刁翠茹，韓建強，張玉榮，張栓波，李祥，王浩，*

（1.食品營養(yǎng)與安全重點實驗室，天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457；2.河北玉橋食品有限公司，河北 石家莊 051500）

面條起源于我國漢代，至今已有4 000 多年的制作和食用歷史[1]。河北發(fā)酵宮面，始于唐，興于清，需要經(jīng)過20 h 自然發(fā)酵，16 道工藝加工而成，發(fā)酵后的面條易于消化吸收，散發(fā)酵面香氣，為河北傳統(tǒng)非遺食品。宮面發(fā)酵過程中，面團內(nèi)自然產(chǎn)生的一些有益菌，形成特殊風味和組織結構，因而比普通掛面更受歡迎。

面團的微生物菌群結構是影響面條品質(zhì)的一個重要因素之一，同時也是發(fā)酵宮面特征形成的主要影響因素。目前國內(nèi)已有研究對發(fā)酵饅頭、面包等面團微生物進行了部分分析，但是對發(fā)酵宮面的研究還較少，本文利用16S rDNA V4 區(qū)和18S rDNA V4 區(qū)對宮面面團進行分析，對傳統(tǒng)自然發(fā)酵面團中微生物菌群組成進行快速、深入的探索，同時對乳酸菌和酵母菌進行菌落分離鑒定，以期為實現(xiàn)發(fā)酵宮面的工業(yè)化生產(chǎn)提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

發(fā)酵宮面面團樣品：河北省石家莊市玉橋食品廠；MRS 培養(yǎng)基：青島高科技園海博生物技術有限公司；脫脂乳培養(yǎng)基及YPD 固體培養(yǎng)基：天津科技大學食品營養(yǎng)與安全重點實驗室配制。

1.2 儀器與設備

FA2004N 電子分析天平：上海精密科學儀器有限公司；DY04-13-44-00 高壓蒸汽滅菌鍋：（山海東亞壓力容器制造有限公司；SW-CJ-1FD 無菌操作臺：蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；YQX-Ⅱ厭氧培養(yǎng)箱：上海躍進醫(yī)療器械有限公司；DM750 電子顯微鏡：Leica。

1.3 方法

1.3.1 宮面面團宏基因組測序

以細菌基因組DNA 作為模板，采用16S rDNA 擴增子測序技術以16S rDNA V4 區(qū)分析宮面樣品中的細菌組成。以真菌基因組DNA 作為模板，采用18S rDNA擴增子測序技術以18S rDNA V4 區(qū)分析樣品中的真菌組成。測序工作由諾禾致源公司完成。

1.3.2 宮面面團微生物的培養(yǎng)與分離

準確稱取面團10.0 g，于90.0 mL 無菌生理鹽水中振蕩，并對菌懸液進行梯度稀釋。分別吸取各稀釋度菌液100 μL 于MRS 固體培養(yǎng)基和YPD 固體培養(yǎng)基進行平板涂布；MRS 固體培養(yǎng)基置于37℃厭氧培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)48 h，YPD 固體培養(yǎng)基置于28℃恒溫培養(yǎng)72 h，觀察菌落生長情況。將上述培養(yǎng)的乳酸菌進行平板劃線分離，分離出單菌落，進行革蘭氏染色，并顯微鏡觀察形態(tài)。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵面團中細菌分析

16S rDNA 擴增子測序，16S rDNA 擴增子測序技術已成為研究環(huán)境樣品中微生物群落組成結構的重要手段通常是選擇某個或某幾個變異區(qū)域，利用設計的引物進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增，然后對高變區(qū)進行測序分析和菌種鑒定[2-4]，門水平上微生物物種的相對豐度見圖1。

圖1 門水平上微生物物種的相對豐度Fig.1 Relative abundance of microbial species at phylum level

發(fā)酵面團樣品經(jīng)宏基因組16S rDNA V4 區(qū)分析，宮面面團中的微生物主要是變形菌門（Proteobacteria）和藍細菌門（Cyanobacteria），而厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和放線菌門（Actinobacteria）則占很小的比例。藍細菌門含有葉綠素β-胡蘿卜素等，普遍分布在土壤和淡水中。其他四大菌門與腸道微生物群相似，厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）占微生物群的90 %以上，其次是放線菌門（Actinobacteria）和變形菌門（Proteobacteria）[5]。

