孔祥生 劉江波 陳付英 胡小華 李 明

大皰性表皮松解癥(epidermolysis bullosa,EB)是由于角質(zhì)形成細胞或皮膚基底膜區(qū)內(nèi)的蛋白結(jié)構(gòu)異常導致的一類遺傳性皮膚病，在新生兒中的發(fā)病率接近十萬分之二[1]。其主要特點是患者皮膚和黏膜的脆性增加，即使是輕微的創(chuàng)傷也會引起水皰或大皰，在水皰破裂后出現(xiàn)表皮缺損和糜爛[2]。EB按照表皮的分離水平和水皰的形成位置可分為單純型大皰性表皮松解癥(epidermolysis bullosa simplex,EBS)、營養(yǎng)不良型大皰性表皮松解癥(epidermolysis bullosa dystrophica,DEB)、交界型大皰性表皮松解癥(epidermolysis bullosa junctional,JEB)和Kindler綜合征四種主要類型[3,4]。其中EBS的水皰形成在表皮的基底細胞層，大多與編碼角蛋白的基因KRT5和KRT14發(fā)生突變有關(guān)，少數(shù)與PLEC、DST和KLHL24基因突變有關(guān)[5,6]；DEB的水皰形成在錨原纖維水平，與編碼Ⅶ型膠原蛋白的基因COL7A1發(fā)生突變有關(guān)；JEB的水皰形成在基底膜帶水平的透明板處，與編碼層粘連蛋白-332的3個多肽(α3、β3和γ2)的基因LAMA3、LAMB3和LAMC2，編碼α6β4整合素的基因ITGA6和ITGB4，編碼大皰性類天皰瘡抗原BPAG2的基因COL17A1發(fā)生突變有關(guān)[2,4,7]；而Kindler綜合征的水皰可以形成在多個位置，與FERMT1基因突變有關(guān)[3,8]。本研究通過靶向捕獲-高通量測序，結(jié)合Sanger測序檢測一例交界型大皰性表皮松解癥患兒。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 患兒，男，1歲。出生時指(趾)甲顯著肥厚，大約6個月時頸后、耳廓、腋后、臀部等易摩擦部位開始出現(xiàn)漿液性或血性水皰，部分水皰糜爛結(jié)痂(圖1)，皮損進行性加重，同時伴有聲音嘶啞?；純焊改阜墙H結(jié)婚，雙方臨床表型均未見異常。

圖1a、b：患兒指(趾)甲肥厚；c～f：患兒頸后、耳廓、腋后、臀部水皰糜爛結(jié)痂

1.2 核酸提取 在取得患兒父母的知情同意后用5 mL EDTA抗凝采血管分別取患兒及患兒父母的外周血2 mL，用AxyPrep血基因組DNA小量制備試劑盒(AP-MN-BL-GDNA-250G)提取基因組DNA；分別取患兒父母的頭發(fā)20根，將毛囊部分剪到1.5 mL離心管中，各加入1 mL trizol，用天根公司RNAsimple Total RNA Kit(DP419)提取RNA。

1.3 文庫構(gòu)建 取1 μg患兒基因組DNA用covaris超聲波破碎儀打斷至片段長度在150～250 bp，用羅氏公司KAPA High Throughput Library Preparation Kit(7138008001)將DNA片段經(jīng)末端補平、加A尾、連接接頭和PCR富集得到DNA文庫。然后將DNA文庫與探針(該探針為安百隆生物公司設計的遺傳性皮膚病檢測專用panel，由羅氏公司合成)雜交過夜，在包被有鏈霉親和素的磁珠幫助下將panel所涵蓋的與遺傳性皮膚病密切相關(guān)的541個基因的全部外顯子捕獲下來，經(jīng)PCR富集得到捕獲文庫。

1.4 高通量測序及分析 將質(zhì)檢合格的捕獲文庫用Illumina Hiseq Xten高通量測序儀測序，然后使用BWA、Samtools和Picard軟件將測序得到的reads比對到人類參考基因組GRCh37/hg19，生成的bam文件采用GATK系列軟件進行局部重新比對，去除重復序列后檢出變異，最后使用Annovar軟件對vcf變異文件進行注釋。以在ExAC_EAS及千人基因組數(shù)據(jù)庫中突變頻率小于0.01為標準進行篩選，結(jié)合患兒臨床表型分析，在LAMA3基因上找到2個雜合突變。

1.5 DNA驗證 使用NCBI網(wǎng)站上的Primer-blast設計DNA引物，F(xiàn)1：5’-GTCTGAAGTGACCAAGGATT-3’和R1：5’-CCCATATCTAGGGCAAGTTC-3’，F(xiàn)2：5’-TACAGGTTTTTCTTGGCACT-3’和R2：5’-AGTTAGCACTGAAGTCAAGG-3’，驗證患兒2個突變的來源。PCR反應體系為20 μL，其中DNA模板50 ng，上、下游引物各0.5 μL(10 pM)，2×Ex Taq premix(Takara)10 μL。PCR反應在ABI Veriti PCR儀上進行：預變性96℃ 3 min，變性96℃ 30 s，退火60℃ 30 s，延伸72℃ 1 min，35個循環(huán)，最后72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳，割膠回收后用ABI 3730XL型全自動測序儀測序(安百隆生物)。

