張培風(fēng)，王長彪，趙興華，劉 江，韓 斌，路貴和

（1.山西大學(xué)生物工程學(xué)院，山西 太原 030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，山西 太原 030031）

玉米作為世界上重要的農(nóng)作物之一，具有高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的特點(diǎn)[1]。隨著工業(yè)和農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，我國對玉米的需求量大幅增加[2]。玉米作為雜種優(yōu)勢效果最顯著的作物，其主要的核心環(huán)節(jié)是如何快速獲得優(yōu)良的自交系[3]。目前，在育種領(lǐng)域快速選育自交系主要采用單倍體育種技術(shù)，只需1～2 個世代即可獲得性狀優(yōu)良的純系，而常規(guī)育種則需6～7 代，利用單倍體育種技術(shù)的優(yōu)勢，能夠極大地提高育種效率[4]。玉米單倍體的倍增主要是通過自然加倍和化學(xué)加倍，但自然加倍率較低。據(jù)報道，最高的自然加倍率也僅有5%[5]，達(dá)不到加倍的理想狀態(tài)，因此，大多數(shù)研究者主要采用化學(xué)加倍方法，利用秋水仙素加倍試劑可以大大提高加倍效率。研究表明，不同的秋水仙素處理濃度、處理時間和處理部位，加倍效率大不相同[6-7]。但在加倍過程中往往會出現(xiàn)秋水仙素毒性污染、實(shí)驗(yàn)操作流程復(fù)雜、成本較高、受客觀條件限制等問題，因此，急需探索一種低毒高效、操作簡便、加倍效率高的加倍方法。

目前，育種界玉米單倍體加倍方法主要采用浸種法、浸根法、切芽法、注射法及組培法等。GAYEN等[8]采用浸種法，對單倍體種子用不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的秋水仙素進(jìn)行不同時間的浸泡處理，結(jié)果表明，單倍體種子在0.06%的秋水仙素中浸泡12 h 加倍效果最佳，加倍成功的種子占18%。文科等[9]采用浸根法，當(dāng)玉米種子發(fā)芽到5～7 cm 時，將其幼根浸泡至秋水仙素溶液中，結(jié)果表明，0.02%的秋水仙素為最佳。劉海等[10]通過對處于芽苗期內(nèi)玉米單倍體噴施秋水仙素，不同濃度處理下散粉率最高的可達(dá)42.5%。CHASE[11]于1952年采用0.05%的秋水仙素溶液對玉米單倍體盾片節(jié)進(jìn)行注射，研究表明，經(jīng)處理的單倍體結(jié)實(shí)率是對照組的4 倍多。陳寶健等[12]通過幼胚組培的方法研究表明，不同濃度甲酰胺草磷處理的單倍體雄穗散粉效果存在明顯差異，其中，1 μmol/L 處理 72 h 的成株散粉率可達(dá)37.0%。

本試驗(yàn)結(jié)合前人浸種法的研究，通過對玉米單倍體胚部劃胚的方法，用不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的秋水仙素和不同處理時間進(jìn)行加倍處理，對玉米單倍體的加倍效率進(jìn)行研究，以期開辟一條高效率、操作簡便的單倍體加倍的新技術(shù)途徑，從而為單倍體育種提供技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為以玉米自交系TX3-2 和DK516 組配的雜交種為母本、誘導(dǎo)系TY1 為父本進(jìn)行誘導(dǎo)后挑選出的單倍體種子。加倍試劑為二甲基亞砜和秋水仙素，均來自于Solarbio 試劑公司，其中，秋水仙素純度為98%。所有材料均種植于山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院位于海南省的南繁試驗(yàn)基地和山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院東陽試驗(yàn)基地。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子的劃胚處理 將篩選出的單倍體種子用流水沖洗干凈，放置于滅菌培養(yǎng)皿中，用清水浸泡，置于28 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)，24 h 后將處于萌動狀態(tài)的玉米籽粒取出，用濾紙濾干水分，使用消毒后的刀片在種子胚芽部表層輕劃2～3 mm。全程操作需戴一次性消毒手套及口罩。

1.2.2 秋水仙素處理 將劃胚后的單倍體種子和對照組（經(jīng)24 h 清水浸泡后未劃胚的單倍體種子）分別放置在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0，0.04%，0.06%，0.08%，0.12%的秋水仙素溶液中，分別處理3，6 h。

1.2.3 處理后的清洗 將秋水仙素處理后的單倍體進(jìn)行流水清洗1～2 h，瀝干后移至試驗(yàn)田。

1.2.4 田間觀察及記錄 將處理過的單倍體種子單粒播種于田間，觀察并記錄各處理的出苗率、成活率、散粉率和結(jié)實(shí)率。以單倍體加倍后的散粉情況來判斷玉米單倍體是否加倍。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 劃胚處理對玉米單倍體加倍效率的影響

從表1可以看出，劃胚處理下玉米單倍體加倍后植株的出苗率和成活率受到影響，其平均值均低于不劃胚處理的植株；但植株的散粉率和結(jié)實(shí)率均顯著增加，其散粉率和結(jié)實(shí)率平均分別為19.17%，9.17%，明顯高于不劃胚加倍處理（5.63%，2.09%）。

表1 劃胚處理對玉米單倍體加倍效率的影響

從表2，3，4，5可以看出，劃胚處理對玉米單倍體加倍后植株的出苗率、散粉率、結(jié)實(shí)率的影響與不劃胚處理間差異均達(dá)顯著水平（P＜0.05），對成活率的影響差異達(dá)極顯著水平（P＜0.01）。可見，玉米單倍體胚部劃胚處理能夠顯著地提高玉米單倍體的散粉率和結(jié)實(shí)率。

