侯 磊，薛 蓓，薛會(huì)英

(西藏農(nóng)牧學(xué)院，西藏 林芝 860000)

土壤線蟲作為土壤動(dòng)物中的優(yōu)勢(shì)類群，是草地生態(tài)系統(tǒng)中的消費(fèi)者，關(guān)系到草地生產(chǎn)力的增減[1]。藏北草地位于青藏高原腹地，是該區(qū)域最為主要的生態(tài)系統(tǒng)類型。該生態(tài)系統(tǒng)極為脆弱，對(duì)人為干擾和氣候變化的響應(yīng)十分敏感，遭破壞后很難短期內(nèi)恢復(fù)，故而可能影響草場(chǎng)質(zhì)量和牧民生產(chǎn)生活[2]。目前，氣候變暖已成既定事實(shí)[3]，并且持續(xù)升溫，據(jù)預(yù)測(cè)本世紀(jì)末全球平均氣溫將升高1.8～4.0℃[4]，而高海拔地區(qū)溫度的增幅和響應(yīng)將更為顯著和迅速[5-6]。隨著青藏高原暖化，藏北草地的生態(tài)系統(tǒng)特征也將隨之改變，目前這方面研究集中在藏北草地植物生物量、多樣性和物候等方面[7-10]。作為該生態(tài)系統(tǒng)的一部分，藏北草地土壤線蟲的研究也局限于草地植物群落對(duì)其的影響[11-13]，其對(duì)增溫有何響應(yīng)，目前了解甚少。

王學(xué)霞等[14]通過在藏北高寒草甸的OTC(open top chamber，OTC)增溫試驗(yàn)，研究了長(zhǎng)期增溫和短期增溫對(duì)土壤線蟲群落的影響，認(rèn)為增溫降低了土壤線蟲數(shù)量。該研究采用傳統(tǒng)的土壤線蟲形態(tài)學(xué)分離鑒定法，雖然能比較準(zhǔn)確的反映線蟲群落狀況，但費(fèi)時(shí)費(fèi)力[15]。隨著分子生物學(xué)和生物信息學(xué)的高速發(fā)展，高通量測(cè)序技術(shù)廣泛應(yīng)用于微生物的研究[16-18]，在線蟲方面也得到一些應(yīng)用，用以分析線蟲群落特征及其對(duì)植物群落的響應(yīng)[19-20]，但在青藏高原土壤線蟲及其增溫響應(yīng)方面還未見該技術(shù)的應(yīng)用。

本研究采用OTC模擬增溫方法，利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)藏北高寒草甸土壤線蟲的群落組成進(jìn)行分析，討論增溫對(duì)土壤線蟲群落的影響，有助于理解線蟲群落對(duì)增溫的適應(yīng)過程，增強(qiáng)對(duì)氣候變暖影響的認(rèn)識(shí)，為藏北高寒草甸的管理維護(hù)提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 樣地概況

藏北高寒草原呈高原水平地帶性分布(海拔4 300～5 200 m)，高原大陸性氣候特征極為明顯，暖季短且溫涼，冷季長(zhǎng)且寒冷，年平均氣溫-2.8～1.6℃，全年無絕對(duì)無霜期，最冷月(1月)、最熱月(7月)平均氣溫分別為-10～-12℃和7～12℃，≥0℃年積溫800～1 100℃，年降水量100～300 mm，年蒸發(fā)量1 500～2 300 m，干燥度6.7～20[21]。

試驗(yàn)樣地設(shè)置在西藏自治區(qū)那曲市色尼區(qū)克瑪村中國(guó)科學(xué)院青藏高原研究所那曲生態(tài)環(huán)境綜合觀測(cè)研究站內(nèi)(31°31'38″～31°32'02″N，92°04'03″～92°04'16″E)，土壤為高山草甸土，植物主要優(yōu)勢(shì)種及亞優(yōu)勢(shì)種有高山嵩草(Kobresiapygmaea)、矮火絨草(Leontopodiumnanum)、矮生嵩草(K.humilis)、二裂委陵菜(Potentillabifurca)、釘柱委陵菜(P.saundersiana)、乳白香青(Anaphallislactea)等[22]。

