彭慧群， 徐小剛， 陳昭月， 王 力， 戴 軍*

（1.食品與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122；2.東臺(tái)市濟(jì)民生物科技有限公司，江蘇 東臺(tái)224221；3.大連王力野生靈芝生物科技有限公司，遼寧 大連116003）

紅緣擬層孔菌（Fomitopsis pinicola）是一種藥用蘑菇，有待開發(fā)利用為食品新資源[1]。紅緣擬層孔菌能祛風(fēng)、除濕，民間用于治療礦工“寒腿”病；其子實(shí)體的水提物具有抑制腫瘤等功效[2]。孫雪[3]等從紅緣擬層孔菌發(fā)酵產(chǎn)物中提取分離得到了一種單體化合物，并對(duì)其進(jìn)行了抗腫瘤和免疫增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)的研究，在此基礎(chǔ)上研制出了一種抑制腫瘤的保健食品?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，該菌水提取物具有抗菌、抗腫瘤、調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、降血糖、調(diào)節(jié)人體免疫功能以及抗氧化和清除自由基等作用[4-6]。另外，紅緣擬層孔菌具有補(bǔ)益作用、抗炎作用[7]、抑制水腫[8]以及治療肥胖作用[9]，可以運(yùn)用到新型保健食品中。

目前，文獻(xiàn)已報(bào)道的關(guān)于紅緣擬層孔菌多糖的研究主要集中于紅緣擬層孔菌子實(shí)體提取物的生物活性。而關(guān)于從紅緣擬層孔菌多糖中分離出多種多糖級(jí)分，對(duì)其進(jìn)行免疫活性分析并進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征的報(bào)道較少。作者分別以純水和堿液從中提取得到兩類多糖，對(duì)純水提取的多糖進(jìn)行分離純化，得到4個(gè)多糖級(jí)分，并均進(jìn)行了體外免疫活性的檢測(cè)和比較，優(yōu)選出兩個(gè)級(jí)分對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，為后續(xù)構(gòu)效關(guān)系研究和開發(fā)利用提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑 紅緣擬層孔菌子實(shí)體：大連王力生物科技有限公司提供；三氟乙酸（TFA）：＞99%，化學(xué)純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈：色譜純，美國Tedia公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑琳酮（PMP）：99%，美國 Acros Organics公司；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）：＞98%，美國 Biosharp；DMEM 培養(yǎng)液：美國Gibco生命技術(shù)公司；曲利本蘭（臺(tái)盼藍(lán)）：上?；瘜W(xué)試劑采購供應(yīng)站；氯化銨和乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na2）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；C57雄性小鼠：體重為（20～25 g），蘇州艾爾麥科技有限公司；其他試劑均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備 高效液相色譜儀：Waters 1525型：安捷倫科技有限公司；冷凍干燥機(jī)：SCIENTZ-10N型，寧波新芝生物股份有限公司；多用途水浴恒溫振蕩器：DSHZ-300型：江蘇太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE-52A型：上海亞榮生化儀器廠；可見光分光光度計(jì)722N型：上海精密科學(xué)儀器有限公司；循環(huán)水多用真空泵SHK-IIIS型：鄭州科泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；定時(shí)數(shù)顯恒流泵HL-2D型：上海滬西分析儀器廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 紅緣擬層孔菌子實(shí)體多糖的提取 分別采用水提醇沉和堿提醇沉的方法從紅緣擬層孔菌子實(shí)體中提取得到兩種多糖FPS、FPJ。

將粉碎的紅緣擬層孔菌子實(shí)體用95%的乙醇浸泡過夜，脫脂；在鼓風(fēng)干燥箱中干燥后，加入料液比為1∶20的蒸餾水中，在100℃水浴中循環(huán)提取4～6 h。提取后真空抽濾，濾渣重復(fù)提取2～3次。合并提取液，55℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至小體積，加3倍體積乙醇沉淀過夜，4℃10 000 r/min離心15 min，收集沉淀，經(jīng)95%乙醇、無水乙醇依次洗滌，真空干燥得FPS[10]。將濾渣置于鼓風(fēng)干燥箱中干燥8 h，將上述濾渣也真空干燥后加入料液比為1∶20的5%的NaOH溶液中，在60℃水浴中提取2 h，真空抽濾，往提取液中加入2 mol/L HCl中和，4 500 r/min離心15 min，取上清液，后續(xù)操作同純水提取粗多糖，真空干燥得FPJ[11]。