16S rDNA 測序得到屬于厚壁菌門（Firmicutes）乳桿菌目的乳酸菌種類見表1。

表1 乳酸菌種類Table 1 Types of lactic acid bacteria

由表1可知，5個不同科分別是：乳桿菌科（Lactobacillaceae）、鏈球菌科（Streptococcaceae）、明串珠菌科（Leuconostocaceae）、肉桿菌科（Carnobacteriaceae）和氣球菌科（Aerococcaceae）。6個不同的屬分別是：魏氏菌屬（Weissella）、乳酸菌屬（Lactobacillus）、乳球菌屬（Lactococcus）、鏈球菌屬（Streptococcus）、氣球菌屬（Aerococcus）和 Marinilactibacillus。7個不同種，它們分別是魏氏菌（Weissella）、發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）、棉子糖乳球菌（Lactococcus raffinolactis）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）、草綠色氣球菌（Aerococcus viridans）、Marinilactibacillus psychrotolerans，其中優(yōu)勢菌屬是發(fā)酵乳桿菌和魏氏菌，占乳酸菌的88.5%。另外，檢測到放線菌門（Actinobactteria）下雙歧桿菌目的雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）1 株。綜合已有文獻，發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）是3 株典型的益生菌。

在我國，不同地區(qū)的發(fā)酵面團細菌組成差別很大[6]：華中地區(qū)（如河南省）、華北地區(qū)（如山西?。┖臀鞅钡貐^(qū)（如甘肅?。﹥?yōu)勢菌為乳桿菌（Lactobacillus），次優(yōu)勢菌為明串珠菌屬（Leuconostoc）；華東地區(qū)（如安徽?。簝?yōu)勢菌為明串珠菌屬（Leuconostoc），次優(yōu)勢菌為乳球菌（Lactococcus）；東北地區(qū)（如黑龍江省）優(yōu)勢菌為乳桿菌（Lactobacillus），次優(yōu)勢菌為魏斯氏菌（Weissella）。在發(fā)酵面團中含有的有益菌多數(shù)為酵母菌和乳酸菌。目前，從酸面團分離出的乳酸菌大多數(shù)屬于乳桿菌（Lactobacillus），還包括明串株菌（Leuconostoc）、魏斯氏菌（Weissella）、片球菌（Pediococois）、乳球菌（Lactococcus）和鏈球菌（Streptococcus）屬的乳酸菌[7]。吳斯日古冷[8]應用16S rDNA 技術測定了內(nèi)蒙古西部地區(qū)的28 份酸面團樣品中的乳酸菌組成，鑒定出37 株植物乳桿菌（L.plantarum）、7 株融合魏斯氏菌（W.confusa）、3 株乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactococcus lactis subsp.lactis）和1 株發(fā)酵乳桿菌（L.fermentum）等。趙烜影等[9]通過應用16S rDNA V3 區(qū)測序分析了自然發(fā)酵黏豆包面團微生物菌群結構，鑒定出面團樣品中細菌組成主要為：食竇魏斯氏（Weissella cibaria）、融合魏斯氏菌（Weissella confuse）、腸系膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）和羅氏乳桿（Lactobacillus reuteri）等。張楚楚[10]對自然發(fā)酵面團中的細菌群落進行研究，通過16S 測序、聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳技術（polymerase chain reac tion-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）和傳統(tǒng)分離鑒定手段，發(fā)現(xiàn)面團中的細菌主要為乳桿菌屬、片球菌屬和魏斯氏菌屬，并測得在種水平上的發(fā)酵乳桿菌占總乳桿菌目的14%。

2.2 發(fā)酵面團中酵母菌分析

傳統(tǒng)的真菌分類鑒定主要是按照真菌的形態(tài)、生長以及生理生化等特征對真菌進行分類。采用傳統(tǒng)的方法對真菌進行正確的分類存在較大的困難。隨著分子生物學技術的發(fā)展，核酸序列分析已被廣泛的應用于真菌分類鑒定中，目前常用的技術為18S rDNA 測序[11-13]。發(fā)酵面團樣品經(jīng)宏基因組18S rDNA V4 區(qū)測定發(fā)現(xiàn)屬于真菌界酵母菌綱下的畢赤酵母科（Pichiaceae）、梅奇酵母科（Metschnikowiaceae）和 2個未分類的酵母科。檢測到3種水平的酵母，即異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）、熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）和東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）。檢測結果顯示異常威克漢姆酵母是真菌中的優(yōu)勢菌。具體菌群物種分類見圖2。

