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1.云南中醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650100；2.昆藥集團(tuán)股份有限公司，云南 昆明 650100

大孔樹脂[1]是一種不帶離子交換基團(tuán)的多孔性高分子材料, 具備較高的比表面積和多孔性 ,通過有選擇性的物理吸附從植物提取液中提取有效成分。大孔樹脂內(nèi)部是具有三維網(wǎng)狀立體空間孔結(jié)構(gòu)的有機(jī)高分子聚合物[2-4]，通過相互交聯(lián)聚合反應(yīng)，制備形成的有機(jī)多孔骨架吸附材料[5]。在工業(yè)生產(chǎn)中以大孔吸附樹脂為吸附劑，使用適宜的吸附和解吸條件對(duì)不同成分進(jìn)行選擇性吸附、篩選，從而達(dá)到分離、純化某一種或一類有機(jī)化合物[6]。相比傳統(tǒng)的硅膠色譜，大孔吸附樹脂具有良好的選擇性和吸附性、解吸和再生工藝條件溫和、成本低、使用壽命長(zhǎng)、可反復(fù)使用等諸多優(yōu)點(diǎn)[7-13]。因而，這種高效方便的分離技術(shù)在許多領(lǐng)域都顯示出它獨(dú)特的效果，特別是天然藥物分離活性成分方面，主要用于植物活性成分的分離純化。

通常情況下，大孔樹脂在重復(fù)多次使用后，會(huì)因吸附物質(zhì)的增加使柱效降低，引起樹脂中毒，因此需要以酸堿強(qiáng)化再生[14-15]。對(duì)于D 101大孔吸附樹脂再生工藝已有部分研究，但對(duì)于 ADS-7 大孔樹脂的再生工藝研究還未見報(bào)道，并且到目前為止，還沒有一種簡(jiǎn)單、便捷、成本低、環(huán)境污染少且能完全恢復(fù)樹脂吸附脫附性能的方法[16]。故本實(shí)驗(yàn)在已有的曲札茋苷純化工藝基礎(chǔ)上，進(jìn)一步優(yōu)化D 101 型大孔樹脂(非極性)和 ADS-7 型大孔樹脂(中極性)的再生方法，為后續(xù)生產(chǎn)研究提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)試劑、試藥與儀器

R-220 SE 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Buchi)；低溫冷卻液循環(huán)泵(DLSB-30L / 20)；美國(guó)戴安 U 3000 型高效液相色譜儀；梅特勒 XP-205 型分析天平。拉薩大黃藥材(批號(hào)：20131217)購(gòu)自西藏墨竹工卡縣，由中科院昆明植物所劉恩德鑒定為蓼科植物拉薩大黃(Rheum lhasaense A.J.Li et P.K.Hsiao)；乙醇為分析純；甲醇、乙腈均為色譜純(德國(guó)默克公司)；D101 型大孔樹脂、ADS-7 型大孔樹脂(滄州寶恩吸附材料科技有限公司)；全部實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

2 方法

2.1 色譜條件 COSMOSIL packed column(4.6 I.D.×250 mm)；檢測(cè)波長(zhǎng)：319 nm；流速：1.0 mL/min；以0.1 % 乙腈為流動(dòng)相A，0.1%磷酸水為流動(dòng)相B；梯度洗脫；取10 μL，注入液相色譜儀。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取曲札茋苷約20 mg，置100 mL 量瓶中，加75% 甲醇溶液溶解并定量稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液；分別精密吸取該貯備液加75% 甲醇溶液稀釋至刻度，配制濃度為200 μg/mL、100 μg/mL、60 μg/mL、40 μg/mL、20 μg/mL、10 μg/mL、6 μg/mL、4 μg/mL的曲札茋苷溶液，搖勻，分別取10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。將峰面積(A)對(duì)曲札茋苷濃度(C)作線性回歸，得回歸方程為：A=9647.2C-7050.8，R2=0.999。表明曲札茋苷在4～200 ug/mL范圍內(nèi)峰面積與濃度線性關(guān)系良好。