2017年5月，在研究站固有圍欄樣地內(nèi)設(shè)置3個(gè)OTC裝置作模擬增溫處理，面積均為2.5 m×2.5 m，每個(gè)OTC間距均大于100 m，整體呈等邊三角形設(shè)置。在等邊三角形中心位置設(shè)置1個(gè)空白對(duì)照試驗(yàn)樣地。圍欄樣地內(nèi)地勢(shì)平坦，落差不足5 m。

1.2 土樣采集及土壤理化指標(biāo)測(cè)定

2017年8月，在OTC裝置內(nèi)及其形成的等邊三角形幾何中心位置采樣，分別采集0～5，5～10，10～15，15～20，20～25 cm共5個(gè)深度的土層原狀土樣，裝入無菌采樣袋中，放入冰盒內(nèi)，于12 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室置于-80℃冰箱內(nèi)保藏備用。將土壤樣品按照不同深度及OTC內(nèi)外進(jìn)行樣品編號(hào)，將OTC內(nèi)0～5，5～10，10～15，15～20，20～25 cm的土壤樣品分別編號(hào)為OTC1，OTC2，OTC3，OTC4和OTC5，將OTC外0～5，5～10，10～15，15～20，20～25 cm的土壤樣品分別編號(hào)為OTCW1，OTCW2，OTCW3，OTCW4和OTCW5。0～5 cm處OTC內(nèi)土溫比OTC外土溫平均高出2.4℃，5～10 cm處平均高出1.9℃，10～15 cm處平均高出1.0℃，15～20 cm處平均高出0.8℃，20～25 cm處平均高出0.8℃。

土壤pH值采用酸度計(jì)法，含水率采用烘干法，有機(jī)質(zhì)采用重鉻酸鉀容量法，銅、鋅采用原子吸收法，氮采用半微量開氏法，磷采用氫氧化鈉熔融-鉬銻抗比色法，鉀采用氫氧化鈉熔融法[23]。

1.3 DNA抽提和PCR擴(kuò)增

根據(jù)E.Z.N.A.?soil試劑盒(Omega Bio-tek，Norcross，GA，US)說明書進(jìn)行總DNA抽提，DNA濃度和純度利用NanoDrop2000進(jìn)行檢測(cè)，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量；引物采用NF1F-18Sr2bR，即NF1F 5’-GGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTT-3’和18Sr2bR 5’-TACAAA GGGCAGGGACGTAAT-3’引物[24]，進(jìn)行PCR擴(kuò)增[25]。PCR擴(kuò)增正式試驗(yàn)采用TransGen AP221-02：TransStartFastpfu DNA Polymerase，20μL反應(yīng)體系如下：5×FastPfu Buffer 4 μL，2.5 mM dNTPs 2 μL，F(xiàn)orward Primer(5uM)0.8 μL，Reverse Primer(5uM)0.8 μL，F(xiàn)astPlu Polymerase 0.4 μL，BSA 0.2 μL，Template DNA 10ng，補(bǔ)ddH2O至20 μL。PCR儀：ABI GeneAmp? 9700型。PCR反應(yīng)參數(shù)：

1.4 Illumina Miseq測(cè)序

委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司利用Illumina公司的Miseq PE300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.5 數(shù)據(jù)處理及分析

在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司云平臺(tái)上進(jìn)行在線分析(www.i-sanger.com)。其他數(shù)據(jù)處理采用SPSS20.0軟件。

原始測(cè)序序列使用Trimmomatic質(zhì)控軟件，使用FLASH軟件進(jìn)行拼接：設(shè)置50 bp的窗口，若窗口內(nèi)平均質(zhì)量值低于20，則從窗口開始截去后端堿基，去除質(zhì)控后長(zhǎng)度低于50 bp的序列。barcode需精確匹配，引物允許2個(gè)堿基的錯(cuò)配，去除模糊堿基。根據(jù)重疊堿基overlap將兩端序列進(jìn)行拼接，overlap需大于10bp。去除無法拼接的序列。使用UPARSE軟件(version 7.1)，根據(jù)97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行OTU聚類。使用UCHIME軟件剔除嵌合體。利用RDP classifier對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類注釋，比對(duì)NCBI(NT)，設(shè)置比對(duì)閾值為70%[26]。

