鐘磊 孫青枝 李博 尹楚潔 趙壽媛 夏煥章

(沈陽藥科大學生命科學與生物制藥學院，沈陽 110016)

董德鑫等[1]1978年在廣西梧州地區(qū)土壤中分離得到一株不吸水鏈霉菌的亞種(S.ahygroscopicus)。該菌產生的次級代謝產物對多種植物病原真菌有較強的抑制和殺死作用，是防治植物病害較好的生物農藥[2]。陳文君等[3]在該菌的發(fā)酵液中分離得到了A1、A2、B和C 4個組分，其中A1、A2分別為多烯大環(huán)內脂類四霉素A(tetramycin)和四霉素B；B為肽類抗生素白諾氏菌素(albonursin)；C為含氮雜環(huán)類芳香族衍生物茴香霉素(anisomycin)。任君等[4]在不吸水鏈霉菌梧州亞種的突變株S91(S.ahygroscopicus S91, 菌種保藏號CGMCC4.7082)發(fā)酵液中分離得到了制霉菌素及豐加霉素，通過生物信息學分析及基因功能研究發(fā)現并確定了其生物合成基因簇和部分合成基因的功能。通過對吸水鏈霉菌的亞種基因組進行分析，該菌種除產生這些抗生素外還具有產生谷氏菌素等其他抗生素的能力，但目前在該菌種的發(fā)酵產物中并未分離得到這些抗生素。

谷氏菌素(又名星霉素或無穗霉素)是一種胞嘧啶核苷肽類抗生素，呈弱堿性，易溶于水，不溶于乙酸乙酯、氯仿、甲醇、乙醇等一般有機溶劑，室溫下不穩(wěn)定，純品易被氧化變黃。谷氏菌素最早是由日本科學家從谷氏鏈霉菌中分離得到的，并在1968年確定了其化學結構，其主要由核苷和肽基兩部分組成[5]。近年，通過生物信息學分析、構建基因阻斷突變株、異源表達的方法，初步探索了谷氏菌素的生物合成途徑及相關基因的功能[6-7]。

谷氏菌素的生物合成是由多步酶催化反應，酶催化反應受分級調控。其生物合成的前體主要有UDP-葡萄糖、胞嘧啶、甘氨酸和三磷酸甘油酸。在谷氏菌素的生物合成基因簇中，gouA、gouB、gouF和gouH參與了谷氏菌素核苷骨架的形成[6-7]。

王錦[8]前期構建了同時阻斷四霉素、制霉菌素和豐加霉素生物合成的阻斷菌株不吸水鏈霉菌ΔttmS1 ΔnysB ΔtymH，該菌株發(fā)酵產物中仍然產生抗真菌抗生素。本課題通過分離純化對該阻斷菌株的發(fā)酵產物進行鑒定，證明該菌株能夠產生云南霉素和谷氏菌素。

1 材料與方法

1.1 菌種

不吸水鏈霉菌ΔttmS1 ΔnysB ΔtymH：四霉素、制霉菌素、豐加霉素的生物合成阻斷菌株，本實驗室構建并保藏。

黑曲霉：生物活性檢定菌，本實驗室保藏。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 斜面培養(yǎng)基(g/L)

可溶性淀粉20.0，牛肉膏1.0，K2HPO4·3H2O 0.5，MgSO4·7H2O 0.5，NaCl 0.5，KNO30.1，FeSO4·7H2O 0.01，瓊脂15.0，pH7.2，121℃滅菌30min。

1.2.2 種子培養(yǎng)基(g/L)

葡萄糖20.0，酵母粉6.0，蛋白胨6.0，NaCl 10.0，pH7.2，121℃滅菌30min。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)

玉米淀粉8.0，玉米粉20.0，葡萄糖30.0，黃豆餅粉30.0，(NH4)2SO42.5，NaCl 0.2，K2HPO4·3H2O 0.2，MgSO4·7H2O 0.2，FeSO4·7H2O 0.2，輕質碳酸鈣5.0，pH7.2，121℃滅菌30min。

1.2.4 沙氏培養(yǎng)基(g/L)

用于培養(yǎng)黑曲霉。蛋白胨10.0，葡萄糖40.0，瓊脂12.0，pH自然，115℃滅菌30min。

1.3 主要試劑和儀器

瓊脂(青島海燕瓊膠有限公司)，三氯乙酸(分析純，山東西亞化學工業(yè)有限公司)，無水乙醇(天津市大茂化學試劑廠)，制霉菌素標準品(中國食品藥品檢定研究院)，DM-2樹脂(山東魯抗立科)，732樹脂(山東魯抗立科)。

LC-10AT型高效液相色譜儀(日本Shimadzu)SPD-10A型高效液相紫外檢測器(日本Shimadzu)，GL-21M高速冷凍離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)，SC-3612型低速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)，N-1001旋轉蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司)，立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)，離子阱質譜儀(美國Thermo Electron)，布魯克核磁共振儀(德國Bruker科學儀器公司)。

