張 薇， 陸乃彥， 陳曉霞， 周 鵬

（食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122）

生物膜是微生物為了適應(yīng)脅迫環(huán)境而形成的有利于其生存的特殊生長狀態(tài)，是由其自身分泌胞外粘質(zhì)物包裹的、具有高度組織化的多細胞群體結(jié)構(gòu)。生物膜的形成常出現(xiàn)在食品制造、醫(yī)療植入等領(lǐng)域中，導(dǎo)致食品污染、病菌感染等嚴重問題。在食品加工過程中，病原體生物膜的形成，是食品傳播類疾病的主要成因。在美國，此類疾病每年引起數(shù)千人死亡，造成780多億美元的經(jīng)濟損失[1]。因此，抑制生物膜形成對于預(yù)防微生物污染具有十分重要的意義。

生物膜的形成分為5個階段，可逆接觸階段、不可逆接觸階段、菌落形成階段、生物膜成熟階段以及生物膜老化脫落階段[2]，其中，細菌粘附是生物膜形成的第一步。成熟的生物膜對紫外光等多種常規(guī)處理方式具有抵抗作用[3]，因此，抑制細菌粘附在生物膜形成的早期對其進行控制是十分重要的。

影響細菌粘附情況的因素主要包括材料的表面電荷、表面化學(xué)組成、表面粗糙度、表面浸潤性、材料剛性等[4]，這些材料的性質(zhì)以及細菌本身的性質(zhì)決定了細菌與表面的相互作用情況。由于細菌與材料的相互作用體系較為復(fù)雜，目前尚未有完善的理論模型來解釋各因素在細菌粘附過程中的作用，因此，亟需系統(tǒng)地研究材料的各性質(zhì)對細菌粘附情況的影響趨勢，以及細菌對不同環(huán)境所產(chǎn)生的響應(yīng)情況。其中，對材料表面浸潤性這一影響因素的研究結(jié)果存在一定爭議，許多研究者認為，疏水材料表面對細菌的抗粘附性更強[5-6]，但也有部分研究結(jié)果表面，親水性的表面更有利于抗細菌粘附[7-9]。這些相悖的結(jié)論可能是由于實驗環(huán)境的復(fù)雜性以及材料、細菌表面物理化學(xué)性質(zhì)的差異等因素造成的。因此，深入分析材料表面浸潤性對其抗細菌粘附能力的影響有助于人們理解兩者復(fù)雜的相互作用機理。

作者通過化學(xué)接枝的方法，制備了不同浸潤性的十八硫醇/半胱胺、十八硫醇/巰基丙酸混合單分子層表面材料，系統(tǒng)地研究了材料表面浸潤性對其抗細菌粘附能力的影響，并通過對3株食品中常見的有害菌株：大腸桿菌、銅綠假單胞菌及金黃色葡萄球菌的粘附實驗結(jié)果對比，發(fā)現(xiàn)隨著材料表面疏水性的增加，其抗細菌粘附的能力顯著提升。另外，材料表面的電性也對其抗細菌粘附的能力有影響，表面帶負電材料的抗菌性明顯優(yōu)于表面帶正電的材料。這些研究結(jié)果有助于為食品體系中抑制細菌粘附材料的設(shè)計和制備提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

大腸桿菌（Escherichia coli BL21）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027）及金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ATCC 6538）：購買于美國ATCC菌種庫；十八硫醇、半胱胺、3-巰基丙酸、FITC熒光染料：由Sigma公司提供；蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、大豆蛋白胨、葡萄糖、硫酸鎂、氯化鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉及無水乙醇：分析純，購于上海國藥集團；激光共聚焦專用玻底培養(yǎng)皿D35C4-20-1-N：杭州生友生物技術(shù)有限公司。

CLSM710激光共聚焦顯微鏡：德國蔡司公司；原子力顯微鏡Bruker Dimension ICON：德國布魯克科技有限公司；K550X全自動磁控離子濺射儀：英國Emitech公司；光學(xué)接觸角測量儀DSA100：德國Krüss GmbH公司；UV-1800紫外可見分光光度計：日本島津企業(yè)管理有限公司；超凈工作臺：上海智城分析儀器制造有限公司；GI-36全自動立式殺菌鍋：廈門致微儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 不同表面疏水性材料的制備 將單拋硅片裁成1 cm×0.5 cm大小，放入濃硫酸∶雙氧水體積比為3∶1的溶液中，加熱至90℃保持2 h，以除去硅片表面的有機物，隨后用超純水沖洗，并用氮氣吹干。將硅片放入真空鍍膜儀，調(diào)節(jié)真空度為1×10-1mbar，在45 mA工作電流下，噴金2 min，在硅片表面得到厚度為70 nm的金薄膜。

分別配置濃度2 mmol/L十八硫醇、10 mmol/L半胱胺的乙醇溶液，首先將表面鍍金的硅片放入半胱胺溶液中接枝，接枝時間分別為 5、10、30、60 min，隨后將硅片取出，用無水乙醇沖洗，除去未接枝的半胱胺，隨后放入十八硫醇溶液中繼續(xù)接枝24 h，將接枝后的鍍金硅片在無水乙醇中漂洗兩遍后用氮氣吹干[10]。