利用冗余分析反映土壤線蟲與土壤環(huán)境因子的關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 OTU組成分析

在97%相似度下用QIIME軟件將有效序列聚類為用于物種分類的OTU (Operational taxonomic unit)，根據(jù)多樣性指數(shù)為sobs(表征實(shí)際觀測(cè)到的物種數(shù)目)做稀釋曲線。10個(gè)樣品的稀釋曲線如圖1所示，曲線均趨于平坦，增加數(shù)據(jù)總量對(duì)OTU沒有影響，樣本OTU覆蓋度基本飽和，說明所得序列能基本反映土壤生物群落結(jié)構(gòu)。

圖1 OTC內(nèi)外土壤生物測(cè)序的稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves of each sample

2.2 OTC內(nèi)外土壤生物組成分析

2.2.1綱分類水平上OTC內(nèi)的土壤生物分布 綱水平各樣本土壤線蟲群落分布圖如圖2，在OTC1，OTCW1，OTC2，OTCW2，OTC3，OTCW3，OTC4，OTCW4，OTC5和OTCW5中刺嘴綱(Enoplea)是優(yōu)勢(shì)土壤線蟲群落，分別占到各樣本線蟲群落的72.13%，61.42%，80.51%，70.05%，76.79%，50.21%，54.72%，31.43%，77.90%和55.42%；其次為色矛綱(Chromadorea)，在OTC1，OTCW1，OTC2，OTCW2，OTC3，OTCW3，OTC4，OTCW4，OTC5和OTCW5相對(duì)豐度為17.54%，29.46%，12.04%，23.65%，12.62%，46.91%，28.13%，51.47%，16.92%和35.26%。從圖2可知，在0～5，5～10，10～15，15～20，20～25 cm土壤樣品中，土壤線蟲群落構(gòu)成分布都呈現(xiàn)明顯的規(guī)律：即OTC外的色矛綱(Chromadorea)的相對(duì)豐度都較OTC內(nèi)的大，OTC外的刺嘴綱(Enoplea)的相對(duì)豐度都較OTC內(nèi)的小。

圖2 綱水平各樣品生物比例分布圖Fig.2 Species proportion distribution of each sample at the Class level

2.2.2目分類水平上OTC內(nèi)外的土壤生物分布 目水平各樣本土壤線蟲群落分布圖如圖3，在10個(gè)樣本中屬于土壤線蟲的群落目分別是矛線目(Dorylaimida)、墊刃目(Tylenchida)、未分類的線蟲目(unclassified_p_Nematoda)、三矛目(Triplonchida)、小桿目(Rhabdtida)、刺嘴目(Enoplida)和疏毛目(Araeolaimida)這7個(gè)目。其中矛線目(Dorylaimida)在10個(gè)樣本中含量均較高，在OTC1，OTCW1，OTC2，OTCW2，OTC3，OTCW3，OTC4，OTCW4，OTC5和OTCW5相對(duì)豐度分別為70.85%，61.25%，79.49%，66.70%，75.99%，47.35%，48.13%，30.73%，62.57%和15.02%；其次為墊刃目(Tylenchida)，在OTC1，OTCW1，OTC2，OTCW2，OTC3，OTCW3，OTC4，OTCW4，OTC5和OTCW5相對(duì)豐度分別為：11.71%，13.28%，10.31%，21.66%，11.35%，46.69%，22.72%，49.90%，15.37%和34.07%；刺嘴目(Enoplida)在OTC5中的相對(duì)豐度較高，含量分別7.49%；三矛目(Triplonchida)在OTCW5中相對(duì)豐度較高，含量為37.91%。從圖3可知，在0～5，5～10，10～15，15～20，20～25 cm土壤樣品中，土壤線蟲群落構(gòu)成分布都呈現(xiàn)明顯的規(guī)律：即OTC內(nèi)的矛線目(Dorylaimida)的相對(duì)豐度都較OTC外的大，OTC內(nèi)的墊刃目(Tylenchida)的相對(duì)豐度都較OTC外的小。

圖3 目水平OTC內(nèi)外土壤生物差異檢驗(yàn)柱形圖Fig.3 Species proportion distribution of each sample at the Order level

