衛(wèi)麗麗，付月君

（山西大學(xué)生物技術(shù)研究所，山西 太原 030006）

桿狀病毒是一種雙鏈環(huán)狀的DNA 病毒，基因組大小為80～180 kbp[1]。其可以作為生物殺蟲劑[2]，也可以作為真核表達(dá)系統(tǒng)[3]，還可以作為基因轉(zhuǎn)移載體[4]，因此，研究桿狀病毒侵染宿主細(xì)胞的機(jī)制對(duì)于其進(jìn)一步應(yīng)用具有重要意義。苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒（Autogrha californica multiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV）是一種模式桿狀病毒，其基因組全長(zhǎng)133 890 bp，包含154 個(gè)開放閱讀框[5-6]。Acpk2 基因位于AcMNPV 基因組的第123 個(gè)開放閱讀框，全長(zhǎng)664 bp，編碼一個(gè)包含215 個(gè)氨基酸的多肽，與真核細(xì)胞的蛋白激酶同源性較高。Ac-PK2包含11 個(gè)基序，其中有6 個(gè)較為保守[7]。Western blot 分析結(jié)果顯示，PK2 蛋白在病毒感染早期和晚期均存在；Ac-PK2 在病毒侵染進(jìn)程中發(fā)揮著重要的功能，可以在病毒侵染后營(yíng)救蛋白質(zhì)翻譯[8]。

桿狀病毒感染后，宿主細(xì)胞可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作為一種防御反應(yīng)。昆蟲缺乏B 細(xì)胞和T 細(xì)胞介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，因此細(xì)胞凋亡的抗病毒防御對(duì)昆蟲尤為重要[9]。在多種脊椎動(dòng)物、無(wú)脊椎動(dòng)物和原生生物中，P53 家族蛋白被發(fā)現(xiàn)可以參與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10]。最近的研究從草地貪夜蛾和家蠶中克隆了p53同源物Sfp53 和Bmp52，并發(fā)現(xiàn)SfP53 蛋白可以觸發(fā)Sf9 細(xì)胞的凋亡并激活下游caspase 的活性[11]。HUANG 等[12]研究也發(fā)現(xiàn)，在AcMNPV 感染的 Sf9細(xì)胞中SfP53 蛋白水平顯著升高，但Sfp53 基因的轉(zhuǎn)錄并未升高。桿狀病毒有許多凋亡抑制因子（P35，IAP1s），可以抑制宿主細(xì)胞的凋亡、促進(jìn)自身的復(fù)制[13]。有研究表明[14]，AfMNPV 侵染的 SL-1（Spodoptera litura）細(xì)胞中，伴隨宿主細(xì)胞凋亡，線粒體被破壞，細(xì)胞色素c 釋放到細(xì)胞質(zhì)中。AfMNPV 感染也可誘導(dǎo)線粒體跨膜電位（DJm）降低[15]。此外，紫外照射也可使Sf9 細(xì)胞中細(xì)胞色素c 從線粒體釋放到胞質(zhì)[16]。

本研究通過Bac-to-Bac 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建了重組桿狀病毒AcMNPV-PK2-RFP，使PK2 蛋白與紅色熒光蛋白R(shí)FP 融合過表達(dá)。通過線粒體膜電位檢測(cè)和Western blot 的方法檢測(cè)了AcMNPV和 AcMNPV-PK2-RFP 侵染 Sf9 細(xì)胞的進(jìn)程中SfP53 蛋白表達(dá)和線粒體膜電位的變化情況，以及細(xì)胞色素c 的分布情況，旨在為進(jìn)一步明確桿狀病毒的侵染加速宿主細(xì)胞凋亡的機(jī)制提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試的草地貪夜蛾卵母細(xì)胞Sf9 細(xì)胞、AcMNPV 病毒和大腸桿菌DH10B 菌株均由山西大學(xué)生物技術(shù)研究所細(xì)胞分子生物學(xué)課題組保存，pFB-DRFP 由山西大學(xué)生物技術(shù)研究所細(xì)胞分子生物學(xué)課題組構(gòu)建并保存。