1.2.2 脫色脫蛋白

1）采用大孔吸附樹脂進(jìn)行脫色：5 g D101加入250 mL的三角瓶中，再加入50 mL的5 mg/mL粗多糖溶液，放入恒溫?fù)u床中，40℃、140 r/min振蕩8 h，過濾備用。

2）采用Sevag法脫蛋白質(zhì)[12]：往脫色后的多糖溶液中加入 Sevag試劑 （氯仿∶正丁醇=5∶1）（多糖∶Sevag 試劑=5∶1 或者 4∶1）混合，振蕩 30 min，靜置分層，棄去下層含有白色沉淀有機(jī)相，如此重復(fù)6次，減壓旋蒸濃縮后真空干燥備用。

1.2.3 FPS分離純化

1）DEAE Sepharose Fast Flow 柱分離分級(jí)：稱0.3 g經(jīng)過脫色脫蛋白質(zhì)的FPS溶于 5 mL、0.02 mol/L Tris[三（羥甲基）胺基甲烷]-HCl緩沖液（pH 7.8）中，通過 DEAE Sepharose Fast Flow 柱（3.5 cm×25 cm）進(jìn)行分離，前100管用0.02 mol/L Tris-HCl緩沖液等強(qiáng)度洗脫，101～200管用 0.01～1 mol/L NaCl和0.02 mol/L Tris-HCl溶液梯度洗脫。流速：0.8 mL/min。以苯酚硫酸法跟蹤檢測(cè)各管中多糖質(zhì)量，繪制多糖洗脫曲線并分別收集各多糖級(jí)分，用透析袋（相對(duì)分子質(zhì)量3 500）流水透析48 h去除鹽離子等小分子物質(zhì)，真空旋蒸濃縮后冷凍干燥。

2）Sepharose CL-6B柱分離分級(jí)：稱300 mg經(jīng)DEAE Sepharose Fast Flow層析柱分離后多糖溶于10 mL 0.9%NaCl中，通過 Sepharose CL-6B（2.6 cm×95 cm）進(jìn)行分離，洗脫液：0.9%NaCl，流速：0.4 mL/min。以苯酚硫酸法跟蹤檢測(cè)各管中多糖質(zhì)量，繪制多糖洗脫曲線并分別收集各多糖級(jí)分，用透析袋（相對(duì)分子質(zhì)量3 500）流水透析48 h去除鹽離子等小分子物質(zhì)，真空旋蒸濃縮后冷凍干燥。

1.2.4 4個(gè)多糖級(jí)分體外促進(jìn)正常小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[13]進(jìn)行。

1.2.5 高效體積排阻色譜（HPSEC）分析 將不同相對(duì)分子質(zhì)量的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品及各級(jí)分多糖樣品配制成約為5 mg/mL的溶液，參考文獻(xiàn)[14]中的色譜條件，進(jìn)樣分析。

1.2.6 紅緣擬層孔菌各級(jí)分多糖的單糖組成分析

1）多糖樣品完全酸水解：將級(jí)分多糖樣品配成5 mg/mL水溶液，參考文獻(xiàn)[14]中的實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)級(jí)分多糖樣品進(jìn)行酸水解。

2）標(biāo)樣及級(jí)分多糖樣品的PMP衍生化：取100 μL混合單糖標(biāo)準(zhǔn)水溶液 （各單糖質(zhì)量濃度為3 mg/mL）和多糖樣品酸水解產(chǎn)物，參考文獻(xiàn)[14]中的實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)混合單糖標(biāo)樣及級(jí)分多糖樣品酸水解產(chǎn)物進(jìn)行PMP衍生化，進(jìn)樣分析。

1.2.7 紅外光譜分析 取各級(jí)分多糖約1 mg放入研缽中，加入大約以1∶100的比例的溴化鉀充分研磨后壓片，4 000～400 cm-1區(qū)間掃描，掃描32次，分辨率為4 cm-1。