2.2.3OTC內(nèi)外土壤線蟲群落結(jié)構(gòu)的差異 為進(jìn)一步分析土壤線蟲群落與不同樣品間的關(guān)系，在屬分類水平上對(duì)各樣品所含土壤生物進(jìn)行聚類，構(gòu)建含有樣本聚類關(guān)系樹、系統(tǒng)發(fā)育樹的熱圖(heatmap)，該圖能夠反映在屬分類水平各生物群落結(jié)構(gòu)的差異(圖4)。由圖4可知，OTC2和OTCW2群落組成是最相似的，從OTCW5、OTCW3、OTCW4、OTC5、OTC4、OTC1、OTC3、OTCW1、OTC2到OTCW2群落的組成相似性有一個(gè)遞增的趨勢(shì)。熱圖中共顯示30 個(gè)土壤線蟲屬，分別為Sakia、Lelenchus、Prismatolaimus、Tylenchus、Meloidoderita、Ecphyadophora、Tylencholaimus、Paratrichodorus、Clavicaudoides、Acrobeloides、Aphelenchoides、Filenchus、Boleodorus、Alaimus、Dorylaimellus、unclassified_p_Nematoda、Pratylenchus、Merlinius、Meloidogyna、Aphelenchus、Paravulvus、Odontolaimus、Hoplolaimus、Trichodorus、Longidorus、Cylindrolaimus、Acrobeles、Ecumenicus、Rhabdolaimus、Belonolaimus、Proleptonchus、Ditylenchus、Malenchus、Aglenchus、Mononchoides、Eucephalobus、Basiria。熱圖中的OTCW5、OTCW4、OTC3檢測(cè)到15個(gè)生物屬，OTC1、OTCW2檢測(cè)到17個(gè)生物屬，OTCW3、OTCW1檢測(cè)到14個(gè)生物屬，OTC2、OTC4、OTC5分別檢測(cè)到18個(gè)、16個(gè)和13個(gè)生物屬，OTC1、OTCW2檢測(cè)到17個(gè)生物屬。在屬分類水平上，土壤生物根據(jù)進(jìn)化關(guān)系聚類為6大分支，其中樣本OTC1、OTC3、OTCW1、OTC2和OTCW2構(gòu)成一支，樣本OTCW5、OTCW3、OTCW4、OTC5、OTC4獨(dú)自構(gòu)成一支，這說明樣本OTCW5、OTCW3、OTCW4、OTC5、OTC4與其他5個(gè)樣本有明顯的不同。此外，OTC2和OTCW2土壤生物進(jìn)化關(guān)系較近，OTC1和OTC3土壤生物進(jìn)化關(guān)系較近、OTCW1居于OTC3和OTC2之間且趨近于OTC2。

圖4 OTC內(nèi)外的土壤生物heatmap圖Fig.4 Heatmap of different sample

2.3 線蟲群落與土壤理化指標(biāo)的關(guān)系

OTC內(nèi)外土壤理化指標(biāo)見表1。

第一主軸和第二主軸對(duì)土壤線蟲群落相對(duì)豐度方差的解釋比例分別為14.92%和9.04%，兩者共解釋23.96%的方差變化(圖5)。第一主軸上，Cu(Cu2+)和Zn(Zn2+)是主要的影響因子，相關(guān)系數(shù)分別為0.9812和-0.9985。第二主軸上，YJZ(有機(jī)質(zhì))和pH是主要的影響因子，相關(guān)系數(shù)分別為-0.9881和0.9996。綜上，與土壤綱水平線蟲群落相關(guān)性較大的土壤理化指標(biāo)是Cu2+、Zn2+、有機(jī)質(zhì)和pH、K+、Cu2+、含水率、有機(jī)質(zhì)與刺嘴綱(Enoplea)有較強(qiáng)正相關(guān)性，pH、Zn2+、N與刺嘴綱(Enoplea)呈負(fù)相關(guān)。K+、Cu2+、含水率、pH與色矛綱(Chromadorea)有較強(qiáng)正相關(guān)性，有機(jī)質(zhì)、Zn2+、N與色矛綱(Chromadorea)呈負(fù)相關(guān)。

表1 試驗(yàn)地土壤基本理化性質(zhì)Table 1 The basic physical and chemical properties of experimental soil

注：同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)

Note：Different letters in the same column indicate significant differences at the 0.05 level