1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶Sma I 和Xho I，以及T4 DNA 連接酶從寶生物（大連）技術(shù)有限公司購(gòu)買，抗體SfP53 由生工生物工程（上海）股份有限公司制備，內(nèi)參抗體anti-β-actin 和細(xì)胞色素c 的抗體anti-cytochrome c 均購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司，熒光二抗（IRDyeR800CW Goat anti-Rabbit）購(gòu)自美國(guó)Li-COR 公司，細(xì)胞裂解液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司，線粒體提取試劑盒和BCA 蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)自索萊寶生物技術(shù)有限公司，F(xiàn)u-GENE 6 轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Promega 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 重組桿粒Bacmid-PK2-RFP 的構(gòu)建 首先，從病毒基因組擴(kuò)增目的基因Ac-pk2，上下游引物分別為 Ac-pk2-F：ATACCCGGGATGAAACCCGAACA ATT；Ac-pk2-R：ATCCTCGAGCTAGTTTTTTAGAA CACGTTG，分別在上下游引物的5′端引入限制性內(nèi)切酶Sma I 和Xho I 的識(shí)別序列。將其插入到中間載體pFB-D-RFP 構(gòu)建重組中間載體pFB-D-PK2-RFP，并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證構(gòu)建成功。將構(gòu)建成功的pFBD-PK2-RFP 轉(zhuǎn)化到DH10B 感受態(tài)細(xì)胞，使其與AcMNPV 的基因組Bacmid 發(fā)生Tn7 轉(zhuǎn)座，獲得重組Bacmid-PK2-RFP，通過M13 引物進(jìn)行PCR 鑒定，以確定重組桿粒Bacmid-PK2-RFP 構(gòu)建成功。

1.3.2 重組病毒AcMNPV-PK2-RFP 的構(gòu)建 將重組桿粒Bacmid-PK2-RFP 和FuGENE 6 轉(zhuǎn)染試劑按照1∶3 的比例混勻，加入到200 μL 的培養(yǎng)液中，靜置15 min。吸去6 孔培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，加入預(yù)混轉(zhuǎn)染試劑和桿粒的培養(yǎng)基，27 ℃孵育2 h，之后補(bǔ)入2 mL 的培養(yǎng)基。27 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d 后，用熒光顯微鏡觀察子代病毒的產(chǎn)生，有紅色熒光產(chǎn)生，即證明獲得重組病毒AcMNPV-PK2-RFP，之后取培養(yǎng)液的上清加入新培養(yǎng)的Sf9 細(xì)胞，可獲得2 代、3 代病毒。

1.3.3 線粒體的提取 用線粒體提取試劑盒進(jìn)行分離提取，試劑盒包含4 種試劑。收集5×106個(gè)細(xì)胞，加入1 mL 試劑一和10 μL 試劑四，用研缽研磨。4 ℃600 g 離心5 min，棄沉淀，將上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中，4 ℃11 000 g 離心10 min。離心完后上清即為胞漿提取物，可用于研究線粒體蛋白向胞漿的釋放；沉淀為完整的線粒體，含有完整的外膜和內(nèi)膜，并具有線粒體的生理功能，可用于線粒體生理功能方面的研究。在沉淀中加入200 μL 試劑二和2 μL 的試劑四，超聲波破碎（冰浴，功率20%或200 W，超聲 3 s，間隔 10 s，重復(fù) 30 次），用 BCA 試劑盒檢測(cè)線粒體蛋白濃度，之后進(jìn)行Western blot分析。

1.3.4 線粒體膜電位檢測(cè) 細(xì)胞培養(yǎng)瓶中細(xì)胞長(zhǎng)滿后棄去舊培養(yǎng)基，再加入5 mL 無(wú)血清昆蟲培養(yǎng)基，后吹打細(xì)胞使懸浮混勻，將懸液加到6 孔板中，每孔3×106個(gè)細(xì)胞，27 ℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。用AcMNPV 或 AcMNPV-PK2-RFP 侵染 Sf9 細(xì)胞 12，24，36，48，60，72 h，各處理組加病毒 1.5×107pfu/mL，即感染復(fù)數(shù)為5 MOI。采用羅丹明123（碧云天生物技術(shù)公司）染料檢測(cè)線粒體跨膜電位（MMP）。病毒侵染后的細(xì)胞，用終濃度為50 nmol/L 的羅丹明123染色30 min。之后用PBS 緩沖液洗滌2 次，在熒光顯微鏡下用488 nm 濾鏡觀察熒光強(qiáng)度。

