鄧秀玲 扈瑞平 李 薇 張建宇 武瑞兵 葉書梅 王海生

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110

在我國(guó)胃癌的發(fā)病率居各種惡性腫瘤的第二位，其異質(zhì)性強(qiáng)，預(yù)后較差。目前對(duì)于胃癌的治療主要采用手術(shù)、化療和放療三大手段，臨床上常用的化療和放療藥物，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也給人體帶來不同程度地?fù)p傷或不良反應(yīng)[1]。臨床實(shí)踐表明，蒙藥在抗腫瘤方面有一定的優(yōu)勢(shì)，如藥理作用廣泛，不良反應(yīng)小，不易產(chǎn)生耐藥性等[2]。

蒙藥壯西-21(以下簡(jiǎn)稱壯西)是由寒水石等二十一味藥物組成的復(fù)方藥，臨床主要用于治療消化性潰瘍、慢性胃炎、胃癌等消化系統(tǒng)疾病[3-5]。壯西抗腫瘤作用主要來自臨床實(shí)踐中，雖然療效確切，但無進(jìn)一步研究，特別是鮮見有從細(xì)胞、分子水平研究其作用機(jī)制的報(bào)道。本研究以體外培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞為對(duì)象，觀察復(fù)方蒙藥壯西對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器 蒙藥壯西(內(nèi)蒙古國(guó)際蒙醫(yī)院)，用PBS配成50 mg/mL貯液，過濾除菌4 ℃保存?zhèn)溆茫瑢?shí)驗(yàn)時(shí)用培養(yǎng)液稀釋到所需濃度。胃癌MGC-803細(xì)胞(北京腫瘤研究所提供)，培養(yǎng)基DMEM(Gibco公司)，胎牛血清(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所)，紫杉醇(四川太極制藥有限公司)，Hochest33342、碘化丙啶(PI)、塞唑藍(lán)(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)(Sigama公司)。酶標(biāo)儀(日本550型)，CO2恒溫孵育箱(美國(guó)NAPCO)，熒光顯微鏡(日本，NIKON)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將胃癌MGC-803細(xì)胞置于含10%胎牛血清、80 u/mL慶大霉素的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)于37℃含5%濕飽和CO2溫箱中，常規(guī)傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞的活力實(shí)驗(yàn) MTT法，將培養(yǎng)的細(xì)胞調(diào)整濃度為3×104個(gè)/mL，接種于96孔板上，每孔0.2 mL，培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)液，分別加入蒙藥壯西，使終濃度分別為：2.5、1.25、0.63、0.31、0.15 mg/mL。另設(shè)陰性對(duì)照組(不加藥)、空白對(duì)照組(無細(xì)胞和藥)、陽(yáng)性對(duì)照組(紫杉醇處理組)其作用終濃度為10-6mol/L，各組設(shè)8個(gè)復(fù)孔。以上各組總體積均為200 μL。培養(yǎng)72 h，每孔加入20 μL 5%MTT，37 ℃溫育4 h，棄培養(yǎng)液加DMSO200 μL，振蕩10 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm處吸光度OD值。按公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。

抑制率=(對(duì)照組平均OD值-實(shí)驗(yàn)組平均OD值)/(對(duì)照組平均OD值-空白組平均OD值)×100%

1.4 細(xì)胞形態(tài)觀察：壯西作用細(xì)胞48 h后，采用熒光雙染法觀察細(xì)胞形態(tài)變化。取1×106個(gè)細(xì)胞離心，經(jīng)PBS洗滌2次，重懸于200 μL PBS中，分別加25 μL熒光染料Hoechst 33342和PI。37 ℃溫育8～10 min，離心洗滌后滴片，于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)改變。

2 結(jié)果

2.1 壯西對(duì)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用 壯西對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞的增殖有一定的抑制作用，其生長(zhǎng)抑制率隨濃度的增加而升高，呈現(xiàn)濃度依賴性趨勢(shì)。壯西對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的最高抑制率達(dá)84.87%，高于陽(yáng)性對(duì)照組紫杉醇的抑制率，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 壯西對(duì)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