2.2.2 精密度試驗(yàn) 分別配置不同濃度(200、100、40 μg/mL)的曲札茋苷溶液，按上述色譜條件測(cè)定6 次，記錄峰面積，RSD分別為0.53%、0.62% 、0.29%，均小于 2%。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取曲札茋苷適量，置于容量瓶中，加75% 甲醇溶解，配置成濃度為40 ug/mL，搖勻。在0、2、4、8、12、24 hr分別取10 uL，注入液相色譜儀，記錄主峰面積，RSD為0.47 %，小于2 %。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 大孔樹脂上樣液的制備

2.1.1 D101 大孔吸附樹脂上樣液 取 200 g 藥材于 3 L 圓底燒瓶中，加95%乙醇 1.6 L ，熱回流提取2 h，共提取3次，合并濾液。將濾液回收至流浸膏，加 200 mL水靜置 24 h，取上清即為 D101 大孔樹脂上樣液。

2.1.2 ADS-7 大孔吸附樹脂上樣液 取 400 mL的D101樹脂裝柱，使其徑高比為 1∶8，取 100 mL上樣液以1 BV / h 的流速上樣，靜置2 h，之后以4 BV / h 的流速用水洗脫4 BV，繼用 25% 乙醇洗脫6 BV，收集第 2～6 BV洗脫液，將洗脫液濃縮至無醇即為 ADS-7 大孔樹脂的上樣液。

2.2 樹脂的再生

2.2.1 正交試驗(yàn)優(yōu)化樹脂再生條件 樹脂再生方法：在容器內(nèi)加入高于樹脂層10 cm的2%～3%HCl溶液浸泡2～4 h，然后用3倍于樹脂體積的HCl溶液通柱，并用凈水洗至pH值接近中性；繼用5% NaOH溶液浸洗2～4 h，并同上法用3倍于樹脂體積的5% NaOH溶液通柱，且用凈水洗至pH值為中性，最后用2～3倍樹脂體積的乙醇洗柱，再純水洗去乙醇。乙醇洗脫倍數(shù)則進(jìn)行單因素考察,分別用 95 % 乙醇洗脫 2、3 BV，通過對(duì)比樹脂吸附量進(jìn)行最佳洗脫倍數(shù)的篩選。

根據(jù)上述方法，本試驗(yàn)將進(jìn)一步對(duì) HCl 溶液濃度(A)、HCl 溶液浸泡時(shí)間(B)、NaOH溶液濃度(C)、NaOH 溶液浸泡時(shí)間(D)4 個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化篩選，每個(gè)因素選擇 3 個(gè)水平進(jìn)行 L9(34)正交設(shè)計(jì)，結(jié)果見下表 1。

表1 樹脂再生工藝因素水平

以樹脂處理后大孔樹脂的靜態(tài)吸附量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，來篩選 D101 型及 ADS-7 型大孔樹脂再生的工藝條件。具體方法為：分別取 5 mL 樹脂于燒杯中(新樹脂作為對(duì)照)，倒入 10 mL的上樣液，室溫下放置 24 h，抽取上清液進(jìn)行 HPLC 檢測(cè)；取 5 mL 再生后的 ADS-7樹脂于燒杯中(新樹脂作為對(duì)照)，倒入 50 mL 的上樣液，室溫下放置 24 小時(shí)，抽取上清液進(jìn)行 HPLC 檢測(cè)，并對(duì)曲札茋苷吸附量進(jìn)行計(jì)算。

3 結(jié)果

3.1 D101樹脂再生試驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 正交試驗(yàn)結(jié)果 采用L9(34)正交試驗(yàn)進(jìn)行正交試驗(yàn)篩選，結(jié)果見表2，并對(duì)大孔樹脂的吸附量進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。通過極差R分析顯示，影響樹脂對(duì)曲札茋苷吸附量的因素依次為D>A>C>B，四個(gè)影響因素?zé)o顯著性意義，以A2B1C1D1為佳，即用3%鹽酸溶液浸泡2 h，2 % 氫氧化鈉浸泡2 h。

