崔夢君，折米娜，張振東，趙慧君，郭壯

（湖北文理學(xué)院食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院 鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，湖北 襄陽 441053）

作為黃酒釀造中的重要原料，麥曲中包含霉菌、酵母菌和細(xì)菌等微生物，由于微生物與生物環(huán)境的互生、共生、寄生和拮抗等關(guān)系，逐漸形成了一個(gè)復(fù)雜且具有多樣性的微生物區(qū)系，同時(shí)對黃酒風(fēng)味也起到了至關(guān)重要的作用[1-2]。譚婷婷等從北方黃酒麥曲中分離出5 株霉菌和1 株酵母菌，分別為多枝橫梗霉、米曲霉、廣紫青霉、雜色曲霉、交鏈孢霉和釀酒酵母[3]，曹玨等發(fā)現(xiàn)米根霉、微小毛霉、米曲霉和煙曲霉是紹興黃酒麥曲中的主要真菌[4]。目前關(guān)于黃酒發(fā)酵過程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化以及真菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了大量研究[5-7]，然而關(guān)于麥曲中細(xì)菌多樣性的研究卻鮮有報(bào)道。

變性梯度凝膠電泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）是一種能夠快速對環(huán)境中的微生物群落進(jìn)行評(píng)估的分子生物學(xué)技術(shù)[8]，被廣泛應(yīng)用于食醋[9]、泡菜[10]、香腸[11]、大醬[12]和黃酒[13]等發(fā)酵食品的微生物多樣性解析中。Illumina MiSeq 是一種高通量測序方法，可以以相對較低的成本產(chǎn)出大量序列，與其他二代高通量技術(shù)相比增加了微生物群落分析的測序深度，同時(shí)降低了試驗(yàn)成本，使其成為根據(jù)大規(guī)模標(biāo)記基因測序研究不同環(huán)境中微生物群落的新方法[14-15]，目前在農(nóng)業(yè)飼料[16]、發(fā)酵食品[17]和環(huán)境衛(wèi)生[18]微生物解析領(lǐng)域均有廣泛的應(yīng)用。

本研究以黃酒麥曲為研究對象，在提取樣品微生物宏基因組DNA 的基礎(chǔ)上，利用DGGE 與MiSeq 高通量測序技術(shù)相結(jié)合的手段對其細(xì)菌多樣性進(jìn)行評(píng)價(jià)，同時(shí)結(jié)合生物信息學(xué)手段對其微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，以期為后續(xù)麥曲中微生物資源的挖掘提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

熟麥曲：采集自浙江省麗水市，編號(hào)分別為MQ1、MQ2、MQ3 和 MQ4；三羥甲基氨基甲烷、乙酸、乙二胺四乙酸、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、去離子甲酰胺、尿素、過硫酸銨、四甲基乙二胺、乙醇、冰醋酸、甲醛、硝酸銀、氫氧化鈉：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；D5625-01 DNA 提取試劑盒、DNA marker、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）清潔試劑盒：京科博匯智生物科技發(fā)展有限公司；2PCR×mix：南京諾唯贊生物科技有限公司；rTaq、2'-脫氧核苷酸-5'-三磷酸混合物（dNTP MIX）、pMD18-T vector：大連寶生物技術(shù)有限公司；引物：武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司。

引物信息見表1。

表1 引物信息Table 1 The information of primers

VeritiTM96-well Thermal Cycler PCR 儀：美國AB公司；NanoDrop 2000：美國 Thermo Fisher 公司；DCodeTMSystem：美國 Bio-Rad 公司；DYY-12 電泳儀：北京六一儀器廠；MiSeq PE300 高通量測序平臺(tái)：美國Illumina 公司；R920 機(jī)架式服務(wù)器：美國DELL 公司；CT15RE 冷凍離心機(jī)：日本HITACHI 公司；Bio-5000 plus 掃描儀：上海中晶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品微生物宏基因組提取與檢測

采用D5625-01 試劑盒提取麥曲微生物宏基因組DNA，用0.8%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測并使用NanoDrop 測定濃度。