1.3.5 Western blot 分析 用 5 MOI 的病毒（AcMNPV，AcMNPV-PK2-RFP）侵染 Sf9 細(xì)胞 12，24，36，48，60，72 h 后，收集細(xì)胞至 EP 管中，加入蛋白裂解液制備蛋白樣品，并測(cè)定蛋白濃度。制備SDS-PAGE膠，對(duì)蛋白樣品進(jìn)行電泳，之后切膠，將目的蛋白條帶電轉(zhuǎn)到PVDF 膜，封閉1 h 后，4 ℃過夜孵育一抗（Anti-P53 Antibady，Anti-Cytochrome C Antibady），第2 天用PBST 洗膜3 次；室溫避光孵育熒光二抗1 h，之后用PBST 清洗3 次，用奧德賽掃膜儀檢測(cè)目的條帶。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3 次，進(jìn)行t 檢驗(yàn)，分析數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 或P＜0.001 表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 獲得重組病毒AcMNPV-PK2-RFP

首先構(gòu)建了重組中間載體pFB-D-PK2-RFP。以重組質(zhì)粒pFB-D-PK2-RFP 為模板，用Ac-pk2-F 和 rfp-R 引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，得到約 1 323 bp 的條帶，大小與所擴(kuò)增的基因片段相一致（圖1-A）。將重組質(zhì)粒pFB-D-PK2-RFP 用Xho I 和Sam I 酶切，重新得到645 bp 的片段（圖1-B），表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，并進(jìn)行了測(cè)序驗(yàn)證。

將構(gòu)建成功的pFB-D-PK2-RFP 轉(zhuǎn)化到DH10B感受態(tài)細(xì)胞，用M13 引物進(jìn)行PCR 篩菌，菌落PCR可以從基因組擴(kuò)增得到大小4 000～5 000 bp 的條帶，證明重組中間質(zhì)粒上的目的片段成功地轉(zhuǎn)座到桿粒Bacmid，形成重組桿粒Bacmid-PK2-RFP，并通過PCR 的方法對(duì)其進(jìn)行鑒定，結(jié)果如圖1-C 所示。將得到的重組桿粒Bacmid-PK2-RFP 轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，獲得可以表達(dá)紅色熒光蛋白的重組病毒AcMNPV-PK2-RFP，其 1 代、2 代、3 代病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的紅色熒光蛋白的熒光檢測(cè)如圖1-D所示。

2.2 AcMNPV-PK2-RFP侵染宿主細(xì)胞對(duì)凋亡因子SfP53蛋白表達(dá)的影響

通過Western blot 方法分析了AcMNPV-PK2-RFP 侵染宿主細(xì)胞對(duì)凋亡因子SfP53 蛋白表達(dá)的影響。由圖2-A 可知，野生型病毒處理組SfP53蛋白在12 h 就有表達(dá)，之后逐漸增加，60 h 后開始減弱。相較于野生型病毒處理組而言，AcMNPV-PK2-RFP 處理組Sfp53 蛋白的表達(dá)從12 h 開始逐漸增加?；叶葤呙杞Y(jié)果顯示（圖2-B），48，60，72 h 過表達(dá)PK2 的處理組中SfP53 蛋白的表達(dá)量分別大約是野生處理組的1.16 倍、1.39 倍、1.79 倍。有文獻(xiàn)報(bào)道，Sfp53 蛋白的表達(dá)影響細(xì)胞色素c 的釋放[17]，推測(cè)AcMNPV-PK2-RFP 通過影響Sfp53 蛋白的表達(dá)可能促進(jìn)了細(xì)胞色素c 的提前釋放，加速了細(xì)胞的凋亡。接下來(lái)進(jìn)一步檢測(cè)了線粒體膜電位和細(xì)胞色素c 的變化情況。