2.2 壯西對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響 倒置光顯微鏡下觀察到,正常培養(yǎng)的對(duì)照組細(xì)胞呈梭形貼壁生長(zhǎng)，大小均勻，核圓居中，胞質(zhì)清亮透明。2.5 mg/mL蒙藥處理組作用48 h后，部分細(xì)胞失去正常生長(zhǎng)形態(tài)，細(xì)胞變小變圓，胞質(zhì)亮度下降,胞膜皺縮、內(nèi)陷；隨著時(shí)間推移，細(xì)胞形狀不規(guī)則，最后破碎壞死。熒光鏡下可見，對(duì)照組細(xì)胞被Hoechst 33342染色后，發(fā)出均勻的藍(lán)色熒光，大小一致,提示為正?；罴?xì)胞；2.5 mg/mL處理組部分細(xì)胞的細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)濃染致密的顆粒狀或塊狀熒光，提示為細(xì)胞染色質(zhì)凝集、核固縮或核碎裂，為凋亡細(xì)胞的形態(tài)改變。此外，鏡下見壞死細(xì)胞被PI紅染。如圖1所示。

3 討論

細(xì)胞異常增殖和分化與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，腫瘤治療的一個(gè)基本問題是如何抑制腫瘤細(xì)胞的無限增殖能力。蒙藥壯西-21，漢名為寒水石二十一味散，由寒水石、蓽撥、訶子、石榴、瞿麥、沙棘、五靈脂、砂仁、紫花地丁、木鱉子、人工牛黃、連翹、木香、降香、麥冬等二十一味藥物組成,其藥理作用是調(diào)體內(nèi)“赫依”“希拉”“巴達(dá)干”三根，具有保護(hù)消化道黏膜、抑制胃酸分泌的作用。組方中寒水石、蓽撥、五靈脂均具有抗腫瘤的作用[6]，但單體成分或提取物并不能反映蒙藥復(fù)方的廣泛藥理作用及蒙醫(yī)理論，而且蒙藥的臨床應(yīng)用主要以復(fù)方制劑為主。為從細(xì)胞水平揭示蒙藥壯西的抗腫瘤作用，本實(shí)驗(yàn)以體外培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞為對(duì)象，觀察復(fù)方蒙藥壯西對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。

MTT法是目前檢測(cè)藥物在體外對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷作用常用的方法之一，其原理是利用活細(xì)胞特別是增殖細(xì)胞內(nèi)將MTT氧化為藍(lán)紫色甲臜晶體，沉積于細(xì)胞內(nèi)，通過酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度，了解細(xì)胞的存活情況，而死細(xì)胞則不能氧化MTT。本實(shí)驗(yàn)通過MTT法觀察不同濃度的蒙藥壯西組對(duì)人胃癌細(xì)胞MGC-803生長(zhǎng)的影響，結(jié)果表明壯西在體外能顯著抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，尤以高濃度組的抑制率最高，且抑制作用隨藥物濃度的增加而增強(qiáng)，呈現(xiàn)劑量依賴的趨勢(shì)。2.5 mg/mL藥物處理后對(duì)細(xì)胞的抑制率超過了紫杉醇組的抑制率。倒置光顯微鏡下見，蒙藥作用后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯的改變。采用熒光雙染法對(duì)胃癌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化進(jìn)行進(jìn)一步觀察,發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞經(jīng)壯西作用后，部分細(xì)胞核凝集、碎裂成片狀，呈凋亡細(xì)胞的形態(tài)改變，還有部分細(xì)胞趨向壞死的改變，表明該藥在體外對(duì)胃癌細(xì)胞發(fā)揮生長(zhǎng)抑制作用的機(jī)制之一，可能是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。組方中的主藥寒水石在蒙醫(yī)中有不同的炮制方法，可用于治療不同的病癥[7]。其中寒水石與與訶子、硼砂、光明鹽、蓽茇、麥冬組成灰化小劑，趙立遠(yuǎn)等[8]研究發(fā)現(xiàn)該化灰小劑可抑制S-180荷瘤小鼠的腫瘤的生長(zhǎng)，其作用機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)免疫，調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)也初步觀察到了壯西有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。本實(shí)驗(yàn)僅觀察了蒙藥對(duì)胃癌細(xì)胞殺傷的生物學(xué)效應(yīng)，其具體的作用機(jī)理尚需深入研究。