA)、甘油三脂(TG)、總膽固醇(CHO)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、游離脂肪酸(FFA)等生化指標檢測用全自動生化儀(蘭州軍區(qū)總醫(yī)院醫(yī)學檢驗中心)測定.

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 制備模型過程中小鼠空腹血糖的變化

各試驗組小鼠在造模的過程中空腹血糖一直穩(wěn)定上升.在Pre-DM 3組，B、C組空腹血糖較A組高，有上升趨勢，且組間差異顯著(P<0.05).D組注射3周后空腹血糖明顯高于其他3組，差異極顯著(P<0.01).整個造模過程80只小鼠，死亡19只，HC+STZ組6只血糖沒有達到閾值，造模成功率64.3%.注射STZ 3周后，模型制備成功.整個造模過程血糖變化見圖1.

圖1 造模過程各組的空腹血糖變化情況Figure 1 The fasting blood glucose(FBG) changes of each group in the modeling process

2.2 制備模型過程中小鼠體質(zhì)量的變化

由圖2可知，與A組相比，B、C組體質(zhì)量明顯上升且差異顯著(P<0.05).D組與C組相比體質(zhì)量差異不顯著.且Pre-DM組小鼠活動度降低，取樣過程發(fā)現(xiàn)脂肪較正常組多.T2DM組小鼠狀態(tài)較差，活動度顯著降低，皮毛蓬松，嚴重缺乏光澤.

圖2 造模過程各組體質(zhì)量的變化Figure 2 Changes in the body weight during the modeling process

2.3 小鼠糖耐量變化(IPGTT)及胰島素抵抗

各試驗組的IPGTT結(jié)果見圖3-A.D組在腹腔注射20%的葡萄糖之后，在各個時間點的血糖值與其余3組差異顯著(P<0.05).B組和C組與A組相比，15 min的血糖值差異顯著(P<0.05).根據(jù)藥代動力學公式計算，結(jié)果見圖3-B.

2.4 各模型組肝臟與胰島的病理切片結(jié)果

Pre-DM及T2DM患者一般都是胰島素抵抗伴隨著三大代謝紊亂，即蛋白質(zhì)代謝、脂肪代謝、糖代謝.主要的是機體糖代謝紊亂.肝臟是蛋白質(zhì)、脂肪和糖的代謝中心，當肝功能異常時，會引起三大代謝紊亂.本試驗中胰腺與肝臟的病理檢測結(jié)果見圖4～5.

與A組比較，*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01).Compared with group A,the * means significant difference(P<0.05),and the ** means extremely significant difference(P<0.01).圖3 小鼠IPGTT及AUC試驗結(jié)果Figure 3 The IPGTT test and AUC results

2.5 生化指標及胰島素、CRP、IL-6、TNF-α的Elisa結(jié)果

C組CRE與TG與A組無顯著差異(P>0.05)，D組的UREA、CRE及IL-6與C組之間亦無顯著差異(P>0.05).UREA各組間無顯著差異(P>0.05).其余組間均有顯著差異(P<0.05)，結(jié)果見表1～2.

2.6 CD3+、CD3+CD8+、 CD3+CD4+等T淋巴細胞亞群比例的變化

發(fā)現(xiàn)CD3+CD8+、CD3+CD4+其余組間均差異顯著(P<0.05)，CD3+A組與D組顯著差異(P<0.05)，組間差異不顯著.結(jié)果見表3及圖6.

A：與周圍腺泡界限清晰.少量腺泡細胞伸入胰島內(nèi)；B：胰島輕度萎縮，輕度纖維化.外分泌部的腺泡細胞之間有較多的脂肪細胞沉積，部分區(qū)域的腺泡萎縮；C：胰島重度萎縮，胰島內(nèi)可見脂肪沉積.外分泌部的腺泡細胞之間有少量脂肪細胞沉積；D：胰島大面積重度萎縮，可見大量透明脂肪和空泡化細胞.胰島內(nèi)毛細血管內(nèi)皮細胞增生.外分泌腺侵入胰島內(nèi)，血管周圍疏松水腫，部分區(qū)域腺泡萎縮.圖4 小鼠胰島HE染色結(jié)果Figure 4 HE staining of the pancreatic islets of each groups

A：肝細胞索較明顯，少部分肝細胞凋亡，部分區(qū)域肝細胞脂肪變性；B：肝細胞索基本消失，細胞界限不清晰.肝細胞脂肪變性、伴有少量炎性細胞浸潤；C：細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)脂肪滴，肝細胞彌漫型大泡性脂肪變性，細胞核偏于一側(cè)；D：可出現(xiàn)小灶狀、多灶狀炎性細胞浸潤和肝細胞壞死灶.肝細胞彌漫型小泡性脂肪變性，有小灶性炎性細胞浸潤.圖5 小鼠肝臟HE染色結(jié)果Figure 5 HE staining of the liver tissues of each groups

表1 各試驗組炎癥與免疫相關(guān)因子的比較

與A組比較，*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01).