1.4 發(fā)酵培養(yǎng)

發(fā)酵液是經斜面孢子培養(yǎng)、種子培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)的步驟進行的：將不吸水鏈霉菌生物合成阻斷株S.ahygroscopicus ΔttmS1 ΔnysB ΔtymH菌種傳至合V斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)6～7d，待孢子變灰后挖菌塊接種到種子培養(yǎng)基，28℃、220r/min搖床振搖24h獲得種子液，按10%的接種量轉接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃，220r/min搖床振搖96h。

1.5 發(fā)酵液預處理

用草酸將發(fā)酵上清液調pH3.0，煮沸10min，4000r/min，離心10min，棄沉淀，收集上清，備用。

1.6 樣品抑制真菌實驗(紙片法)

向檢定盤中加入200mL加熱融化的培養(yǎng)基，使其在檢定盤底部均勻攤布，凝固后作為底層。另取100mL 沙氏培養(yǎng)基加熱融化后，放冷置48～50℃，加入檢定菌，搖勻倒入鋪有底層培養(yǎng)基的檢定盤中，作為菌層，培養(yǎng)基凝固后，將加有樣品的紙片貼于菌層上，在28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h，觀察抑菌情況，將有抑菌活性樣品收集，備用。

2 結果

2.1 發(fā)酵結果

發(fā)酵液經斜面孢子培養(yǎng)、種子培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)之后，收集上清。以制霉菌素為對照品，對原始發(fā)酵液進行生物效價測定，其效價為159.57U/mg，純度為2.4%(表1)。

2.2 發(fā)酵液的大孔吸附樹脂DM-2脫色處理

發(fā)酵液經草酸處理后，黏度變小，變澄清。這是由于在酸性環(huán)境及加熱情況下雜蛋白、多糖等高分子雜質變性形成沉淀，純度提高到3.37%。

考察pH值對樹脂吸附效果的影響。取60mL預處理發(fā)酵液，均分到6個250mL錐形瓶中，每瓶10mL，分別用1mol/L HCl和1mol/L NaOH調pH為1、3、5、7、9和11，向其中加入2g DM-2大孔吸附樹脂，置于28℃，220r/min搖床振搖4h，靜置30min。如圖1所示，發(fā)現在pH1、3和5時脫色效率較高。通過生物效價測定經樹脂吸附后洗脫液的活性損失率(圖2)，pH1時活性物質損失最少，所以在后續(xù)試驗中采用pH1對發(fā)酵液進行脫色處理。pH1時每10mL發(fā)酵液中脫色樹脂的加入量為1.0g。

表1 各純化過程中樣品量和產物純度變化Tab.1 Changes in sample amount and product purity during each purification process

圖1 在不同pH條件下DM-2樹脂脫色前后對比Fig.1 Comparison of decolorization of DM-2 resin at different pH conditions

2.3 發(fā)酵液的732離子交換樹脂處理

本實驗采用NH3·H2O進行解吸。探索了樹脂靜態(tài)吸附動力學曲線、穿透曲線、動態(tài)解吸曲線(圖3～5)。

2.4 醇沉實驗

將732樹脂的洗脫液合并，減壓濃縮后，用36%乙酸調pH至4.5，加8BV 95%乙醇置于4℃冰箱過夜，然后4℃，4000r/min，離心10min，取沉淀揮干，得到3.99g褐色粉末即活性組分的鹽。經醇沉后純度提高到18.67%，效價達到1231.12U/mg。如表1產物純度得到了提高。

圖2 在不同pH條件下DM-2樹脂脫色后活性單位的損失百分含量Fig.2 Percentage of loss of active units after decolorization of DM-2 resin at different pH

圖3 732樹脂的靜態(tài)吸附動力學曲線Fig.3 Static adsorption kinetics of 732 resin

圖4 不同流速下的穿透曲線Fig.4 Penetration curves at different flow rate

圖5 732樹脂的動態(tài)吸附動力學曲線Fig.5 Dynamic elution curve of 732 resin

2.5 中性氧化鋁柱柱層析

將3.99g經乙醇沉淀后褐色粉末經氧化鋁柱進一步精制，可以去除大部分雜質。通過生物活性跟蹤可以發(fā)現活性組分主要集中在70%甲醇與50%甲醇洗脫液中。將得到的活性洗脫液進行濃縮，加入8BV甲醇后得到白色沉淀物，經干燥稱重得420mg。如表1所示，產物純度得到了進一步提升，達到86.19%。

