黃曉偉 閆曉麗 田文雅 瞿旭東

(1 華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院，武漢 430030；2 武漢大學藥學院，武漢 430072)

天然產物對新藥的發(fā)現(xiàn)和發(fā)展至關重要。過去30年間，國際上被批準的小分子藥物中有50%以上來源于天然產物及其衍生物，抗腫瘤和抗感染(抗細菌、真菌、寄生蟲和病毒)的比率更是高達79.8%和69.8%[1]。然而由于長期缺乏新的研究方法和研究思路，新結構的活性天然產物發(fā)現(xiàn)率愈來愈低；加之新的代謝性疾病及多重耐藥菌的發(fā)展快于新活性化合物的臨床應用，醫(yī)藥領域對新的活性天然產物愈發(fā)迫切的需求，已成為當前藥物研發(fā)領域最需解決的瓶頸之一[2]。另外，從天然產物中發(fā)現(xiàn)新的活性化合物的方式也是化學合成所不能替代的[3-4]。因此，從天然產物中尋找具有新穎結構和顯著活性的化合物，仍將是更快捷、更有效的方式。

基因組學研究表明，目前已鑒定的微生物天然產物大約只占微生物生產能力的10%，大量的天然產物由于在實驗室條件下處于“沉默”狀態(tài)或微量表達而有待發(fā)掘[5-6]。隨著對天然產物生物合成機制了解的日漸深入，發(fā)現(xiàn)天然產物的“沉默”狀態(tài)或微量表達主要是由于在其生物合成基因的表觀遺傳、轉錄、翻譯以及蛋白后修飾環(huán)節(jié)的調控問題導致的[7]?；谶@些環(huán)節(jié)，近年來國際上發(fā)展了一系列有效的方法，在激活“沉默”天然產物生物合成基因簇("silent" or "cryptic" gene cluster)中取得了巨大成功[8]。其中，本研究發(fā)現(xiàn)了微生物體內磷酸泛酰巰基乙胺轉移酶(phosphopan-tetheinyl transferases,PPTase)過強或過弱的修飾次級代謝和初級代謝載體蛋白(carrier protein, CP)是導致天然產物沉默的重要因素[9]。通過向33株放線菌中過量表達來自枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)和黃萎病鏈霉菌(Streptomyces verticillus)的PPtase基因sfp和svp，共有23株菌株(70%)產生了一系列原先“沉默”的天然產物。對其中的一些菌株的激活產物的分離鑒定，我們發(fā)掘到了包括II型聚酮(type II polyketide) oviedomycin、I型聚酮(type I polyketide)化合物halichomycin和defumarylhygrolidin以及核苷類化合物puromycin等一系列沉默的天然產物[9-10]。為了進一步發(fā)掘和鑒定未知激活的天然產物，本研究中，我們對前期獲得的一株鏈霉菌重組菌株Streptomyces ghanaensisCGMCC 4.1967-PPtase中的一個未知激活組分的分離，通過核磁鑒定發(fā)現(xiàn)了其為一種高效的細胞因子抑制劑cytoxazone。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

儀器：LC-20AT型島津高效液相色譜(HPLC，Shimadzu公司)，C18分析柱(Agilent Eclipse XDB-C18，5μm，4.6mm×250mm，美國Agilent公司)；核磁儀(Bruker BioSpin GmbH，400MHz德國Bruker公司)；ZWY-2102C型搖床(上海智城分析儀器制造有限公司)，SPX-70BIII生化培養(yǎng)箱(天津市泰斯特儀器有限公司)。試劑：均為分析純試劑，購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 培養(yǎng)基和化學試劑

TSB(100mL)：3.0g 胰蛋白胨大豆肉(Tryptone Soya Broth, TSB)，去離子水定容至100mL。MS(100mL)：2.0g 甘露醇(Mannitol)，2.0g 黃豆粉(Soy Flour)，自來水定容至100mL。阿泊拉霉素(Apramycin，購自Sigma公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 發(fā)酵及HPLC檢測條件

從-30℃低溫保存冰箱中取出保種用的甘油管，在無菌操作臺中，取出20μLS.ghanaensisCGMCC 4.1967-PPTase菌液[9]接種于含有相應濃度的阿泊拉霉素抗生素的4mL TSB培養(yǎng)基中，于30℃、220r/min搖床培養(yǎng)至一定濃度，然后吸取200μL菌液轉接入250mL MS液體培養(yǎng)基中(共9L)，置于28℃，220r/min搖床中，發(fā)酵培養(yǎng)7d后取出。將等體積的乙酸乙酯加入發(fā)酵培養(yǎng)基中，超聲萃取15min，充分靜置分層后，取出乙酸乙酯層，反復萃取3次，旋轉濃縮得發(fā)酵浸膏9.5g。稱取少量浸膏，用甲醇溶解，溶液用0.22μm的有機相微孔濾膜過濾，用于HPLC檢測，檢測條件：分析條件為T=0min，5%B；T=50min，100%B；T=50.01min，5%B；T=60min，5%B。其中A相：超純水；B相：乙腈；流速為1mL/min；檢測波長為254nm；柱型號：Agilent Eclipse XDB-C18。