1.2.2 DGGE 電泳及優(yōu)勢條帶測序

將樣品總DNA 作為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR），采用細(xì)菌通用正向引物ALL-GC-V3F 和反向引物ALL-V3R 對樣品16S rDNA V3 區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增總體積為 25 μL，包括 10×PCR Buffer（含Mg2+）2.5 μL，dNTP 2 μL，正、反向引物各 0.5 μL，rTaq 0.5 μL，模板 1 μL，無菌超純水補(bǔ)至 25 μL。PCR 擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性 4 min，95℃變性 30 s，55℃退火30 s，72℃延伸 30 s，循環(huán) 30 次，最后 72℃終延伸10 min。所得擴(kuò)增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。使用Bio-Rad 公司Dcode 突變檢測系統(tǒng)對上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，采用8%的丙烯酰胺凝膠，變性梯度為35%～52%。DGGE 條件：恒溫 60℃，0.5 TAE 電泳緩沖液，上樣量 10 μL，電壓先 120 V，運(yùn)行 80 min，后電壓80 V，運(yùn)行780 min。電泳結(jié)束后，采用硝酸銀法染色，使用掃描儀將電泳圖進(jìn)行拍照，找出各樣品特征條帶并回收膠塊。用不帶GC 夾板的引物（ALL-V3F 和ALL-V3R）將回收膠塊再次進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。試劑盒純化PCR 產(chǎn)物并進(jìn)行載體連接和克隆培養(yǎng)，挑取陽性克隆子送往武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技進(jìn)行測序。

1.2.3 麥曲細(xì)菌16S rRNA PCR 擴(kuò)增及MiSeq 高通量測序

參考蔡宏宇等方法進(jìn)行樣品細(xì)菌16S rRNA PCR擴(kuò)增及MiSeq 高通量測序[19]。擴(kuò)增體系總體積為20 μL，包括 5×PCR 緩沖液 4 μL，dNTP mix 2 μL，帶有 7個(gè)核苷酸標(biāo)簽（barecode）的正向引物338F 和反向引物806R 各 0.8 μL，rTaq 酶 0.4 μL，模板 10 ng，無菌超純水補(bǔ)至 20 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性 3 min，95℃變性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 45 s，循環(huán) 30 次，72℃終延伸10 min。用1.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，寄至上海美吉生物醫(yī)藥科技進(jìn)行Illumina MiSeq PE300 平臺(tái)進(jìn)行高通量測序。

1.2.4 序列拼接及質(zhì)量控制

高通量測序數(shù)據(jù)成功下機(jī)后，參考董蘊(yùn)等方法對序列進(jìn)行質(zhì)控和拼接[20]：根據(jù)成對序列之間的重疊關(guān)系，將雙端序列拼接成一條序列并去除不合格序列，從而完成序列校正。利用QIIME 分析軟件，將相似度〉97%以上的序列歸類為一個(gè)操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU），從而確定各序列對應(yīng)微生物的分類學(xué)地位及相對含量，同時(shí)根據(jù)Chao 1 指數(shù)和Shannon指數(shù)對各樣品的微生物豐富度和多樣性進(jìn)行分析。本研究將在4個(gè)樣品中均存在的OTU 定義為核心OTU。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Origin 8.5 軟件對稀釋曲線及香農(nóng)指數(shù)曲線作圖，同時(shí)對麥曲樣品中優(yōu)勢細(xì)菌屬進(jìn)行柱狀圖的繪制。各特征條帶序列系統(tǒng)發(fā)育樹由Bio Edit 軟件和MEGA 7.0 軟件共同繪制。基于OTU 水平的Venn 圖由在線網(wǎng)站（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）進(jìn)行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 麥曲細(xì)菌DGGE電泳圖譜及條帶測序分析

本試驗(yàn)首先利用PCR-DGGE 技術(shù)對麥曲樣品中的細(xì)菌多樣性進(jìn)行了電泳分析，麥曲中細(xì)菌PCRDGGE 圖譜結(jié)果如圖1所示。

圖1 麥曲中細(xì)菌PCR-DGGE 圖譜Fig.1 PCR-DGGE analysis of bacteria in wheat Qu

由圖1可知，共有8個(gè)條帶在電泳圖中明顯表現(xiàn)出來。條帶 2、3、4、5、6 和 7 均存在于麥曲樣品中，而條帶1 僅存在于MQ4中，條帶8 存在于MQ1 和MQ4中，由此可知各樣品細(xì)菌組成存在差異。將各條帶切膠回收進(jìn)行PCR 擴(kuò)增、測序、比對及系統(tǒng)發(fā)育樹繪制，其結(jié)果如表2所示。

表2 麥曲DGGE 指紋圖譜中條帶比對結(jié)果Table 2 The blast results of bands in DGGE fingerprint of wheat Qu