1.6 cDNA驗證 取正常人和患兒父母的毛囊RNA各800 ng，分別用Takara公司的PrimeScript RT Master Mix(RR036A)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。使用NCBI網(wǎng)站上的Primer-blast設計cDNA引物，F(xiàn)3：5’-TTGGGAGCCATTCAGAGACA-3’和R3：5’-TTCCTTTATCACTGTCTGGAGG-3’，F(xiàn)4：5’-CTTGGCTCACTCTGTATTGT-3’和R4：5’-CTACTGTCTGTGTCCAGTTC-3’，驗證2個突變對RNA剪接的影響。PCR體系及擴增條件與DNA驗證中相同，PCR產(chǎn)物用3%瓊脂糖凝膠電泳，割膠回收后用ABI3730XL型全自動測序儀測序。

2 結(jié)果

通過靶向捕獲-高通量測序在JEB的致病基因LAMA3(NM_001127718.2)上找到2個影響RNA剪接的雜合突變：exon12: c.1478+5G>A和exon34:c.4647+5G>C。DNA驗證結(jié)果表明患兒的這2個突變分別遺傳自其父親和母親(圖2)。cDNA驗證結(jié)果表明c.1478+5G>A導致mRNA上發(fā)生了缺失(圖3a)，即c.1381_1478del，原因是12號外顯子3’端剪接位點前移了98bp(圖4a)，c.4647+5G>C導致mRNA上發(fā)生了插入(圖3b)，即c.4647_4648ins74，原因是34號外顯子3’端剪接位點后移了74 bp(圖4b)，即插入序列為c.4647+1_4647+74。檢索HGMD數(shù)據(jù)庫(http://www.hgmd.org)、LOVD數(shù)據(jù)庫(http://www.lovd.nl/LAMA3)以及最新LAMA3基因相關(guān)文獻均未見有關(guān)以上兩個突變的報道。

圖2a：患兒(S)c.1478+5G>A遺傳自其父親(F)；b：患兒(S)c.4647+5G>C遺傳自其母親(M)

圖3a：患兒父親(2泳道)與正常人(1泳道)相比，mRNA上有缺失；b：患兒母親(2泳道)與正常人(1泳道)相比，mRNA上有插入圖4A1和A3為圖3a中444bp條帶測序結(jié)果，A2為圖3a中346bp條帶測序結(jié)果；B1和B3為圖3b中353bp條帶測序結(jié)果，B2為圖3b中279bp條帶測序結(jié)果

3 討論

交界型大皰性表皮松解癥與其他幾種類型相比，不但基因雜合程度高，而且往往癥狀較重。特別是當LAMA3、LAMB3和LAMC2這三個基因中的任何一個發(fā)生突變時都可能導致層粘連蛋白-332的含量顯著降低甚至消失，因而往往具有致死性[3，9，10]，這種類型稱為嚴重泛發(fā)型交界型大皰性表皮松解癥。層粘連蛋白-332局限于鱗狀上皮，如皮膚的基底膜中，它定位于錨絲并與半橋粒相連，對基底膜的構(gòu)建和穩(wěn)定具有非常重要的作用[11]。嚴重泛發(fā)型交界型大皰性表皮松解癥十分罕見，在新生兒中的發(fā)病率在0.00004%～0.0004%[9]，患兒常在出生時即有嚴重廣泛性分布的大皰和大面積的皮膚剝脫，可于數(shù)日至數(shù)月內(nèi)死亡，嬰兒如幸存，其后仍可發(fā)生生長遲緩及中或重度的頑固性貧血，多數(shù)于2歲內(nèi)死亡[12]。

本次檢測到的LAMA3基因上的兩個突變：c.1478+5G>A位于12號外顯子的下游，導致在RNA剪接時12號外顯子3’端的98bp外顯子片段丟失，翻譯時出現(xiàn)移碼并在第469位形成提前終止密碼子(p.Val461AspfsX9)；c.4647+5G>C位于34號外顯子下游，導致在RNA剪接時34號外顯子下游的74 bp內(nèi)含子片段被插入到34號和35號外顯子之間，翻譯時出現(xiàn)移碼并在第1557位形成提前終止密碼子(p.Thr1551CysfsX7)，二者均導致LAMA3基因的編碼蛋白錯誤和截短，直接引起其功能改變。

交界型大皰性表皮松解癥預后差，至今無有效治療方法，產(chǎn)前診斷是主要干預手段。我們應用靶向捕獲-高通量測序技術(shù)在本例患兒中新發(fā)現(xiàn)2個影響RNA剪接的突變，增加了中國人群LAMA3基因的突變數(shù)據(jù)庫，為該患兒的父母預防下一胎患病所需的產(chǎn)前診斷打下了基礎，也為探討該病的發(fā)病機制以及將來的基因治療提供了參考。