1.2.8 核磁共振分析 稱取30 mg樣品溶于0.5 mL D2O中，樣品質(zhì)量濃度為60 mg/mL，內(nèi)標(biāo)物為DDS，通過核磁共振儀進(jìn)行13C和1H分析[15]。

2 結(jié)果與討論

2.1 紅緣擬層孔菌粗多糖的提取率及多糖質(zhì)量

初步實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)水提醇沉法所得的粗多糖FPS為棕褐色固體，而經(jīng)堿提中和醇沉所得的粗多糖FPJ為黑色固體，兩者均顏色較深，不易溶于水，需加熱攪拌才能溶解，且含有少量不溶物質(zhì)。不同批次紅緣擬層孔菌粗多糖的提取得率及其多糖質(zhì)量見表1。由表1數(shù)據(jù)可知，F(xiàn)PJ的得率明顯高于FPS，但是FPS的糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于FPJ，F(xiàn)PJ中所含雜質(zhì)較多。

表1 不同批次的FPS和FPJ的提取得率及多糖質(zhì)量Table 1 Yield and polysaccharide content of FPS and FPJ

2.2 FPS和FPJ脫色脫蛋白質(zhì)得率及多糖質(zhì)量

經(jīng)大孔吸附樹脂脫色和Sevag法脫蛋白質(zhì)后，F(xiàn)PS呈淡灰色，F(xiàn)PJ為深灰色。由于FPJ顏色較深，故對(duì)其進(jìn)行兩次脫色。不同批次的FPS和FPJ脫色脫蛋白后得率及多糖質(zhì)量見表2。由表2可知，經(jīng)脫色脫蛋白處理，F(xiàn)PJ的損失率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于FPS，經(jīng)處理后FPS的純度高于FPJ，F(xiàn)PJ還是含有一定量的色素，其脫色后仍為深灰色。

表2 不同批次的FPS和FPJ脫色脫蛋白得率及多糖質(zhì)量Table 2 Recovery of decolorizing and deproteinzing of different batches FPS and FPJ and their polysaccharide content

2.3 FPS分離分級(jí)

2.3.1 DEAE-Sepharose Fast Flow柱分離分級(jí) 通過DEAE-Sepharose Fast Flow柱的洗脫液以管數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制洗脫曲線，見圖1。由洗脫曲線圖可知，在1.2.3的分離條件下，F(xiàn)PS的兩級(jí)分能夠很好的分離，按照出峰順序先后收集得到兩個(gè)多糖級(jí)分分別命名為FPS1、FPS2，兩級(jí)分透析除鹽后凍干供后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 FPS經(jīng)DEAE Sepharose Fast Flow柱分離的洗脫曲線Fig.1 Elution profile of FPS on DEAE Sepharose Fast Flow column

2.3.2 FPS1、FPS2經(jīng)Sepharose CL-6B柱分離分級(jí)FPS1、FPS2分別通過Sepharose CL-6B柱分離，共得到 4 個(gè)級(jí)分， 即 FPS1-1、FPS1-2、FPS2-1、FPS2-2，洗脫曲線見圖2-3。

圖2 FPS1經(jīng)Sepharose CL-6B柱分離的洗脫曲線Fig.2 Elution profile of FPS1 on Sepharose CL-6B column

2.4 各多糖級(jí)分體外對(duì)正常小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖作用的影響

為進(jìn)一步考察比較多糖級(jí)分FPS1-1、FPS1-2、FPS2-1、FPS2-2 的活性，將 FPS1-1、FPS1-2、FPS2-1、FPS2-2同時(shí)進(jìn)行體外單獨(dú)促進(jìn)正常小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)。結(jié)果表明：4個(gè)級(jí)分在質(zhì)量濃度為20、80、320 μg/mL時(shí)均有促脾淋巴細(xì)胞增殖活性，且FPS1-2及FPS2-1具有一定量效關(guān)系，4個(gè)多糖級(jí)分中FP2-1的促脾淋巴細(xì)胞增殖活性最強(qiáng)，結(jié)果見圖4。