2.3 AcMNPV-PK2-RFP侵染對(duì)宿主細(xì)胞線粒體膜電位的影響

已知線粒體膜電位的變化是細(xì)胞凋亡進(jìn)程中一個(gè)重要的事件，反映了線粒體滲透性的變化，試驗(yàn)用羅丹明處理細(xì)胞后檢測(cè)了線粒體膜電位的變化，熒光顯微鏡的觀察結(jié)果如圖3-A 所示，反映的是 AcMNPV 和 AcMNPV-PK2-RFP 侵染 Sf9 細(xì)胞的進(jìn)程中線粒體膜電位的變化情況，結(jié)果表明，不論是野生型病毒處理組還是過表達(dá)PK2 的AcMNPV-PK2-RFP 處理組，在病毒侵染后綠色熒光都是逐漸增加，說明病毒侵染導(dǎo)致線粒體膜電位去極化，從而使膜受損、線粒體膜電位逐漸降低。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，相較于野生型處理組而言，重組病毒AcMNPV-PK2-RFP 處理組在 24，48，72 h 綠色熒光的強(qiáng)度均顯著高于野生處理組（如圖3-B），說明重組病毒AcMNPV-PK2-RFP 侵染細(xì)胞后可以加速線粒體膜電位的去極化、降低膜電位，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

2.4 AcMNPV-PK2-RFP侵染對(duì)宿主細(xì)胞細(xì)胞色素c釋放的影響

細(xì)胞色素c 從線粒體中的釋放對(duì)細(xì)胞凋亡非常重要，而線粒體膜通透性決定細(xì)胞色素c 的釋放。通過Western blot 試驗(yàn)研究了細(xì)胞色素c 在線粒體和細(xì)胞質(zhì)的分布情況，結(jié)果表明，野生型病毒處理組中線粒體中的細(xì)胞色素c 減少得不是很明顯，細(xì)胞質(zhì)中的細(xì)胞色素c 在病毒侵染后48 h 時(shí)仍然是微弱的條帶，細(xì)胞色素c 的釋放較慢（圖4）。相較于野生型病毒處理組，AcMNPV-PK2-RFP 處理組中宿主細(xì)胞線粒體中的細(xì)胞色素c 減少明顯，細(xì)胞質(zhì)中的細(xì)胞色素c 從病毒侵染后12 h 開始逐漸增加。推測(cè)重組病毒AcMNPV-PK2-RFP 處理組線粒體膜電位的降低進(jìn)一步影響了細(xì)胞色素c 的釋放，從而影響了細(xì)胞凋亡。

3 結(jié)論與討論

線粒體作為細(xì)胞的能量供應(yīng)站，對(duì)真核細(xì)胞的生存至關(guān)重要。在細(xì)胞凋亡過程中，線粒體不僅是蛋白質(zhì)相互作用的場(chǎng)所，也是caspase 活化的場(chǎng)所。當(dāng)線粒體膜通透性增加時(shí)，細(xì)胞色素c 釋放到細(xì)胞質(zhì)中[18]。LIU 等[19]研究表明，AfMNPV 的侵染可以通過影響線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)SL-1 細(xì)胞凋亡。關(guān)于家蠶細(xì)胞凋亡依賴細(xì)胞色素c 通路的研究表明，BmP53 的表達(dá)增加可能有助于細(xì)胞色素c 的釋放，但具體機(jī)制尚不清楚[20]。

本研究結(jié)果顯示，AcMNPV-PK2-RFP 侵染Sf9細(xì)胞 48，60，72 h 后，細(xì)胞 SfP53 蛋白的表達(dá)量均高于野生病毒處理組。推測(cè)SfP53 蛋白表達(dá)上調(diào)是AcMNPV-PK2-RFP 感染后期細(xì)胞色素c 釋放加速的一個(gè)因素。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，AcMNPV 和AcMNPV-PK2-RFP 侵染Sf9 細(xì)胞后，可以通過影響線粒體凋亡途徑來(lái)加速宿主的凋亡。相對(duì)于AcMNPV 處理組，AcMNPV-PK2-RFP 處理組在感染后期提高了凋亡相關(guān)蛋白SfP53 的表達(dá)，降低了線粒體膜電位，加速細(xì)胞色素c 的釋放。之前的研究結(jié)果表明，過表達(dá)PK2 的重組病毒可以增加子代病毒的復(fù)制[21]，新產(chǎn)生的子代病毒會(huì)對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行2 次侵染，從而進(jìn)一步刺激宿主細(xì)胞的凋亡通路。這些結(jié)果表明，線粒體凋亡途徑在AcMNPV 和AcMNPV-PK2-RFP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要的功能，為揭示桿狀病毒侵染宿主細(xì)胞后加速宿主細(xì)胞凋亡的機(jī)制提供了試驗(yàn)依據(jù)。