表2 D101大孔樹脂再生正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 D101大孔樹脂吸附量方差分析表

注：F0.05(2,2)=19,P<0.05。

3.1.2 乙醇洗脫倍數(shù)考察結(jié)果 在上述酸堿處理的基礎(chǔ)之上，優(yōu)化D101 樹脂的乙醇洗脫體積，試驗(yàn)結(jié)果見表4。乙醇沖洗2 BV即可將樹脂中殘留的大量有機(jī)物沖出，因此選擇乙醇洗脫2 BV即可。

綜上所述，D101樹脂的最佳再生工藝為：在容器內(nèi)加入高于樹脂層10 cm的3%HCl溶液浸泡2 h，然后用3倍于樹脂體積的3%HCl溶液通柱，并用凈水洗至pH值接近中性；繼用2% NaOH溶液浸洗2 h，并同上法用3倍于樹脂體積的2%NaOH溶液通柱，且用凈水洗至pH值為中性，最后用2倍樹脂體積的95%乙醇洗柱，再純水洗去乙醇，即可。

表4 D101大孔樹脂乙醇洗脫倍數(shù)考察表

3.2 ADS-7樹脂再生試驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果 用 L9(34)正交表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選，試驗(yàn)結(jié)果見表5，并對(duì)大孔樹脂的吸附量進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表6。通過極差R分析顯示，影響ADS-7樹脂對(duì)曲札茋苷吸附量的因素依次為B>A>D>C，四個(gè)影響因素?zé)o顯著性意義，以A3B3C3D1為佳，即用5%鹽酸溶液浸泡4 h，用5%氫氧化鈉溶液浸泡2 h。

表5 D101大孔樹脂再生正交試驗(yàn)結(jié)果

表6 ADS-7大孔樹脂吸附量方差分析表

注：F0.05(2,2)=19,P<0.05。

3.2.2 乙醇洗脫倍數(shù)考察結(jié)果 在上述酸堿處理的基礎(chǔ)之上，優(yōu)化ADS-7 樹脂的乙醇洗脫體積，試驗(yàn)結(jié)果見表7。乙醇沖洗2 BV即可將樹脂中殘留的大量有機(jī)物沖出，因此選擇乙醇洗脫2 BV即可。

表7 ADS-7大空樹脂乙醇洗脫倍數(shù)考察表

綜上所述，ADS-7 樹脂的最佳再生工藝為：在容器內(nèi)加入高于樹脂層10 cm的5% HCl溶液浸泡4 h，然后用3倍于樹脂體積的5%HCl溶液通柱，并用凈水洗至pH 值接近中性；繼用5% NaOH溶液浸洗2 h，并同上法用3倍于樹脂體積的5 % NaOH溶液通柱，且用凈水洗至pH 值為中性，最后用2倍樹脂體積的95% 乙醇洗柱，再純水洗去乙醇，即可。

3.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 為進(jìn)一步驗(yàn)證再生工藝的可行性，分別另取3份樹脂，每份200 mL，按優(yōu)化工藝進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果見表8。

表8 驗(yàn)證結(jié)果

4 討論

本次實(shí)驗(yàn)通過樹脂靜態(tài)吸附法，以曲札茋苷量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用 HPLC 測(cè)定曲札茋苷的含量，對(duì) D101 和 ADS-7 兩種大孔樹脂再生工藝條件進(jìn)行正交試驗(yàn)篩選，和大孔樹脂再生工藝條件中乙醇洗脫倍數(shù)的單因素考察，從而得到 D101 型大孔樹脂的最佳再生工藝和 ADS-7 型大孔樹脂的最佳再生工藝。通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，該再生工藝簡(jiǎn)單，成本低，且重復(fù)性好，有效的提高了樹脂的使用次數(shù)，延長(zhǎng)了樹脂使用壽命，為大孔樹脂再生工藝的提供了有效的參考數(shù)據(jù)，可進(jìn)一步應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)中。