由表2可知，條帶 1、2 和 3 分別與 Bacillus koreensis（韓國芽孢桿菌）、Weissella confusa（融合魏斯氏菌）和Staphylococcus gallinarum（雞葡萄球菌）相似度達(dá) 100%，條帶 4 和 5 與菌 Bacillus velezensis（貝萊斯芽孢桿）相似度達(dá)100%，同時(shí)條帶6 和7 與Pediococcus pentosaceus（戊糖片球菌）相似度達(dá)100%，而條帶8 與Lactobacillus alimentarius（食品乳桿菌）相似度為99%。系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。

圖2 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree

由圖2可知，系統(tǒng)發(fā)育樹被分為兩大分支，說明各分支上聚集的菌株與數(shù)據(jù)庫中的模式菌有較強(qiáng)的親緣關(guān)系。其中條帶 1、3、4 和 5 聚為一類，而條帶 2、6、7和8 聚為一類。在DGGE 指紋圖譜中不同條帶代表不同的細(xì)菌種類，體現(xiàn)了樣品微生物的豐富程度，條帶越亮或越粗表示其代表的種群生物量越大[21]。由此可見，麥曲中的細(xì)菌主要隸屬于Bacillus（芽孢桿菌）、Weissella（魏斯氏菌）和Pediococcus（片球菌）。薛景波利用16S rDNA 分子學(xué)方法對黃酒接種生麥曲發(fā)酵過程中微生物群落的變化研究發(fā)現(xiàn)Weissella confusa（融合魏斯氏菌）和Enterobacter cloacae（阿氏腸桿菌）的豐度較高，并被確定為優(yōu)勢細(xì)菌[22]。

2.2 序列豐富度及多樣性分析

本試驗(yàn)進(jìn)一步將各麥曲樣品進(jìn)行MiSeq 高通量測序，4個(gè)樣品共產(chǎn)生220 707 條序列。根據(jù)兩步UCLUST法對所有序列進(jìn)行分析，首先經(jīng)100%相似度進(jìn)行聚類，共得到73 688 條代表性序列，依據(jù)97%相似度聚類后得到5 726個(gè)OTU，平均每個(gè)樣品1 431個(gè)OTU。樣品16S rRNA 測序情況及各分類地位數(shù)量如表3所示。

表3 樣品16S rRNA 測序情況及各分類地位數(shù)量Table 3 16S rRNA read counts and the number of identifiable units on different taxonomical levels

由表3 亦可知，MQ1 樣品中細(xì)菌群落豐富度最大，而MQ2 樣品中細(xì)菌群落多樣性最高。稀釋曲線可以直接反映測序數(shù)據(jù)量的合理性，香農(nóng)曲線是用來衡量個(gè)樣品之間微生物群落的差異性[23]。本研究進(jìn)一步通過稀疏曲線和香農(nóng)指數(shù)曲線對測序深度是否滿足生物信息學(xué)分析進(jìn)行了評(píng)價(jià)，其結(jié)果如圖3所示。

圖3 稀疏曲線圖和香農(nóng)曲線圖Fig.3 Rarefaction curve and Shannon index curve

由圖3可知，隨著測序序列數(shù)的增加，雖然會(huì)有新的細(xì)菌種系型可能會(huì)被發(fā)現(xiàn)，但是微生物多樣性卻處于飽和狀態(tài)，由此可知上述測序量可以滿足生物信息學(xué)分析。

2.3 基于不同分類學(xué)地位細(xì)菌群落相對含量分析

納入本研究的4個(gè)麥曲樣品，共產(chǎn)生220 707 條序列，通過同源性比對將其鑒定為12個(gè)門、29個(gè)綱、49個(gè)目、96個(gè)科和170個(gè)屬，只有0.94%和5.64%的序列不能鑒定到門和屬水平。在門水平上，F(xiàn)irmicutes（硬壁菌門）、Proteobacteria（變形菌門）和Actinobacteria（放線菌門）為優(yōu)勢細(xì)菌門，其中Firmicutes（硬壁菌門）平均相對含量最高，而Actinobacteria（放線菌門）平均相對含量最低，分別為87.97%和0.94%，由此可知隸屬于Firmicutes（硬壁菌門）的細(xì)菌為麥曲樣品中的優(yōu)勢細(xì)菌。同時(shí)各樣品中硬Firmicutes（壁菌門）相對含量分別為 88.13%、89.13%、90.04 和 84.48%，Proteobacteria（變形菌門）相對含量分別為9.17%、8.93%、7.18%和10.72 %，而Actinobacteria（放線菌門）相對含量為1.13%、0.57%、1.34%和1.58%，由此可知雖然上述各細(xì)菌門均存在于各樣品中，但是相對含量卻存在差異性。本研究進(jìn)一步將相對含量〉1%的細(xì)菌屬進(jìn)行分析，結(jié)果如圖4所示。

