季菲，李曉紅，馬蓉，杜蓉，劉艷佳，丁巖

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科，烏魯木齊 830054)

目前公認(rèn)的高危型(HR)人乳頭瘤病毒(HPV)會導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生[1-3]。大多數(shù)HPV感染對宿主沒有進(jìn)一步的不良后果，但有一定比例未經(jīng)治療的HR-HPV感染會導(dǎo)致高級別宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變(CIN Ⅱ-Ⅲ)和宮頸癌[4-6]。有證據(jù)表明宿主全身與局部的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)是感染過程中的決定因素?！懊庖叻磻?yīng)是通過釋放不同的細(xì)胞因子進(jìn)行，細(xì)胞因子會在形成免疫調(diào)節(jié)的網(wǎng)絡(luò)中對合成和作用互相產(chǎn)生影響”。細(xì)胞免疫反應(yīng)是通過T細(xì)胞[輔助型T(Th)細(xì)胞和細(xì)胞毒T細(xì)胞]與抗原遞呈細(xì)胞合作調(diào)節(jié)的。細(xì)胞因子對感染所引起的免疫反應(yīng)一般分為免疫刺激(腫瘤抑制)Th1型細(xì)胞因子，例如干擾素γ(IFN-γ),腫瘤壞死因子α(TNF-α),白細(xì)胞介素2(IL-2)和白細(xì)胞介素12(IL-12),這些主要參與細(xì)胞介導(dǎo)免疫，Th2型細(xì)胞因子(IL-4,IL-5,IL-6,IL-8,IL-10)是對細(xì)胞介導(dǎo)反應(yīng)產(chǎn)生免疫抑制并主要引起體液免疫[7-8]。對Th1型和Th2型細(xì)胞因子水平的定性定量分析可以用來判斷人類的多種疾病，其中就包括HPV感染引起CIN的免疫反應(yīng)[9]。對宮頸病變的患者或者癌癥患者血漿中的細(xì)胞因子的研究不多，某些研究只討論一個或者幾個細(xì)胞因子，或者只是附帶提及HR-HPV，并未深入進(jìn)行研究[10-18]。本研究分析處于CIN不同階段的HR-HPV陽性患者的外周血細(xì)胞因子模式,并與HR-HPV陽性和陰性對照組相比較。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2016年7—8月就診于新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科門診的宮頸細(xì)胞學(xué)異常女性作為研究對象。獲取宮頸細(xì)胞學(xué)、組織學(xué)和HPV樣本。研究組構(gòu)成包括33例女性：10例中度異型(CIN Ⅱ)女性，11例重度異型(CIN Ⅲ)女性，12例宮頸癌女性(10例鱗狀細(xì)胞癌，2例腺癌)。對照組包括11例無宮頸細(xì)胞病變無高危型HPV女性和10例無宮頸細(xì)胞病變但高危型HPV測試為陽性的女性。高危型HPV陰性對照組年齡為32.4歲(病情穩(wěn)定6.2年)，高危型HPV陽性對照組27.9歲(病情穩(wěn)定7.4年)，CINⅡ患者33.4歲(病情穩(wěn)定5.7年)，CINⅢ32.3歲(病情穩(wěn)定5.5年)，浸潤癌女性35.6歲(病情穩(wěn)定7.2年)。納入標(biāo)準(zhǔn):中度異型(CIN Ⅱ),重度異型(CIN Ⅲ),或者微小浸潤癌。排除標(biāo)準(zhǔn):患者已絕經(jīng)、取樣時妊娠、患有慢性病(糖尿病、過敏或者自身免疫性疾病)、取樣時有急性感染跡象、免疫力低下。除了口服避孕藥之外，患者沒有定期服用藥物。在取樣前至少2周患者沒有使用止痛藥(非甾體類抗炎藥),CIN Ⅰ級病變(輕度異型)女性排除在外。研究對象中，超過50%的CINⅠ患者為HR-HPV陰性。對照組：在我院婦科門診常規(guī)體檢的健康女性。本研究方案經(jīng)過我院倫理委員會批準(zhǔn)，所有女性都已簽署知情同意書。