2.6 葡聚糖凝膠柱層析

將14.6mg甲醇沉淀物進一步純化，通過生物活性跟蹤，分別將兩部分收集液合并，編號A、B管，凍干后分別得到8.7和4.0mg白色粉末。

用92%H2O(0.1%TCA)+8%甲醇作流動相分別對A管、B管洗脫液進行液相檢測，如圖6所示，A管中物質純度98.49%，命名為物質A；B管中物質純度98.64%，命名為物質B。為了進一步對其結構進行鑒定，對A、B進行凍干處理，得到白色粉末。

2.7 活性物質結構解析

2.7.1 紫外可見分光光度法

波譜掃描活性物質在不同條件下檢測紫外吸收光譜(圖7)，pH對其吸收光譜影響顯著，說明其生色團中含有酸堿基團，并且其紫外特征與稻瘟菌素的紫外光譜相類似，由此推測其可能是胞嘧啶核苷類化合物[9-10]。

圖6 高效液相檢測化合物A和化合物BFig.6 HPLC analysis of compound A and compound B

2.7.2 化合物質譜分析

根據ESI-MS質譜(圖8)，由445[M+H]+和444[M+H]+峰可以推測出化合物A和B的分子量分別為444和443。

2.7.3 核磁共振波法結構鑒定

從化合物A的1H NMR(D2O)(圖9)數據分析其主要化學位移，并結合分子量、氫譜、碳譜(圖10)數據推測其分子式為C16H24N6O9，其C和H化學位移與文獻報道的云南霉素[11]相近(表2)，鑒定化合物A為云南霉素。從化合物B的1H NMR(D2O)(圖11)數據分析其主要化學位移，由化合物B的13C NMR(D2O)(圖12)分析，該化合物含有16個碳，結合其化學位移，分子量、氫譜、碳譜數據推測其分子式為C16H25N7O8，其C和H化學位移與文獻報道的谷氏菌素[12-13]比較相近(表3)。同時由于寧南霉素與谷氏菌素的區(qū)別僅在于結構式中二肽部分絲氨酸的構型不同，所以僅通過氫譜與碳譜數據不能確定其為具體谷氏菌素、寧南霉素或兩者混合物，這需要結合其他相關檢測方法進一步驗證。

圖8 化合物A和B的質譜圖Fig.8 Mass spectrum of compound A and compound B

圖9 化合物A的氫譜Fig.9 The hydrogen spectrum of compound A

圖10 化合物A的碳譜Fig.10 Carbon spectrum of compound A

表2 化合物A與云南霉素的1H和13C 化學位移數據對比Tab.2 Comparison of 1H and 13C chemical shift data for compound A and yunnanmycin

圖11 化合物B的氫譜Fig.11 The hydrogen spectrum of compound B

圖12 化合物B的碳譜Fig.12 Carbon spectrum of compound B

表3 化合物B與谷氏菌素的1H和13C 化學位移數據對比Tab.3 Comparison of 1H and 13C chemical shift data for compound B and gougerotin

通過對紫外光譜、質譜及核磁數據的綜合分析，確定化合物A和B為核苷類化合物，其分別與文獻已報道的云南霉素和谷氏菌素或寧南霉素結構一致。

3 討論

不吸水鏈霉菌(Streptomyces ahygroscopicus)S91(CGMCC4.7082)能夠發(fā)酵產生豐加霉素、制霉菌素、四霉素和茴香霉素。該菌種基因組中還包含谷氏菌素生物合成基因簇(GenBank: KY089035.1)，但目前在該菌種的發(fā)酵產物中并未分離得到這些抗生素。說明該合成基因簇處于“沉默”狀態(tài)，表達量少或者根本沒有表達，從而無法檢測到相應產物。

本課題使用實驗室前期構建的同時阻斷四霉素、制霉菌素和豐加霉素生物合成的阻斷菌株不吸水鏈霉菌ΔttmS1ΔnysBΔtymH，發(fā)酵液中分離純化獲得云南霉素、谷氏菌素或寧南霉素。云南霉素、谷氏菌素和寧南霉素都由同一個合成基因簇編碼合成，云南霉素是谷氏菌素合成的中間代謝產物，寧南霉素和谷氏菌素是立體異構體，能夠相互轉化。這2種或3種抗生素的產生，證明該“沉默”基因簇得到了激活。阻斷其他抗生素的合成為什么會激活“沉默”基因簇，目前還不清楚，可能是由于谷氏菌素族抗生素和豐加霉素都屬于核苷類抗生素，一種抗生素的基因阻斷(沉默)增加了另一種抗生素前體的供應，從而提高了其產量。這種現象已有報道，如在不吸水鏈霉菌中阻斷四霉素生物合成，同屬大環(huán)多烯類抗生素的制霉菌素產量得到提高[14]。云南霉素和谷氏菌素生物合成基因簇已經被報道，因此也可以參考文獻方法進一步通過基因工程的方法在不吸水鏈霉菌中提高相應抗生素的產量[15]。