Compared with group A,* means significant difference(P<0.05),and the ** means extremely significant difference(P<0.01).

表2 各試驗組生化指標的比較

與A組比較，*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01).

Compared with group A,* means significant difference(P<0.05),and the **means extremely significant difference(P<0.01).

表3 各試驗組T淋巴細胞亞群比例

與A組比較，*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01).

Compared with group A,* means significant difference(P<0.05),and the **means extremely significant difference(P<0.01).

圖6 CD3+、CD3+CD8+、 CD3+CD4+等T淋巴細胞亞群流式細胞圖Figure 6 Flow cytometry of CD3+,CD3+CD8+,CD3+CD4+T lymphocyte subsets

3 討論與結(jié)論

本研究探討了小鼠Pre-DM和T2DM模型的制備.T2DM的主要患病原因是胰島素抵抗與胰島β細胞功能障礙引起的胰島素分泌不足，主要的臨床癥狀是高血糖及各種并發(fā)癥，尤其是對一些終末器官會造成嚴重損傷，如引起眼、腎、心臟、血管、神經(jīng)等慢性病變.Pre-DM的血糖水平是處于糖尿病患者與正常之間，25%的Pre-DM患者在5 a之內(nèi)最終會發(fā)展為T2DM[5].IDF 2017年全球糖尿病地圖(第8版)發(fā)現(xiàn)我國T2DM發(fā)病率較高且呈逐年上升趨勢，有效地防止該疾病的發(fā)生是國內(nèi)外專家比較棘手的問題.本文通過研究Pre-DM與免疫的相關(guān)性，旨在為臨床中從免疫方向干預T2DM提供可靠依據(jù).

炎癥因子在T2DM、冠心病、類風濕疾病、高血壓等許多疾病發(fā)生的過程中有舉足輕重的作用.20世紀90年代，就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)促炎因子IL-6、TNF-α在多種組織中影響葡萄糖水平的穩(wěn)定性.近年來，炎癥在T2DM與Pre-DM的發(fā)生過程中備受關(guān)注，越來越多的炎癥及免疫的標志物，如Hs-CRP、TNF-α、IL-6等都與該病的發(fā)生具有相關(guān)性.Hs-CRP是機體受到微生物入侵或組織損傷等炎癥性刺激時肝細胞合成的一種全身性炎癥反應急性期的非特異性標志物，其主要與IL-6和TNF-α的調(diào)節(jié)相關(guān).由脂肪細胞分泌的細胞因子IL-6和TNF-α是刺激肝臟合成Hs-CRP的主要細胞因子.國際醫(yī)學界認定，Hs-CRP可以作為預測T2DM發(fā)病的危險指標.本文研究發(fā)現(xiàn)，Hs-CRP與胰島素抵抗綜合征有較強相關(guān)性.有文獻報道，隨著體內(nèi)脂肪含量的增加,CRP也有升高的趨勢.本文通過實驗發(fā)現(xiàn)，高脂飼喂的小鼠在Pre-DM發(fā)展為Ⅱ型糖尿病的3個時間點，Hs-CRP呈逐漸上升趨勢，且組間差異較顯著.這表明慢性炎癥也是引起引起胰島素抵抗的因素之一.

IL-6是由活化的T細胞與成纖維細胞產(chǎn)生的淋巴因子，其主要作用是調(diào)節(jié)細胞免疫活性與激活NK等細胞免疫細胞.IL-6是已知的多功能炎性細胞因子，它能誘導B淋巴與T細胞增殖、分化，產(chǎn)生抗體，參與機體的免疫反應，是炎癥發(fā)生的始發(fā)因子.有研究發(fā)現(xiàn)，IL-6可誘發(fā)胰島素抵抗，其主要作用是能減少GLUT-4的表達，從而降低脂肪細胞由胰島素介導的葡萄糖、脂肪的轉(zhuǎn)運，促進T2DM的發(fā)生.IL-6還可降低IRS-1的酪氨酸磷酸化及下游PI3K的活性，導致胰島素抵抗[7].Devaraj等[7]研究發(fā)現(xiàn)，較高濃度的血糖通過上調(diào)PKC、MAPK及NF-κB途徑導致IL-6的產(chǎn)生增多，且Pre-DM與T2DM患者單核細胞中內(nèi)脂素、TNF-α、IL-6 mRNA的表達水平顯著增高，提示IL-6的升高與Pre-DM及T2DM的IR有關(guān)[7].本研究中，4個試驗組的IL-6與Pre-DM、T2DM有關(guān)，更證實了 IL-6與胰島素抵抗具有相關(guān)性.

