音猬因子是胚胎發(fā)育過(guò)程中脊索產(chǎn)生的一種神經(jīng)調(diào)控因子，其對(duì)神經(jīng)管腹側(cè)結(jié)構(gòu)的形成、發(fā)育與分化有所影響[1]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，音猬因子在神經(jīng)軸突損傷后修復(fù)和再生過(guò)程中有活躍表現(xiàn)，并且在很多神經(jīng)性疾病中音猬因子信號(hào)也有重要作用，有實(shí)驗(yàn)證實(shí)音猬因子信號(hào)可以對(duì)瀕死的神經(jīng)元具有顯著的營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)作用來(lái)延緩神經(jīng)元壞死等[2-3]。為進(jìn)一步探討音猬因子表達(dá)和神經(jīng)損傷以及神經(jīng)發(fā)育的關(guān)聯(lián)性展開(kāi)本組研究。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源：從實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)大鼠中選取30只符合納入標(biāo)準(zhǔn)的成年大鼠為研究對(duì)象，均為常規(guī)環(huán)境下飼養(yǎng)的健康大鼠。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)：①均為成年健康大鼠，體質(zhì)量220～250 g。②雌雄不限。

1.3 處理方法：將30只大鼠分為兩組，其中5只僅咬除椎板作為空白組，其余25只制作脊髓損傷模型。造模方法：25只大鼠按照標(biāo)準(zhǔn)0.3 mL/100 g腹部注射10%水合氯醛；參考Allen's打擊法進(jìn)行脊髓損傷模型制作，麻醉完成后大鼠取俯臥位并固定四肢，影像學(xué)設(shè)備輔助下確定大鼠脊髓T10節(jié)段，做縱向切口，使皮下組織、筋膜、肌肉、棘突暴露，使用咬骨鉗咬除T10節(jié)段對(duì)應(yīng)棘突和椎板，并制作圓形骨窗，使脊髓硬膜囊暴露。使用墊片覆蓋T10脊髓，從25 mm高度自由落下重10 g克氏針對(duì)脊髓進(jìn)行沖擊，形成損傷。觀察到對(duì)應(yīng)部位出現(xiàn)充血、水腫且下肢迅速回縮、尾巴翹起、大鼠迅速倒下時(shí)則可認(rèn)定為脊髓損傷模型制作完成。

1.4 行為學(xué)評(píng)估：分別于模型制作完成后第1、3、5、7、14天時(shí)取5只大鼠進(jìn)行行為學(xué)評(píng)估。主要觀察項(xiàng)目為大鼠脊髓損傷后不同時(shí)間點(diǎn)肢體功能恢復(fù)情況，以此為依據(jù)評(píng)估脊髓神經(jīng)功能恢復(fù)情況。采用BBB評(píng)分和斜板試驗(yàn)進(jìn)行行為評(píng)估，斜板試驗(yàn)為使大鼠身體軸線和斜板縱軸垂直后不斷調(diào)整斜板坡度，以大鼠能夠在斜板上停留5 s的最大坡度為其肢體功能評(píng)分。

1.5 音猬因子檢測(cè)方法：使用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)音猬因子表達(dá)，顯微鏡下檢測(cè)脊髓組織免疫組化染色后音猬因子的表達(dá)。音猬因子mRNA檢測(cè)及半定量采用原位雜交技術(shù)。利用高清晰彩色病理圖像分析系統(tǒng)對(duì)音猬因子表達(dá)進(jìn)行圖像分析，選取視野內(nèi)陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞并進(jìn)行半定量分析。根據(jù)原位雜交信號(hào)強(qiáng)度和分布情況確定4個(gè)等級(jí)，分別為無(wú)信號(hào)（-）、低信號(hào)（+）、中等信號(hào)（++）、高信號(hào)（+++）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：使用SPSS14.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，經(jīng)t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 行為學(xué)評(píng)估：脊髓損傷模型下的5只大鼠出現(xiàn)不同程度的后肢力量減弱、行走緩慢、步態(tài)異常，與空白組比較存在差異，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 模型制作完成后第1、3、5、7、14天進(jìn)行行為學(xué)評(píng)估結(jié)果（

表1 模型制作完成后第1、3、5、7、14天進(jìn)行行為學(xué)評(píng)估結(jié)果（

脊髓損傷組斜板試驗(yàn)評(píng)分脊髓損傷第1天 21 1.1±0.2 65.0±4.1 32.1±3.5脊髓損傷第3天 21 2.1±0.3 65.1±3.6 34.3±3.6脊髓損傷第5天 21 2.6±0.4 65.3±3.2 36.2±3.9脊髓損傷第7天 21 3.2±0.5 65.7±3.9 38.8±4.2脊髓損傷第14天 21 6.1±0.7 65.8±3.8 42.9±4.5組別 空白組BBB評(píng)分脊髓損傷組BBB評(píng)分空白組斜板試驗(yàn)評(píng)分