高危型HPV感染患者和子宮頸細(xì)胞病變與高危型HPV陰性和高危型HPV陽性對照組的HPV類型見表1。各組白細(xì)胞數(shù)目見圖1。

注：與CINⅡ比較，aP<0.05，bP<0.01;與CINⅢ比較，cP<0.01

圖1高危型HPV感染患者和子宮頸細(xì)胞病變與高危型HPV陰性和高危型HPV陽性對照組的白細(xì)胞數(shù)目

1.2 HPV取樣和測定 用于檢測人乳頭瘤病毒和其類型的宮頸刮片采用宮頸生物采樣器(瑞典馬爾默市Medscand Medical公司Accellon Combi?)采集。HPV測試如前面所述是通過對37個子類共同引物GP5/GP6聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)酶免疫分析法進(jìn)行[19-20]。用β球蛋白PCR來識別樣本錯誤并監(jiān)控PCR抑制物。另外，PCR酶免疫分析陽性案例中使用反向線點(diǎn)分析來識別個人的HPV類型。

表1 子宮頸細(xì)胞病變患者(CINⅡ,CINⅢ和癌)和HR-HPV陽性對照組的HPV類型

注：CIN為宮頸上皮內(nèi)瘤；HPV為人乳頭瘤病毒；下表同

1.3 血液取樣及處理 用不含無菌內(nèi)毒素的真空抽血管( 法國，Meylan,Becton Dickinson)采集早上8點(diǎn)到中午12點(diǎn)外周小靜脈血液樣本,用乙二胺四乙酸作為抗凝血劑，血漿樣本在化驗(yàn)前在-80 ℃下保存。用Sysmex XE-2100在所有的血液樣本中測出的白細(xì)胞數(shù)目均不同。

1.4 細(xì)胞因子測定 所有的血漿樣本都用酶聯(lián)免疫測定試劑盒(比利時尼韋爾,歐洲Biosource生產(chǎn))來測定細(xì)胞因子TNF-α,可溶性TNF-α受體(sTNFR I和sTNFRⅡ),IFN-γ，IL-2，IL-4，IL-10和IL-12[21]。IL-12免疫檢定中的檢測抗體能識別活性異二聚體(p40+p35)細(xì)胞因子，還有p40亞基同型二聚體。

CINⅢ患者和宮頸癌患者的血漿IFN-γ濃度顯著低于CINⅡ患者或者對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 高危型HPV陽性宮頸細(xì)胞病變患者和高危型HPV陰性和高危型HPV陽性對照組IFN-γ血漿濃度(pg/106)

注：IFN-γ為干擾素γ；下表同

TNF-α的血漿濃度在組之間差別并不大，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但在CIN Ⅲ患者和宮頸癌中，TNFRⅡ的血漿濃度明顯低于CIN Ⅱ，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 高危型HPV陽性宮頸細(xì)胞病變患者和HPV陰性及HPV陽性對照組的血漿TNF-α濃度及其可溶性受體sTNFRI和sTNFRII

注： TNF-α為腫瘤壞死因子α；sTNFRⅠ為可溶性腫瘤壞死因子受體I；sTNFRⅡ?yàn)榭扇苄阅[瘤壞死因子受體Ⅱ

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 18.0軟件數(shù)據(jù)處理，用Spearman等級檢驗(yàn)來調(diào)查細(xì)胞因子變量之間的相關(guān)性。選雙尾P值0.05來表示差異性。用非成對雙尾t測試來測定白細(xì)胞和白細(xì)胞亞群的差異。