圖2 酵母菌菌種分類Fig.2 Classification of yeast strains

目前從面團中分理出來的酵母菌種類很少，主要是酵母菌屬和假絲酵母屬[14-15]，另外少孢酵母（Saccharomyces exiguus），東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis），畢赤酵母（Pichia anomaia）和霍氏假絲酵母（Candida holmii）等。目前研究發(fā)現(xiàn)，酸面團中大約含有20種酵母菌，其中包括最廣泛的釀酒酵母（S.cerevisiae），以及S.exiquus、小假絲酵母（C.humilis）和東方伊薩酵母（I.orientalis）[16]。宮面面團經(jīng)測序檢測到含有伊薩酵母屬（Issatchenki）、Wickerhamomycess 和假絲酵母屬（Candida）。吳斯日古冷[8]采用26S rDNA 序列分析法從酸面團樣品中分離出：釀酒酵母（S.cerevisiae）、小假絲酵母（C.humilis）、異常畢赤酵母（P.anomala）、海洋酵母（K.exigua）、畢赤酵母（P.kudriavzevii）和近平滑假絲酵母（C.parapsilosis）等。

Sofia 等[17]在坦桑尼亞一種名為togwa 的玉米粥中發(fā)現(xiàn)了東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）、畢赤酵母（Pichia anomaia）和假絲酵母（Candida glabrata）等，研究發(fā)現(xiàn)，這幾種酵母對togwa 粥的感官品質(zhì)有一定貢獻。Martin 等[18]對烏干達的一種粥中的微生物進行分離，研究發(fā)現(xiàn)有多種優(yōu)勢菌發(fā)揮作用，該微生物體系中包括東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis），此酵母分別對該粥的發(fā)酵及成熟起到重要作用。劉婷婷[19]在白云邊酒的發(fā)酵堆積料和出池酒醅中分離鑒定出東方伊薩酵母，檢測出有 4 株，分別為 Z1、Z2、Z3、FJ5。同時，在西班牙的紅葡萄中分離鑒定出具有產(chǎn)酯能力的東方伊薩酵母，此菌株對葡萄酒發(fā)酵起到一定的作用[20]。

異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）又稱異常畢赤酵母（Pichia anomala）或異常漢遜酵母（Hansenula anomala），Daniel 等研究發(fā)現(xiàn)，該種酵母在比利時的手工烘培食品中最常見[21]。劉建利等采用高通量測序技術對我國不同地區(qū)的面引子樣品進行檢測，結果顯示釀酒酵母和異常威克漢姆酵母為面引子中的優(yōu)勢菌群[22]。馬榕燦等研究了釀酒酵母與異常威克漢姆酵母對面團發(fā)酵特性的影響，結果顯示，異常威克漢姆酵母發(fā)酵面團產(chǎn)氣緩慢同時持續(xù)時間長，且發(fā)酵面團中存在較多的還原糖，更有利于面團發(fā)酵[23]。

在發(fā)酵宮面面團中，本研究檢測到東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）和異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus），推測其對宮面面團的發(fā)酵品質(zhì)特性有一定的貢獻。

2.3 乳酸菌分離及鑒定

乳酸菌經(jīng)選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)，分離得單菌落。經(jīng)革蘭氏染色分析，在40 倍顯微鏡下觀察染色結果為紫色，證明面團中的乳酸菌為革蘭氏陽性菌，同時觀察到平板上分別有桿菌和球菌。乳酸菌平板劃線分離和革蘭氏染色結果見圖3。

圖3 乳酸菌平板劃線分離和革蘭氏染色Fig.3 Lactobacillus planar lineation separation and gram staining

采用一代測序技術鑒定平板劃線分離得到的單菌，經(jīng)檢測確定為為發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）和乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）。

2.4 酵母菌分離及鑒定

酵母菌經(jīng)YPD 培養(yǎng)基，分離得到單菌落。酵母菌培養(yǎng)和平板劃線分離結果見圖4。

圖4 酵母菌培養(yǎng)和平板劃線分離Fig.4 Yeast culture and plate separation

經(jīng)26S rDNA 測序，并進行基因序列比較證明，酵母菌為異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）和東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）。

3 結論

本研究對河北玉橋發(fā)酵宮面面團微生物菌群組成進行探究，發(fā)現(xiàn)該面團中的優(yōu)勢菌群與華北地區(qū)面團中的優(yōu)勢菌群很相似。宮面面團中細菌菌群比酵母菌群種類更多，所占微生物體系的比例更大，其中乳酸菌屬Lactobacillus 和魏氏菌屬Weissella 是細菌菌群的優(yōu)勢菌屬；酵母菌群中異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）和東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）為優(yōu)勢菌群。在以后的生產(chǎn)中，可以通過純培養(yǎng)從發(fā)酵宮面面團中獲得相關有益菌株，以尋找發(fā)酵宮面的功能菌，為宮面品質(zhì)的改善提供支持。