圖3 FPS2經(jīng)Sepharose CL-6B柱分離的洗脫曲線Fig.3 Elution profile of FPS2 on Sepharose CL-6B column

圖 4 FPS1-1、FPS1-2、FPS2-1和 FPS2-2體外對(duì)正常小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖作用的影響Fig.4 Effect of FPS1-1,FPS1-2,FPS2-1 and FPS2-2 on the proliferation of splenocytes of normaL mice in vitro

2.5 多糖級(jí)分的純度測(cè)定及相對(duì)分子質(zhì)量分布

多糖的生物活性和其相對(duì)分子質(zhì)量大小密切相關(guān)。高效體積排阻色譜法（HPSEC）是目前應(yīng)用較廣泛且重復(fù)性較好、操作較簡(jiǎn)便快速的主要分析方法之一[16]。在 1.2.5所述分析條件下，HPSEC測(cè)得FPS1-2和FPS2-1的相對(duì)分子質(zhì)量分布色譜圖見圖5。由圖5可知，兩級(jí)分均為單一對(duì)稱峰，說明FPS1-2和FPS2-1皆為均一多糖組分。重均相對(duì)分子質(zhì)量分別為 9.10×103和 3.02×105。

圖5 FPS1-2和FPS2-1的HPSEC分析圖譜Fig.5 HPSEC profile of FPS1-2 and FPS2-1

2.6 多糖級(jí)分的單糖組成

12種單糖標(biāo)樣的PMP衍生化RP-HPLC圖譜見圖6。由圖6可知，在該色譜條件下12個(gè)單糖峰的分離效果較好。FPS1-2和FPS2-1完全水解后的PMP衍生化RP-HPLC圖譜見圖7。對(duì)照單糖標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間可知，F(xiàn)PS1-2含有5種單糖，分別為甘 露 糖 （Man）、葡 萄 糖 （Glc）、半 乳糖 （Gal）、木 糖（Xyl）、 巖藻糖 （Fuc）； 其摩爾百分比 （mol%）為14.88∶12.50∶60.80∶3.18∶8.65；FPS2-1 含有 4 種單糖，分別為甘露糖（Man）、葡萄糖（Glc）、半乳糖（Gal）、巖藻糖（Fuc），其摩爾百分比（mol%）為 14.48∶37.71∶36.91∶10.90。

2.7 多糖級(jí)分紅外光譜分析

使用傅立葉變換紅外光譜儀檢測(cè)了FPS1-2和FPS2-1在4 000～400 cm-1之間的紅外光譜，結(jié)果見圖8。兩個(gè)級(jí)分的紅外光譜帶都具有多糖特征峰，（3 400±15）cm-1處的吸收峰寬且強(qiáng)，是由于多糖的的O-H的伸縮振動(dòng)；（2 920±15）cm-1附近的中等強(qiáng)度的峰是由于飽和C-H的伸縮振動(dòng)；（1 640±10）cm-1為酰胺羰基的特征吸收峰；1 411 cm-1處出現(xiàn)的弱峰是由于C-H的變角振動(dòng)；這些特征峰均為典型的多糖特征峰。FPS1-2的紅外光譜圖在917 cm-1附近的吸收峰，是D-葡萄吡喃糖β端基差向異構(gòu)的C-H變角振動(dòng)，說明FPS1-2的的異頭碳構(gòu)型可能有β型。FPS2-1在840～853 cm-1附近處有一吸收峰，是D-吡喃環(huán)α端基差向異構(gòu)的C-H振動(dòng)。930 cm-1和761 cm-1附近吸收峰是 D-葡萄吡喃糖的C-O-C骨架非對(duì)稱和對(duì)稱伸縮振動(dòng)，說明FPS2-1的異頭碳構(gòu)型可能有α型[17-20]。

圖612 種單糖PMP衍生物的HPLC圖譜Fig.6 Chromatograms of PMP derivatives of twelve

圖7 FPS1-2和FPS2-1的PMP衍生物的HPLC圖譜Fig.7 Chromatograms of PMP derivatives of FPS1-2 and FPS2-1

