夏興 邵東 孫新強(qiáng),*

(1 上海來(lái)益生物藥物研究開發(fā)中心有限責(zé)任公司，上海 200240；2 浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠，新昌 312500)

達(dá)托霉素是一種由13個(gè)氨基酸組成的新型脂肽類抗生素，是一種鈣離子依賴型的抗生素。在鈣離子存在的條件下，它將以非共價(jià)鍵的形式與細(xì)胞膜上達(dá)托霉素結(jié)合蛋白(DBPs)結(jié)合。達(dá)托霉素由微生物玫瑰孢鏈霉菌發(fā)酵生成的，具有在體外抗絕大多數(shù)的臨床革蘭陽(yáng)性菌的作用，包括厭氧菌、腸球菌等耐藥菌，且主要用于耐藥菌，如耐萬(wàn)古霉素的腸球菌(VRE)，耐甲氧西林金葡菌(MRSA)等，在醫(yī)學(xué)方面具有廣闊的應(yīng)用前景[1-2]。

達(dá)托霉素的化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，結(jié)構(gòu)如圖1所示，其生產(chǎn)、純化、運(yùn)輸、保藏環(huán)節(jié)的條件變化均會(huì)導(dǎo)致雜質(zhì)的產(chǎn)生，影響產(chǎn)品質(zhì)量和治療效果。為評(píng)價(jià)藥物的安全性、雜質(zhì)的生物學(xué)影響，必須對(duì)相關(guān)雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行確證。同時(shí)，在進(jìn)行達(dá)托霉素申報(bào)注冊(cè)時(shí)也需要說(shuō)明相關(guān)雜質(zhì)的來(lái)源，因此對(duì)相關(guān)雜質(zhì)的研究十分重要。本文在研究達(dá)托霉素相關(guān)雜質(zhì)過(guò)程中[3]，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)未知雜質(zhì)。通過(guò)高效液相分離純化了該雜質(zhì)，并進(jìn)行UPLC-MS和NMR測(cè)定，推定了其結(jié)構(gòu)。根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)，檢測(cè)了生產(chǎn)原料，推測(cè)了其可能的來(lái)源。

1 儀器和試劑

Aglient 1100液相系統(tǒng)(美國(guó)Aglient)；質(zhì)譜儀：ACQUITYTMUPLC & Q-TOF MS Premier(美國(guó)Waters)；核磁共振儀：Bruker Avance III 400MHz(德國(guó)Bruker)；GC-MS：安捷倫7890A-5975C(美國(guó)Aglient)。

達(dá)托霉素(浙江醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)：306DT150301)；癸酸：杭州油脂化工(批號(hào)：20170321009)；乙腈購(gòu)于百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司，色譜純；硅烷化試劑購(gòu)于上海安普科技；其他試劑均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 HPLC分析方法

按照文獻(xiàn)方法進(jìn)行HPLC分析[4]。色譜柱：菲羅門C8，IB-SIL(4.6mm×250mm, 5μm) C8柱；柱溫：25℃(22～28℃)；檢測(cè)波長(zhǎng)：214nm；流速：1.5mL/min；進(jìn)樣量：20μL。

流動(dòng)相：A相0.45% NH4H2PO4中的20%乙腈，pH 3.25；B相0.45% NH4H2PO4中的50%乙腈，pH 3.25。目標(biāo)流動(dòng)相為35%乙腈于0.45% NH4H2PO4中，使得達(dá)托霉素的保留時(shí)間維持在(36.0±1.5)min，如有偏差，可通過(guò)調(diào)節(jié)A、B相，使保留時(shí)間在合理范圍內(nèi)。

溶液配制：精密量適量達(dá)托霉素樣品，加A相和B相(1:1,V/V)流動(dòng)相，制成含達(dá)托霉素1mg/mL?；靹?，進(jìn)行HPLC分析。

2.2 相關(guān)雜質(zhì)的制備方法

利用HPLC對(duì)進(jìn)行雜質(zhì)制備，制備條件沿用HPLC分析條件。對(duì)達(dá)托霉素樣品中各個(gè)雜質(zhì)目標(biāo)峰進(jìn)行收集。收集的各個(gè)雜質(zhì)溶液-18℃冷凍保存。等累計(jì)到一定量后，合并相同組分。減壓薄膜濃縮去除有機(jī)溶劑，冷凍干燥，獲得含有雜質(zhì)和鹽的混合物。使用無(wú)水甲醇溶解含上述各個(gè)雜質(zhì)的混合物，過(guò)濾去除不溶于甲醇的鹽，獲得的溶液進(jìn)行減壓濃縮，獲得比較純的雜質(zhì)樣品。