2 結(jié)果

2.1 HPV測定結(jié)果 HPV類型16、18、31是最常檢測到的高危型HPV類型(n=18，n=7，n=8)。HPV-33，n=2；HPV-35，n=1；HPV-39，n=2；HPV-45，n=1；HPV-51，n=1；HPV-52，n=2；HPV-56，n=6；HPV-58，n=1；HPV-59，n=2；HPV-82，n=1。在1例CIN Ⅲ女性中檢測到HPV-70(低危型)及HPV-16，該女性成為12例女性中唯一只是單一感染患癌的個體。計有34例單一HPV感染，8例多重HPV感染的個體。表1匯總了研究組中的HPV類型。白細(xì)胞計數(shù)差別：CINⅢ和癌癥患者的白細(xì)胞總數(shù)比CINⅡ患者和對照組高，CINⅡ和CINⅢ的白細(xì)胞數(shù)差別巨大。中性白細(xì)胞數(shù)也顯示了類似的變化曲線，從CINⅡ到癌癥有顯著增加。各組的絕對單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞計數(shù)差別巨大，CINⅢ女性患者數(shù)值最高。圖1顯示了白細(xì)胞計數(shù)差別。

2.2 細(xì)胞因子水平 細(xì)胞因子化驗(yàn)結(jié)果是基于每一個106白細(xì)胞，以對各研究對象不同數(shù)目的細(xì)胞因子產(chǎn)生白細(xì)胞進(jìn)行分層。通過對研究組外周血細(xì)胞因子水平的分析，本組發(fā)現(xiàn)了8個所調(diào)查的細(xì)胞因子每一個變化曲線都不同。各組的差別表現(xiàn)在IFN-γ濃度上，從CINⅡ到CINⅢ到癌癥(P≤0.01)有顯著減少，如表3匯總所示。

對照組和研究組的血漿TNF-α濃度差異無統(tǒng)計學(xué)意義。兩種TNF受體在所有的組中都有顯著的關(guān)聯(lián)性(高危型HPV陰性對照組r=0.973，P<0.001；高危型HPV陽性對照組r=0.855，P=0.002；CINⅡ患者r=0.979，P=0.001；CINⅢ患者r=0.791，P=0.004；侵入性癌患者r=0.748，P=0.005)。TNFRⅡ數(shù)在高危型HPV陽性對照組中最高。宮頸癌患者的TNFRⅡ數(shù)比CINⅡ患者有顯著減少。TNFRⅠ也顯示了類似的模式，不過差異不顯著。

高危型HPV陰性到高危型HPV陽性對照組血漿IL-2濃度有顯著增加(P=0.037)，不過IL-2數(shù)沒有顯著變化。各組的IL-12沒有顯著差別。在大多數(shù)被調(diào)查的血漿樣本中，IL-4濃度低于檢測極限值。在大多數(shù)對照組女性和中度異型女性中，IL-10值低于檢測極限值，不過在11例CINⅢ女性中4例能檢測到，在12例浸潤癌患者中7例能檢測到。表4標(biāo)出了IL-4和IL-10數(shù)據(jù)。

表4 高危型HPV陽性宮頸細(xì)胞病變患者、高危型HPV陰性和陽性對照組IL-4及IL-10血漿濃度

注：IL-4檢測極限值，2 g/L；IL-10檢測極限值，1 g/L

在所有的研究組中，通過計算Th1型細(xì)胞因子IL-12，IFN-γ，TNF-α，IL-2與Th2型稀薄因子IL-10的比率，本組得出癌癥患者Th2型細(xì)胞因子可能有所增加。癌癥患者的該比率與高危型HPV陽性對照組或者CINⅡ患者相比顯著減少(IFN-γ與IL-10比率P<0.01,TNF-α與IL-10比率P=0.02及P<0.01,IL-2與IL-10比率P=0.03及P=0.06)。圖2標(biāo)出了IL-12與IL-10的比率作為例子。