根據(jù)表中統(tǒng)計(jì)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，空白組大鼠BBB評(píng)分和斜板試驗(yàn)評(píng)分隨時(shí)間推移整體變化值較小，而脊髓損傷模型大鼠的對(duì)應(yīng)評(píng)分則隨著時(shí)間推移不斷改善，這提示隨著時(shí)間的推移脊髓損傷模型下的成年大鼠脊髓功能逐漸恢復(fù)。

2.2 音猬因子表達(dá)檢測(cè)結(jié)果：通過(guò)免疫組化檢查，脊髓損傷模型后第3天觀察到音猬因子蛋白開(kāi)始表達(dá)。脊髓損傷模型制作第1天后，取5只成年大鼠進(jìn)行音猬因子mRNA檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)可見(jiàn)音猬因子表達(dá)低信號(hào)，范圍較為局限，僅在脊髓灰質(zhì)區(qū)域內(nèi)，白質(zhì)區(qū)域內(nèi)未檢測(cè)到音猬因子mRNA，表達(dá)信號(hào)為-。脊髓損傷模型制作第3天后，取5只成年大鼠進(jìn)行音猬因子mRNA檢測(cè)，可同時(shí)檢測(cè)到音猬因子表達(dá)中等信號(hào)和低信號(hào)。損傷區(qū)內(nèi)音猬因子表達(dá)為中等信號(hào)，損傷區(qū)遠(yuǎn)端10 mm處音猬因子表達(dá)為低信號(hào)。隨后在脊髓損傷模型制作后的第7天，音猬因子mRNA表達(dá)水平在損傷區(qū)遠(yuǎn)端10 mm處的灰質(zhì)和白質(zhì)中表達(dá)達(dá)到最大值，可見(jiàn)高信號(hào)，通過(guò)染色后鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)在少突膠質(zhì)細(xì)胞中音猬因子表達(dá)水平最高，室管膜區(qū)域內(nèi)音猬因子mRNA表達(dá)僅存在于損傷區(qū)域的5 mm范圍內(nèi)，分布區(qū)域較小。而在空白組的5只大鼠中，全時(shí)間段均未見(jiàn)到音猬因子mRNA表達(dá)。同時(shí)在免疫組化檢測(cè)中，僅少突膠質(zhì)細(xì)胞中存在音猬因子表達(dá)，而星形膠質(zhì)細(xì)胞中則未見(jiàn)音猬因子表達(dá)。

3 討 論

根據(jù)相關(guān)研究報(bào)道[4-5]，可以確定音猬因子是脊髓腹側(cè)神經(jīng)干細(xì)胞分化過(guò)程中的活躍成分，從某種意義上來(lái)說(shuō)音猬因子決定了胚胎期神經(jīng)細(xì)胞的增殖和分化方向，是神經(jīng)系統(tǒng)再生的重要元素[6]。

在本組研究中，共準(zhǔn)備了30只成年健康大鼠為研究樣本，共制作了5只空白組和25只脊髓損傷模型組，同時(shí)從行為學(xué)評(píng)估、免疫組化和音猬因子mRNA檢測(cè)3個(gè)方面對(duì)空白組和脊髓損傷模型組進(jìn)行評(píng)價(jià)。得到以下結(jié)論：①隨著時(shí)間的推移，音猬因子表達(dá)強(qiáng)度由低到高，與大鼠肢體功能恢復(fù)周期相吻合。②音猬因子表達(dá)的最高信號(hào)在損傷區(qū)域內(nèi)遠(yuǎn)端10 mm和少突膠質(zhì)細(xì)胞中，星形膠質(zhì)細(xì)胞中未見(jiàn)音猬因子表達(dá)。③音猬因子表達(dá)并非脊髓損傷后立即出現(xiàn)，從出現(xiàn)到達(dá)到高信號(hào)有一定時(shí)間差。

因此綜上所述，音猬因子表達(dá)和脊髓神經(jīng)功能再生有密切聯(lián)系，極有可能與神經(jīng)再生有關(guān)，如果想要完全確認(rèn)音猬因子和脊髓損傷后神經(jīng)功能再生的關(guān)聯(lián)性，需要進(jìn)一步研究，但不可否認(rèn)脊髓損傷是激活音猬因子表達(dá)的重要條件。