圖5 綱分類水平土壤線蟲群落與土壤理化指標(biāo)的冗余分析Fig.5 Redundancy analysis of nematode and soil physical and chemical parameters

3 討論與結(jié)論

土壤線蟲對(duì)氣候變暖有響應(yīng)。青藏高原土壤線蟲對(duì)增溫的響應(yīng)研究少見報(bào)道，雖有學(xué)者研究，但仍采取傳統(tǒng)的線蟲形態(tài)學(xué)鑒定方法，討論的是短期增溫和長(zhǎng)期增溫條件下土壤線蟲的多樣性及不同營(yíng)養(yǎng)類群線蟲的變化對(duì)比[14]。就目前的研究而言，增溫對(duì)土壤線蟲的影響是確定的，但不同學(xué)者的看法不同。一種觀點(diǎn)認(rèn)為土壤線蟲畏熱，增溫使其多樣性減少[27]；另一種觀點(diǎn)則認(rèn)為土壤線蟲多樣性與溫度正相關(guān)[28-29]。土壤線蟲的不同營(yíng)養(yǎng)類群和種屬對(duì)增溫的響應(yīng)也不相同[30-32]。本研究未從土壤線蟲多樣性和種屬、營(yíng)養(yǎng)類群角度探究其對(duì)增溫的響應(yīng)，而是從綱、目分類學(xué)水平上探討了土壤線蟲相對(duì)豐度的變化，得出一個(gè)較為宏觀的結(jié)果。此外，研究表明土壤線蟲對(duì)增溫的響應(yīng)也與不同地區(qū)的具體氣候密切相關(guān)。例如，Ruess等[30]在極地和Simmons等[33]在南極洲干谷所做的土壤增溫試驗(yàn)，所得結(jié)論完全相反，前者認(rèn)為土壤線蟲與溫度顯著正相關(guān)，后者認(rèn)為是負(fù)相關(guān)。更有在其他地區(qū)的研究結(jié)果表明增溫對(duì)土壤線蟲群落無顯著影響[34-35]。這種矛盾結(jié)果證明土壤線蟲對(duì)增溫的響應(yīng)與地區(qū)氣候及生態(tài)類型有關(guān)。土壤條件也會(huì)影響到土壤線蟲群落的狀況，比如N和pH就會(huì)影響土壤線蟲的群落變化[36-37]。藏北草地本身就是一個(gè)獨(dú)特的生態(tài)系統(tǒng)類型，又具有獨(dú)特的氣候條件，該地區(qū)土壤線蟲對(duì)增溫的響應(yīng)，與其他地區(qū)相比必然有不同之處。這種不同還需系統(tǒng)深入的研究和討論。

通過高通量測(cè)序方法的分析，藏北高寒草甸土壤線蟲群落對(duì)增溫有一定的響應(yīng)。在土壤各層次中，OTC內(nèi)色矛綱線蟲的相對(duì)豐度都較OTC外小，OTC內(nèi)刺嘴綱線蟲都較OTC外大；OTC內(nèi)矛線目線蟲的相對(duì)豐度都較OTC外大，OTC內(nèi)墊刃目線蟲都較OTC外小。土壤理化指標(biāo)Cu2+、Zn2+、有機(jī)質(zhì)和pH與藏北草甸土壤綱水平線蟲群落相關(guān)性較大。其中，K+、Cu2+、含水率、有機(jī)質(zhì)與刺嘴綱有較強(qiáng)正相關(guān)性，pH、Zn2+、N與刺嘴綱呈負(fù)相關(guān)。K+、Cu2+、含水率、pH與色矛綱有較強(qiáng)正相關(guān)性，有機(jī)質(zhì)、Zn2+、N與色矛綱呈負(fù)相關(guān)。今后應(yīng)當(dāng)持續(xù)觀測(cè)藏北高寒草甸長(zhǎng)期增溫和不同增溫幅度下的土壤線蟲群落變化，增強(qiáng)高通量測(cè)序在藏北草地土壤環(huán)境研究中的應(yīng)用，以探究土壤環(huán)境的氣候變化適應(yīng)過程，為進(jìn)一步完善藏北草地生態(tài)系統(tǒng)研究及可持續(xù)管理提供理論支持。