圖2 宮頸細(xì)胞病變HPV陽性患者和高危型HPV陰性和高危型HPV陽性對照組血漿中IL-12與IL-10的比率

3 討論

患者的白細(xì)胞計數(shù)差別與Onsrud等[22]研究結(jié)果一致，Onsrud指出宮頸癌時，可能是由于炎癥或者壞死造成白細(xì)胞和中性細(xì)胞數(shù)目增加，與健康的對照組相比，淋巴細(xì)胞絕對值有所減少。Gemignani等[23]和Balaram等[24]的研究也確認(rèn)了這些結(jié)果。這為每106白細(xì)胞細(xì)胞因子數(shù)據(jù)的分層作出了解釋。本研究表明重度異型和浸潤癌癥女性中流動IFN-γ濃度有顯著減少。IFN-γ是Th1細(xì)胞、細(xì)胞毒T細(xì)胞、刺激后的自然殺傷細(xì)胞分泌的，在對HPV感染作出有效Th1型細(xì)胞免疫反應(yīng)中發(fā)揮主要作用?？蓹z測到的IFN-γ的產(chǎn)生可能與持續(xù)的HPV感染和HPV相關(guān)腫瘤發(fā)生有關(guān)系[25]。本組的流動IFN-γ數(shù)據(jù)與此類報告一致。TNF-α與IFN-γ在導(dǎo)致宮頸癌細(xì)胞凋亡或者壞死中協(xié)同發(fā)揮作用[26]。TNF-α的生物學(xué)作用由其兩個受體TNFRⅠ和TNFRⅡ介導(dǎo)。這兩個受體在很多細(xì)胞類型和組織中都存在；TNFRI 在對TNF-α毒性作用敏感的細(xì)胞中非常多見，而TNFRⅡ在刺激后的T和B細(xì)胞中非常多見[27]。包括TNF-α本身，一些細(xì)胞因子對兩種受體的細(xì)胞表面反應(yīng)通過對細(xì)胞外區(qū)域進(jìn)行蛋白質(zhì)裂解成為可溶性蛋白sTNFRⅠ和sTNFRⅡ流出，進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)。對這兩種可溶性受體，特別是sTNFRⅡ的檢測通常用來評估Th1型細(xì)胞在細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)中的行為[27-29]。本研究發(fā)現(xiàn)各組的TNF-α值沒有顯著區(qū)別。不過，癌癥患者血漿中這兩種可溶性受體濃度有所減少，sTNFRⅡ則顯著減少。該結(jié)果反映了發(fā)展為CINⅢ和浸潤癌后，流動TNF-α減少，Th1型免疫反應(yīng)被擾亂。在本研究組中，外周血Th1型細(xì)胞因子IL-2濃度除了從高危型HPV陰性到高危型HPV陽性對照組有些許增加(P=0.037)之外沒有顯著區(qū)別，該增加可能顯示了對病毒性感染的抗感染反應(yīng)?！鞍准?xì)胞介素10濃度隨著異生的嚴(yán)重性而顯著增加”。在宮頸癌發(fā)展過程中可能轉(zhuǎn)化成Th2型細(xì)胞因子，這可能表現(xiàn)在血漿中Th2型細(xì)胞因子IL-4和IL-10濃度增加。不過，在研究組中沒有發(fā)現(xiàn)IL-4濃度有顯著區(qū)別。IL-10濃度隨著宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變的程度而顯著增加。IL-10是有效的免疫抑制細(xì)胞因子，其抑制T細(xì)胞活性和Th1細(xì)胞分化。Jacobs等[18]將向Th2型的轉(zhuǎn)化描述為高級別鱗狀上皮內(nèi)病變患者 IL-12與IL-10比率顯著減少。IL-12是誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)免疫的關(guān)鍵細(xì)胞因子，其促使T細(xì)胞分化成IFN-γ，產(chǎn)生Th1細(xì)胞，促使自然殺傷細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ。在本研究中發(fā)現(xiàn)的CINⅢ患者和癌癥患者IL-12,IFN-γ，TNF-α和與IL-10相關(guān)的IL-2顯著減少，支持并延伸了Jacobs等[18]在重度宮頸異生和宮頸癌發(fā)展時擾亂的細(xì)胞免疫反應(yīng)的發(fā)現(xiàn)。在所有的參與者中，本組排除了能夠影響循環(huán)細(xì)胞因子濃度的疾病，所以本組推定這些結(jié)果是HPV感染的后果。本組發(fā)現(xiàn)從異型到浸潤癌的不同階段的循環(huán)中的干擾素γ和腫瘤壞死因子α受體Ⅱ有顯著減少，白細(xì)胞介素10濃度增加。這些結(jié)果顯示宮頸上皮內(nèi)瘤(CIN)Ⅲ 病變女性宮頸癌癌變過程中向輔助性T2型(Th2)細(xì)胞因子轉(zhuǎn)化，在治療CINⅡ和CINⅢ患者時進(jìn)行預(yù)防接種，使Th2型反應(yīng)轉(zhuǎn)化為Th1型反應(yīng)可能有效果。本組發(fā)現(xiàn)的宮頸異型和浸潤癌外周細(xì)胞因子轉(zhuǎn)化不一定跟公布的細(xì)胞因子數(shù)據(jù)一致[10-18]。在Niwa等[10]的研究中，宮頸癌患者和對照組血漿中IFN-γ濃度相似，而在Lebrecht等[11]的研究中，在所有的組中IFN-γ濃度均低于檢測極限值。本組血漿TNFRI濃度發(fā)現(xiàn)宮頸癌患者與良性病變子宮肌瘤女性相比，血清sTNFRI濃度非常低。不過這與Malejczyk等[16]的結(jié)果不同，在其研究中，HPV-16關(guān)聯(lián)的CINⅠ/Ⅱ和CINⅢ病變、HPV-16/18相關(guān)的鱗狀細(xì)胞宮頸癌患者與健康對照組進(jìn)行了比較。CIN病變女性和對照組在受體數(shù)值上沒有顯著差別，不過兩種受體濃度在宮頸癌患者中有顯著增加。造成與此前研究結(jié)果不同的重要因素包括對照組和患者的選擇標(biāo)準(zhǔn)。在本研究中，根據(jù)他們感染高危型HPV的狀態(tài)選擇患者和對照組。1例宮頸癌女性為低危型HPV70的個案可以解釋為高危型HPV DNA通過細(xì)胞基因組L1區(qū)域進(jìn)行結(jié)合，這在GP5+/6+ PCR中可能被遺漏。除了Jacobs等[18]和Malejczyk等[16]的研究之外，上面所提到的研究中都沒有研究HPV的存在。而且，白細(xì)胞數(shù)的分層可能也能解釋這些不一致之處。免疫活性白細(xì)胞是循環(huán)細(xì)胞因子的主要產(chǎn)生來源。與其他研究相比，本研究是根據(jù)白細(xì)胞數(shù)計算結(jié)果的，而不是根據(jù)每毫升血漿。最后，細(xì)胞因子檢測的分析方法可能不一樣。有些研究用血漿，有些研究用血清，這種選擇可能會影響數(shù)據(jù)結(jié)果。有些研究都使用酶聯(lián)免疫測定試劑盒，有些由不同的廠家生產(chǎn)。這說明使用不同的抗體系統(tǒng)來粘合細(xì)胞因子并量化其敏感度不一。本研究結(jié)果顯示CINⅢ病變女性中向Th2細(xì)胞因子模式轉(zhuǎn)換已經(jīng)很明顯。這為臨床治療所有CINⅢ病變女性的原則提供了理論基礎(chǔ)。另外，這也可能表明，宮頸癌患者預(yù)防接種可能使Th2型反應(yīng)轉(zhuǎn)為Th1型反應(yīng)，這在CINⅡ病變女性中可能也有一定的作用。

總之，本研究表明了不同階段的宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變到發(fā)展為浸潤癌的過程中高危型HPV感染的外周細(xì)胞環(huán)境的特征性變化： IFN-γ和sTNFRⅡ顯著減少，IL-10濃度增加。這表明在宮頸癌發(fā)展過程中模式向Th2型免疫反應(yīng)轉(zhuǎn)化。在CINⅢ患者中細(xì)胞介導(dǎo)免疫表現(xiàn)明顯，這和大多數(shù)CINⅢ病變?nèi)绻麤]有正規(guī)治療，并不會自動減輕，而可能最終發(fā)展為浸潤癌的臨床觀點(diǎn)一致[30]。