圖4 麥曲樣品中優(yōu)勢細(xì)菌門相對含量分析Fig.4 Analysis of relative abundance of dominant bacterial in wheat Qu samples at the phylum level

由圖4可知，優(yōu)勢細(xì)菌屬分別為Bacillus（芽孢桿菌屬）、Weissella（魏斯氏屬）、Staphylococcus（葡萄球菌）、Klebsiella（克雷伯菌屬）、Pantoea（泛菌屬）和Lactobacillus（乳桿菌屬），其平均相對含量分別為70.70%、8.55 %、2.67 %、2.29 %、1.32 %和 1.07 %。利用 Illumina MiSeq 測序平臺(tái)，劉蕓雅對紹興黃酒麥曲及黃酒發(fā)酵過程中細(xì)菌多樣性進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)麥曲中優(yōu)勢菌為Bacillus（芽孢桿菌屬）和Saccharomyces（糖多孢菌屬），同時(shí)Bacillus（芽孢桿菌屬）、Staphylococcus（葡萄球菌屬）和Lactobacillus（乳桿菌屬）為黃酒發(fā)酵過程中的優(yōu)勢細(xì)菌屬[24]。利用傳統(tǒng)微生物學(xué)方法，張中華對熟麥曲中的細(xì)菌進(jìn)行了培養(yǎng)、分離和鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn) Bacillus（芽孢桿菌屬）、Staphylococcus（葡萄球菌屬）和Pantoea（泛菌屬）細(xì)菌存在于熟麥曲中[25]。任清通過純培養(yǎng)和分子生物學(xué)方法對北宗黃酒麥曲中的細(xì)菌進(jìn)行鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Bacillus（芽孢桿菌屬）為麥曲中的優(yōu)勢細(xì)菌[26]，該報(bào)道與本研究結(jié)論一致。

本研究進(jìn)一步將每個(gè)樣品中的OTU 數(shù)量及序列進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如圖5所示。

圖5 基于OTU 水平的Venn 圖Fig.5 Venn diagram based on OTU level

由圖5可知，4個(gè)樣品中共發(fā)現(xiàn)5 726個(gè)OTU，而僅存在1個(gè)樣品中的OTU 為3 992個(gè)，占OTU 總數(shù)的69.72%，序列數(shù)為5 869 條。同時(shí)出現(xiàn)2 次和3 次的OTU 分別為808個(gè)和479個(gè)，分別占 OTU 總數(shù)的14.11%和8.37%，包含序列數(shù)分別為6 230 條和9 852條。值得一提的是在4個(gè)樣品中共發(fā)現(xiàn)447個(gè)核心OTU，占OTU 總數(shù)的7.80%，包含197 709 條序列。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在核心OTU中有7個(gè)OTU 的平均相對含量〉1%，結(jié)果如圖6所示。

圖6 平均相對含量＞1%核心OTU 比較分析Fig.6 Comparative analysis of average relative abundance more than 1%of core OTU

由圖6可知，平均相對含量〉1%的核心OTU 分別為OTU4624、OTU4700、OTU3693、OTU2795、OTU32、OTU1726 和OTU1950，其平均相對含量分別為54.44%、1.97%、2.78%、1.99%、1.10%、2.56%和1.03%。進(jìn)一步將上述7個(gè)核心OTU 序列進(jìn)行Blast 比對發(fā)現(xiàn)OTU4624、OTU2795 和 OTU3693 隸屬于 Bacillus（芽孢桿菌屬），OTU4700 和 OTU1950 隸屬于 Weissella（魏斯氏屬），而OTU 隸屬于Staphylococcus（葡萄球菌屬）。

3 結(jié)論

本研究以麥曲為研究對象，采用PCR-DGGE 與MiSeq 高通量測序技術(shù)相結(jié)合的手段對其細(xì)菌多樣性進(jìn)行評(píng)價(jià)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，麥曲中的細(xì)菌組成具有較高的多樣性，主要為硬壁菌門、變形菌門和放線菌門，其中隸屬于硬壁菌門的芽孢桿菌屬與魏斯氏屬是為優(yōu)勢菌屬。通過本試驗(yàn)的開展，為后續(xù)麥曲中微生物資源的挖掘提供了理論支持。