同樣配置10 mmol/L的3-巰基丙酸乙醇溶液，與十八硫醇混合接枝到金表面，操作過程與半胱胺/十八硫醇混合接枝相同。

1.2.2 接枝薄膜的表面形貌表征 利用原子力顯微鏡對接枝后的樣品進行表面形貌表征。采用接觸模式（Contact mode），探針型號為 SNL-A，掃描速率為0.977 Hz，所采集的圖像均經(jīng)過flatterning處理來彌補樣品傾斜所造成的偏差。

1.2.3 接枝薄膜的表面浸潤性表征 利用光學(xué)接觸角測量儀對接枝后的材料進行表面浸潤性的表征。在室溫下測定樣品表面接觸角，液滴體積2 μL，待水滴滴在樣品表面15 s后拍照，利用儀器自帶軟件進行接觸角計算。每個樣品表面選取3個不同位置分別進行測定，取平均值，得到接觸角數(shù)據(jù)。

1.2.4 細菌粘附實驗 大腸桿菌、銅綠假單胞菌及金黃色葡萄球菌均保藏于-80℃甘油管中。用斜面培養(yǎng)基對三株菌進行活化后，分別取兩針接種于LB肉湯培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min下培養(yǎng)12 h，使菌體生長達到對數(shù)期。4℃下離心收集菌體，用pH 7.4、0.08 mol/L PBS緩沖液洗滌兩次，用PBS調(diào)節(jié)菌懸液，使其 OD600為（0.6±0.05）×10-8CFU/mL。接下來，大腸桿菌懸液以1%濃度接入M63培養(yǎng)基，銅綠假單胞菌懸液、金黃色葡萄球菌懸液以同樣的濃度接進TSB培養(yǎng)基中，將接枝后的材料置于六孔培養(yǎng)板底部，接入含有菌懸液的新鮮培養(yǎng)基，在37℃下培養(yǎng)5 h。

1.2.5 激光共聚焦樣品處理及觀察 將培養(yǎng)好的材料取出，于0.08 mol/L PBS中漂洗，去除未粘附的菌體。用含2.5%戊二醛、2%多聚甲醛的PBS緩沖液液固定15 min，以保存細菌細胞和組織的原有形態(tài)結(jié)構(gòu)。將樣品在PBS緩沖液中漂洗10 min，置于10 μg/mL的FITC溶液中染色30 min，再用PBS緩沖液漂洗兩次[11]。

將處理好的樣品反面向上放置于玻底培養(yǎng)皿中，在激光共聚焦熒光顯微鏡（LSM710，德國蔡司公司）下觀察。FITC在488 nm激光下激發(fā)，用40×物鏡獲取圖像。每個樣品隨機選取三個不同位置進行觀察并拍照，使用 CLSM自帶軟件ZEN 2012（蔡司，德國）對數(shù)據(jù)進行處理，用整張圖片的熒光覆蓋率表示已粘附細菌的量[12]。

2 結(jié)果與討論

2.1 接枝后樣品的表面性質(zhì)

十八硫醇、半胱胺及巰基丙酸的分子結(jié)構(gòu)式見圖1。他們的共同基團巰基與樣品表面形成Au-S鍵，共價接枝到樣品表面。用AFM對其形貌進行表征，見圖2。可以看到，接枝材料在樣品表面形成一層單分子層，由于分子排斥體積效應(yīng)[13-14]，接枝材料向上伸展，呈刷狀分布，平均高度約5 nm。通過接觸角測量儀對襯底表面的疏水性進行表征，結(jié)果見表1。當(dāng)半胱胺或巰基丙酸接枝時間較短時，材料表面的接觸角在120°左右，疏水性較強；隨著半胱胺或巰基丙酸接枝時間的上升，材料表面的氨基/羧基濃度增加，其疏水性逐漸降低至親水，最終接觸角達到40°左右。因此，可以通過調(diào)整半胱胺或巰基丙酸的接枝時間，得到各種表面浸潤性不同的材料。

圖1 十八硫醇、半胱胺及3-巰基丙酸的分子結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structuralformula of the octadecanethiol，cysteamine and 3-mercaptopropionic acid

圖2 接枝樣品形貌表征Fig.2 AFM images of the sample after graft modification

表1 不同接枝時間所得樣品接觸角Table 1 Contact angles on samples with different graft time

2.2 不同表面浸潤性材料對細菌粘附情況的影響

2.2.1 十八烷硫醇/半胱胺混合單分子層對細菌粘附情況的影響 作者選取3株菌株為食品中常見的有害菌株，也是目前生物膜研究中的典型菌株[15]。金黃色葡萄球菌常檢出于生肉、生乳及速凍食品中。而大腸桿菌是腸道中最普遍、數(shù)量最多的一類細菌，也是食品污染程度的重要參數(shù)指標(biāo)。牛奶是常見的易腐敗食品之一，控制牛奶腐敗的難點之一，即牛奶中金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及沙門氏菌生物膜的形成。銅綠假單胞菌形成生物膜，在日常食品檢測中，銅綠假單胞菌雖然不作為食品微生物檢驗的常規(guī)指標(biāo)，但其已被確認為食源性和水源性致病菌，易污染熟肉制品、涼拌即食食品，海鮮等食品。