表2 劃胚處理對玉米單倍體加倍后出苗率的方差分析

表3 劃胚處理對玉米單倍體加倍后成活率的方差分析

表4 劃胚處理對玉米單倍體加倍后散粉率的方差分析

表5 劃胚處理對玉米單倍體加倍后結(jié)實(shí)率的方差分析

2.2 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的秋水仙素對劃胚后玉米單倍體加倍效果的影響

從表6可以看出，在劃胚和不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)秋水仙素加倍條件下，玉米單倍體加倍后植株的出苗率、成活率、散粉率和結(jié)實(shí)率均有不同程度的提高（0.08%秋水仙素處理除外），其中，0.04%秋水仙素處理的植株出苗率、成活率、散粉率和結(jié)實(shí)率均最高，分別為44.17%，36.67%，17.09%和9.59%；隨著秋水仙素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的不斷增加，玉米植株的出苗率、成活率、散粉率和結(jié)實(shí)率都有下降趨勢。由此說明，秋水仙素質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，對植株的生長影響越大，在秋水仙素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.04%的加倍處理條件下，對玉米單倍體加倍后的植株傷害最小，加倍效果較明顯。

2.3 秋水仙素不同處理時間對劃胚后玉米單倍體加倍效果的影響

玉米單倍體加倍后植株的散粉率可以用來判斷單倍體加倍效果，其散粉率越高，代表加倍效果越好。由圖1可知，玉米單倍體加倍后的植株散粉率隨著秋水仙素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增高而降低，當(dāng)加倍處理在同一秋水仙素質(zhì)量分?jǐn)?shù)下，加倍3 h 植株的散粉率高于加倍6 h 的植株散粉率，其中，秋水仙素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.04%、加倍時間為3 h 時植株散粉率最高，可達(dá)17.09%。由此可得，選擇合適質(zhì)量分?jǐn)?shù)的秋水仙素和處理時間能夠通過劃胚后植株的散粉率表現(xiàn)出最佳的加倍效果，其中，當(dāng)秋水仙素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.04%、加倍時間為3 h 時植株的散粉率最高，加倍效果最好。

3 結(jié)論與討論

秋水仙素可以有效提高單倍體的加倍效率，早在1955年，SEANEY[13]采用浸泡法用秋水仙素對玉米單倍體的幼苗根部進(jìn)行處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只有2株植株散粉，加倍效果較差。GAYEN 等[14]研究表明，用0.05%秋水仙素對玉米單倍體根部浸泡24 h，單倍體材料加倍效果最好。劉志增等[15]采用注射法分別對處于6 葉期和拔節(jié)期的玉米單倍體進(jìn)行注射，結(jié)果表明，秋水仙素為0.05%和0.01%的玉米單倍體散粉率較高，加倍效果較好。劉俊等[16]用0.06%的秋水仙素溶液和2%的DMSO 分別采用浸根法、滴注心葉和針刺生長點(diǎn)法對單倍體進(jìn)行處理，結(jié)果表明，加倍效果最好的是針刺生長點(diǎn)法，平均加倍率可以達(dá)到23%?；輫鴱?qiáng)等[17]采用不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的除草劑對6 葉期幼苗滴心法處理，結(jié)果表明，利用80 μmol/L的甲基胺草磷處理加倍效果最佳，平均加倍率可達(dá)23.32%。范志青[18]用0.06%的秋水仙素溶液對玉米幼胚處理24 h，加倍效率最高。謝琦[19]采用組培技術(shù)對玉米單倍體幼胚進(jìn)行加倍，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在光照為2 000 lx，溫度在26 ℃時幼胚快速顯色；當(dāng)秋水仙素為0.04%、處理24 h 時加倍效果最好。李浩川等[20]采用不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的秋水仙素對玉米單倍體成熟胚進(jìn)行加倍處理，結(jié)果表明，用0.005%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的秋水仙素處理24 h 加倍效果最佳，綜合效率可達(dá)57.61%。杜文平等[21]對玉米單倍體幼芽切根進(jìn)行處理，其中取根長5～10 mm，秋水仙素為0.06%和0.2%的二甲基亞楓處理加倍效果最佳，散粉率和結(jié)實(shí)率分別達(dá)51.39%和8.74%。本試驗(yàn)通過對玉米成熟籽粒劃胚進(jìn)行加倍處理，與前人通過浸泡、滴心、針刺及幼苗成熟胚組培方法相比較，可以簡便流程，不受人員和時間限制，并得到了理想的加倍效果。在利用秋水仙素加倍過程中，要做好防毒工作，秋水仙素是白色或黃色粉末，無味，屬劇毒物質(zhì)，3～13 mg 就會導(dǎo)致人體窒息死亡[22]，因此，在實(shí)驗(yàn)完畢后應(yīng)做好秋水仙素廢液處理，從而降低秋水仙素對人體和環(huán)境的污染。

本研究中，通過對玉米單倍體成熟籽粒胚部劃胚，并結(jié)合不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的秋水仙素及不同處理時間對玉米單倍體進(jìn)行加倍，結(jié)果表明，玉米單倍體胚部劃胚處理顯著高于自然加倍；當(dāng)秋水仙素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.04%、處理3 h 時，秋水仙素對植株的傷害最小，散粉率最高，達(dá)17.09%，加倍效果最好。這可能是因?yàn)樽蚜Ｅ卟可L點(diǎn)處于分生組織區(qū)，細(xì)胞分裂快，當(dāng)受到輕微損傷后在秋水仙素處理下，刺激更加明顯，導(dǎo)致加倍效率增加。本研究為單倍體加倍開辟了一條新的技術(shù)途徑，通過不斷地完善能夠?yàn)橛衩纂p單倍體工程化和規(guī)?；峁┘夹g(shù)基礎(chǔ)。