2 結果與討論

2.1 分析S.ghanaensis CGMCC 4.1967-PPTase發(fā)酵液組分

前期的研究過程中我們獲得了一株sfp和svp過表達的菌株S.ghanaensisCGMCC 4.1967-PPTase，該菌株相對于野生型菌株S.ghanaensisCGMCC 4.1967能夠激活產生聚酮化合物halichomycin和defumarylhygrolidin[9]。進一步對比其與野生菌株的發(fā)酵液組分，我們發(fā)現(xiàn)在檢測波長為254nm的條件下，保留時間為16.8min (HPLC)處還產生了一個顯著增強的峰(圖1)。盡管在野生型菌株發(fā)酵液相應的保留時間處也存在著一個峰，但是兩者之間的紫外吸收明顯不同，屬于不同化合物。

圖1 HPLC分析S.ghanaensis CGMCC 4.1967野生菌株和PPTase重組菌株的發(fā)酵液組分Fig.1 HPLC analysis of metabolites production in S.ghanaensis CGMCC 4.1967 wild-type and PPTase strains

2.2 分離鑒定激活產物

為了鑒定該激活產物，我們對發(fā)酵并萃取得到的9.5g浸膏與甲醇混溶后硅膠拌樣，以石油醚(PE):乙酸乙酯(EA)，乙酸乙酯:丙酮作為流動相，以硅膠作為固定相，TLC為檢測手段，按0:100～100:0的梯度進行洗脫，分離得9個組分(編號為S1～S9)；其中，目標化合物主要集中于S9(石油醚:乙酸乙酯=90:10)，分離流程見圖2。目標化合物在S9組分靜置過程中以白色無定型白色粉末形態(tài)析出，過濾分離以及反復溶解析出后可以得到純凈的化合物30mg。

2.3 化合物的結構鑒定

高分辨質譜分析確定該化合物正離子分子量為[M+H]+m/z224.0920，可以推出分子式為C11H13NO4。由1H (400MHz, CD3OD)(圖3A)，δH7.22(d,J=8.4Hz, 2H)，δH6.96 (d,J=8.4Hz, 2H)?？芍?，該化合物含有一個1,4-雙取代的苯環(huán)結構，這一點通過13C (101MHz, CD3OD)(圖3B)δC127.8，δC113.6的高度是其他碳譜的2倍得以證實。由δH3.82 (s, 3H)，δC54.4，δC159.9說明對位取代的基團是OMe。δC160.7說明含有一個羰基。由δC57.2，61.5，81.3可知這3個碳原子與雜原子相連，由δH5.00(d,J=8.4Hz, 1H)可知與該氫相連的碳原子與苯環(huán)相連(受苯環(huán)電子屏蔽效應，化學位移向低場位移)，且鄰位碳上含有一個氫原子，根據(jù)1H譜，該氫應是δH4.88(m, 1H)，所連碳原子為手性碳原子，則另外兩個氫原子δH3.20(m, 2H)所在的碳原子與其毗鄰，通過與文獻對比[11]，確定該化合物為cytoxazone。

圖2 Cytoxazone的分離純化流程Fig.2 Purification process of cytoxazone

Cytoxazone能夠選擇性抑制Th2細胞(對Th1細胞無效)產生Ⅱ型細胞因子，因此具有很好的應用前景，可以用于治療一系列細胞因子失調的疾病，如風濕免疫系統(tǒng)疾病，惡性淋巴瘤等[12]。此前，該化合物僅報道由一株分離自廣島的鏈霉菌(Streptomycessp.)產生[11]，S.ghanaensisCGMCC 4.1967中為首次分離得到。

圖3 Cytoxazone核磁譜圖Fig.3 NMR spectra of cytoxazone

3 結論

本研究通過對一株過表達了PPtase基因的重組菌株S.ghanaensisCGMCC 4.1967的發(fā)酵產物進行分析，發(fā)現(xiàn)了一個新的激活產物。通過擴大培養(yǎng)，分離純化和核磁鑒定，確定了該化合物為cytoxazone。該化合物是從嘎納鏈霉菌S.ghanaensisCGMCC 4.1967首次分離得到，為后續(xù)研究其生物合成機制，合成生物學改造，以及開發(fā)新結構活性細胞因子抑制劑提供了堅實的基礎。