TNF具有調(diào)節(jié)人體免疫與代謝的功能，其不僅是一種有效的腫瘤殺傷因子，而且在調(diào)節(jié)免疫功能時發(fā)揮重要作用，包括TNF-α和TNF-β.TNF-α是一種由巨噬細胞及單核細胞產(chǎn)生的促炎性細胞因子，特點是靈敏度較高，是觸發(fā)炎癥反應的核心.主要功能是參與機體的生長調(diào)節(jié)、炎癥、免疫應答等，是多種信號通路的關(guān)鍵環(huán)節(jié).本文研究發(fā)現(xiàn)TNF-α在Pre-DM及T2DM狀態(tài)下產(chǎn)生增多.Tanaka等[8]研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α能降低過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(PPAR-γ)mRNA的表達，減少PPAR-γ產(chǎn)生.PPAR-γ是一類核轉(zhuǎn)錄因子，主要表達在脂肪細胞，可控制該細胞內(nèi)不同的代謝水平，其作用是抗炎與促進凋亡；同時，PPAR-γ激活對leptin的轉(zhuǎn)錄作用的抑制，使leptin水平降低，從而增加了體內(nèi)游離脂肪酸的生成，體內(nèi)胰島素水平上升.Peraldi等[9]認為，神經(jīng)鞘磷脂酶的激活與酰基鞘氨醇的產(chǎn)生是TNF-α影響胰島素受體活性的重要途徑.當P55TNFR與TNF-α結(jié)合之后，使神經(jīng)鞘磷脂水解為酰基鞘氨醇與膽堿，從而引起胰島素抵抗.TNF-α可能會引起胰島巨噬細胞活化釋放IL-1， 從而使NOS在胰島β細胞內(nèi)的表達增多，進一步弱化胰島素的功能.本試驗研究發(fā)現(xiàn)D組的TNF-α水平與其他三組差異較顯著，并與胰島素抵抗指數(shù)呈顯著正相關(guān).由此可見在Pre-DM及T2DM發(fā)生的過程中，炎癥因子TNF-α起到關(guān)鍵性的作用.

T淋巴細胞亞群是具有免疫調(diào)節(jié)的細胞群.CD3+代表全T細胞、CD4+與CD8+分別代表輔助性T細胞(Treg)與毒性T細胞且是機體免疫調(diào)節(jié)的關(guān)鍵，彼此之間通過協(xié)同與拮抗作用維持免疫平衡.Treg表面標志較多，特異性最高的是FOXP3+Treg，屬于轉(zhuǎn)錄因子家族中，當其基因突變時會引起嚴重的免疫疾病.近年來有研究發(fā)現(xiàn)T2DM患者FOXP3+Treg表達較低[10].CD8+受到外來抗原刺激后，發(fā)揮有效的細胞介導的免疫殺傷作用，直接破壞靶細胞，CD4+細胞受到外界抗原致敏后，產(chǎn)生淋巴因子，誘導T細胞、B細胞與巨噬細胞的增殖.研究發(fā)現(xiàn)在Pre-DM及T2DM時期，CD3+、CD4+、 CD8+等T淋巴細胞較正常組低且各組間差異顯著，提示長期處于高血糖狀態(tài)下，抑制了免疫細胞產(chǎn)生，且CD4+細胞膜上的IL-2R落入血液循環(huán)，抑制活化T細胞擴增，從而抑制免疫功能.本研究發(fā)現(xiàn)CD3+CD8+、CD3+CD4+組間均差異顯著，A組的CD3+與D組顯著差異，但組間差異不顯著.因此，T2DM發(fā)生的過程中T淋巴細胞亞群比例失衡，提示細胞免疫功能存在缺陷.

本試驗研究發(fā)現(xiàn)，慢性炎癥也是引起胰島素抵抗綜合征的一個重要因素.雖然越來越多的流行病學與臨床研究證實炎癥參與了胰島素抵抗，但是由于研究的局限性所致，目前關(guān)于炎癥與免疫因子在Pre-DM與T2DM中具體的調(diào)控機制有待進一步研究.本文研究的各項免疫指標的水平與Pre-DM和T2DM之間有較強的相關(guān)性，可為今后的相關(guān)研究提供更多的理論依據(jù).