圖8 FPS1-2、FPS2-1的紅外光譜圖Fig.8 Fourier transfrom IR spectrum of FPS1-2 and FPS2-1

2.8 多糖級(jí)分核磁共振分析

FPS1-2的1H-NMR譜和13C-NMR譜見圖9-12。在1H-NMR圖中，內(nèi)標(biāo)物的信號(hào)在0.33 δ處，故圖中放大區(qū)域的主要峰信號(hào)為 δ 4.98，5.03，5.07，5.12；δ 4.98 為 β 構(gòu)型異頭氫信號(hào)，δ 5.03、 5.07、5.12為α構(gòu)型異頭氫信號(hào)。13C-NMR圖中異頭碳區(qū)域的主要峰信號(hào)為 δ 100.64、103.90、 104.89、105.53；δ 100.64為α構(gòu)型異頭碳信號(hào)，較強(qiáng)；δ 103.90、104.89、105.53為β構(gòu)型異頭碳信號(hào)，較弱。以上數(shù)據(jù)說明此多糖的結(jié)構(gòu)重復(fù)單元可能主要由4種糖殘基組成[21-23]。δ 82～84區(qū)域中無信號(hào)，說明為吡喃糖；δ 69.30是發(fā)生氧取代的C6的信號(hào)[24]，δ 63.82處為游離C6的信號(hào)。所以FPS1-2可能有α-（1→6）糖苷鍵鏈接方式。

FPS2-1H-NMR譜和13C-NMR譜的異頭區(qū)域都只有一個(gè)信號(hào)峰，說明只有一種α構(gòu)型的糖殘基組成；在1H譜圖中異頭碳的信號(hào)為δ 5.50，是α型吡喃糖的質(zhì)子信號(hào)。13C-NMR譜圖中，δ 102.43是α型異頭C1的信號(hào)；δ 79.77是發(fā)生氧取代的C4的信號(hào)[25]；δ 75.84、74.11、72.83 是 C5、C4、C3 的信號(hào)[26]；δ 63.30是游離的C6信號(hào)。所以FPS2-1可能有α-（1→4）糖苷鍵鏈接方式。

圖9 FPS1-2的13H-NMR譜圖Fig.9 13H-NMR spectrum of FPS1-2

圖10 FPS1-2的13C-NMR譜圖Fig.10 13C-NMR spectrum of FPS1-2

圖11 FPS2-1的13H-NMR譜圖Fig.11 13H-NMR spectrum of FPS2-1

圖12 FPS2-1的13C-NMR譜圖Fig.12 13C-NMR spectrum of FPS2-1

3 結(jié) 語

從紅緣擬層孔菌中提取出水提多糖 （FPS），堿提多糖（FPJ）。FPS經(jīng)進(jìn)一步分離純化得到4個(gè)多糖級(jí)分，對(duì)4個(gè)多糖級(jí)分進(jìn)行促進(jìn)正常小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖試驗(yàn)。結(jié)果表明，四個(gè)級(jí)分在質(zhì)量濃度為20、80、320 μg/mL時(shí)均有促脾淋巴細(xì)胞增殖活性，且 FPS1-2及FPS2-1具有一定量效關(guān)系，4個(gè)多糖級(jí)分中FP2-1的促脾淋巴細(xì)胞增殖活性最強(qiáng)。對(duì)FPS1-2和FPS2-1進(jìn)行HPSEC分析，結(jié)果表明兩個(gè)級(jí)分均為單一對(duì)稱峰，說明FPS1-2和FPS2-1皆為均一多糖組分，其重均相對(duì)分子質(zhì)量分別為9.1×103和3.02×105。FPS1-2含有5種單糖，分別為甘露糖（Man）、葡萄糖（Glc）、半乳糖（Gal）、木糖（Xyl）和巖藻糖 （Fuc）；FPS2-1含有4種單糖，分別為甘露糖（Man）、葡萄糖（Glc）、半乳糖（Gal）和巖藻糖（Fuc）。紅外、核磁共振的分析結(jié)果表明，F(xiàn)PS1-2可能有α-（1→6） 糖苷鍵鏈接方式，F(xiàn)PS2-1 可能有 α-（1→4）糖苷鍵鏈接方式。