2.3 UPLC-MS分析方法

方法：ESI源，正離子。毛細(xì)管電壓為3.0kV，錐孔電壓35V，源內(nèi)溫度100℃，干燥氣流溫度250℃，干燥器流速400L/h; 碰撞能MS 6eV、MS-MS 35eV，質(zhì)量掃描范圍m/z80～2000，掃描時(shí)間1s，掃描間隔時(shí)間0.02s，樣品濃度1mg/mL。

2.4 NMR檢測(cè)方法

樣品溶于0.5mL DMSO-d6中，進(jìn)行核磁共振掃描。采用Bruke Avance III 400MHz配5mm BBOF探頭，觀察頻率100MHz，掃描范圍-20～220ppm，30度脈沖角，采樣時(shí)間0.68s，延遲時(shí)間2s，掃描次數(shù)5120次，測(cè)定溫度300K。

2.5 癸酸的GC-MS分析方法

癸酸樣品，熔融后取100μL于氣相頂空瓶中，加入900μL硅烷化試劑，封閉后70℃靜置1h。進(jìn)行GC-MS分析。

圖1 達(dá)托霉素結(jié)構(gòu)圖Fig.1 The structure of daptomycin

G C-M S方法：色譜柱：D B-5(30m×0.25mm×0.25μm)；進(jìn)樣量：0.2μL；進(jìn)樣溫度：270℃；分流比：100:1；載氣：氦氣(99.999%)；流量：1mL/min；柱溫：40℃保持3min，以10℃/min升至300℃，保持8min；接口溫度：270℃；離子源溫度：230℃；四級(jí)桿溫度：150℃；電離方式：EI+，70ev；檢測(cè)器電壓：2200V；掃描方式：全掃描；質(zhì)量范圍：20～500；NIST 2014譜庫(kù)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 HPLC分析結(jié)果

所述的方法，對(duì)達(dá)托霉素進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)達(dá)托霉素樣品中雜質(zhì)較多，主要含有10個(gè)雜質(zhì)。HPLC圖譜參見圖2。針對(duì)這些雜質(zhì)，進(jìn)行了分離純化。其中，保留時(shí)間30.1min(相對(duì)保留時(shí)間RRT為0.82)處的雜質(zhì)為新雜質(zhì)。

3.2 MS鑒定結(jié)果

采用全掃描一級(jí)質(zhì)譜，并進(jìn)一步對(duì)新雜質(zhì)進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離實(shí)驗(yàn)，得到一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜圖，一級(jí)MS和二級(jí)MS見圖3～4。

圖2 達(dá)托霉素HPLC圖Fig.2 HPLC profile of daptomycin

圖3 新雜質(zhì)MS圖Fig.3 MS spectra of new impurity

按照文獻(xiàn)[5]的方法，本研究進(jìn)行新雜質(zhì)MS-MS的解析。新雜質(zhì)MS-MS片段模式如圖5所示。正離子模式下，新雜質(zhì)的[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰為m/z1618.6995，元素組成為C72H100N17O26；m/z809.8456為[M+2H]2+峰；m/z1280.51為雜質(zhì)脫去脂肪?；鶄?cè)鏈和色氨酰的片段。其他主要的MS-MS數(shù)據(jù)參見表1。MS-MS顯示，y1～y12的離子碎片與達(dá)托霉素的一致；b離子與達(dá)托霉素相比，碎片峰都比達(dá)托霉素的b離子小2。推測(cè)該化合物為在癸?；鶄?cè)鏈上形成雙鍵。

3.3 NMR鑒定結(jié)果(表2，圖6～7）

為進(jìn)一步確證側(cè)鏈結(jié)構(gòu)，進(jìn)行了核磁共振分析。13C NMR圖譜參見圖6；1H NMR圖譜參見圖7。核磁共振圖譜的歸屬見表2。

圖4 新雜質(zhì)MS-MS圖Fig.4 MS-MS spectra of new impurity

圖5 新雜質(zhì)結(jié)構(gòu)和MS-MS片段模式Fig.5 Chemical structures of new impurity and its MS-MS fragmentation patterns

表1 新雜質(zhì)的MS-MS序列數(shù)據(jù)分析Tab.1 Ions observed in MS-MS sequence analysis of new impurity

表2 13C NMR和1H NMR在DMSO-d6中數(shù)據(jù)Tab.2 1H NMR and 13C NMR Data for new impurity in DMSO-d6

圖6 新雜質(zhì)13C NMR圖Fig.6 13C NMR spectra of new impurity

按照文獻(xiàn)[5]的方法，我本研究進(jìn)行新雜質(zhì)核磁共振譜圖的解析。相比達(dá)托霉素而言，在13C NMR上，于123.59和132.98ppm處有2個(gè)信號(hào)，屬于烯鍵，同時(shí)在28ppm處，少了2個(gè)信號(hào)峰。結(jié)合1H NMR、推測(cè)在側(cè)鏈的3,4位形成了雙鍵。因此推測(cè)該雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)，為N-(3-癸烯?；?-L-色氨酰基-D-天冬酰胺?；?L-天冬氨酰基-L-蘇氨?；?甘氨?；?L-鳥氨?；?L-天冬氨?；?D-丙氨?；?L-天冬氨?；?甘氨?；?D-絲氨?；?蘇-3甲基-L-谷氨?；?L-3-鄰氨基苯甲?；?L-丙胺酸-ε1-內(nèi)脂，其與達(dá)托霉素的主要區(qū)別在于側(cè)鏈的3,4含有雙鍵。

3.4 癸酸GC-MS分析結(jié)果(圖8～9，表3)

采用ACD lab軟件處理GC-MS數(shù)據(jù)。GC-MS的離子流參見圖8。

圖7 新雜質(zhì)1H NMR圖Fig.7 1H NMR spectra of new impurity

圖8 硅烷化癸酸離子流圖Fig.8 Ion flow spectra of silanized decanoic acid

在硅烷化癸酸的離子流圖中，主要有3個(gè)離子峰。其中組分為硅烷化癸酸。在12.56min，有一個(gè)微量物質(zhì)，其MS圖參見圖9。分子量顯示，其比硅烷化癸酸少2Da，為硅烷化癸烯酸(表3)。

GC-MS結(jié)果顯示，癸酸樣品中主要成分為癸酸，主要雜質(zhì)為辛酸、壬酸。并且在樣品中發(fā)現(xiàn)癸烯酸。

GC-MS分析結(jié)果表明，雜質(zhì)為發(fā)酵過(guò)程中補(bǔ)加癸酸時(shí)癸酸中含有少量的癸烯酸所致。因此，想要控制雜質(zhì)，需在發(fā)酵過(guò)程中控制癸酸質(zhì)量。

4 討論

圖9 硅烷化癸烯酸MS圖Fig.9 MS spectra of silanized decenoic acid

表3 硅烷化癸酸樣品主要成分Tab.3 Major component of silanized decanoic acid

肽類化合物結(jié)構(gòu)復(fù)雜，由于之間為肽鍵相連，通過(guò)核磁分析很難確定連接關(guān)系。而質(zhì)譜分析所形成的一系列碎片卻對(duì)肽鍵連接順序分析十分有效。Cubist曾經(jīng)報(bào)道過(guò)一個(gè)分子量為1618的雜質(zhì)，與我們分離到的新雜質(zhì)分子量一致，但是Cubist并沒(méi)有明確其結(jié)構(gòu)[4,6]。本文在達(dá)托霉素研究的基礎(chǔ)上，利用UPLC-MS和NMR分析了達(dá)托霉素新分離到的雜質(zhì)。測(cè)試結(jié)果表明，該雜質(zhì)與達(dá)托霉素的區(qū)別在于側(cè)鏈上有烯鍵，進(jìn)一步的研究結(jié)果表明，發(fā)酵原料癸酸中含有的微量癸烯酸是該雜質(zhì)形成的可能原因。因此，認(rèn)為在發(fā)酵過(guò)程中，控制起始原料癸酸的質(zhì)量，可以控制該雜質(zhì)的含量[7]。