在接觸角約為 118°、101°、74°、42°等表面浸潤性梯度變化的樣品表面進行細菌粘附實驗。大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及銅綠假單胞菌作為細菌模型，其在材料表面的粘附情況見圖3。

圖3 利用十八硫醇/半胱胺制備的不同接觸角樣品上大腸桿菌、銅綠假單胞菌及金黃色葡萄球菌的粘附情況Fig.3 CLSM images of the E.coli，P.aeruginosa and S.aureus adhesion on the Octadecanethiol/cysteamine grafted samples with different contact angles

從圖3可以看出，當(dāng)材料表面疏水性較強時，在其表面粘附的3種菌較少；隨著材料表面疏水性的降低，3種細菌在其表面的粘附量均逐漸增加，尤其是當(dāng)材料表面從疏水轉(zhuǎn)變?yōu)橛H水后，細菌的粘附量與疏水表面相比大為增加。另外，不同細菌在材料表面的粘附量存在一定差異，這主要是由于細菌自身的性質(zhì)不同所導(dǎo)致的，不同細菌的形狀、大小、表面電荷、表面疏水性、鞭毛性質(zhì)等都存在差異，使得粘附情況更為復(fù)雜。作者采用的金黃色葡萄球菌與銅綠假單胞菌由于其尺寸較小，細菌莢膜、粘液、鞭毛等結(jié)構(gòu)完整，比大腸桿菌自聚及粘附能力更強，因此在本實驗結(jié)果中粘附量更高。然而，即使自身性質(zhì)存在差異，不同細菌在表面浸潤性梯度變化的十八烷硫醇/半胱胺混合膜表面粘附情況變化的趨勢是一致的，表明材料表面的浸潤性是影響細菌粘附情況的重要因素，材料表面疏水性越強，抗細菌粘附的能力越強。

2.2.2 十八烷硫醇/巰基丙酸混合單分子層對細菌粘附情況的影響 為了進一步驗證表面浸潤性對細菌粘附情況的影響，我們用帶負電性基團-COOH的巰基丙酸代替帶正電性基團-NH2的半胱胺，與十八烷硫醇混合接枝到材料表面。不同表面浸潤性的十八烷硫醇/巰基丙酸混合膜對三種細菌的粘附情況影響見圖4?？梢钥闯?，隨著材料表面浸潤性的變化，細菌在其表面的粘附量變化趨勢與在十八烷硫醇/半胱胺混合膜表面的變化趨勢相同，即隨著材料表面疏水性梯度性降低，細菌的粘附量逐漸增加，并且在親水表面的粘附量遠遠大于疏水表面。

圖4 利用十八硫醇/3-巰基丙酸制備的不同接觸角樣品上大腸桿菌、銅綠假單胞菌及金黃色葡萄球菌的粘附情況Fig.4 CLSM images of the E.coli，P.aeruginosa and S.aureus adhesion on the on the octadecanethiol/3-mercaptopropionic acid grafted samples s with different contact angles

材料疏水性作為影響細菌粘附的重要性質(zhì)，一直是研究細菌粘附的重要考量因素。目前，許多研究團隊開展了一系列著重于材料的親疏水性即浸潤性對細菌粘附影響的研究。Arima和Iwata[16]發(fā)現(xiàn)細菌能極強的粘附于接觸角在40～70°的聚合物表面。但Lee等人報道[17]細菌在PET（聚對苯二甲酸乙二醇酯）表面極易粘附及生長，尤其當(dāng)其接觸角達到最大值57°。此類相反結(jié)論的得出也說明關(guān)于疏水性對細菌粘附的影響仍有待探索。之后，Ronn[11]等人發(fā)現(xiàn)當(dāng)材料表面由非濕潤狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)闈駶櫊顟B(tài)后，細菌粘附能力明顯增強。此實驗結(jié)果也從側(cè)面說明了疏水性強的材料能夠更有效的抑制細菌粘附。

2.2.3 材料表面電性對細菌粘附情況的影響 3種細菌在不同浸潤性的十八烷硫醇/半胱胺混合膜或十八烷硫醇/巰基丙酸混合膜表面的覆蓋率變化趨勢見圖5。從統(tǒng)計結(jié)果可以看出，隨著表面疏水性的增加，細菌在材料表面的覆蓋率下降，并且同一種細菌在十八烷硫醇/巰基丙酸混合膜表面的粘附量總是小于在十八烷硫醇/半胱胺混合膜表面的粘附量。這兩種混合膜的主要區(qū)別在于巰基丙酸含有負電性基團-COOH，膜表面帶負電，而半胱胺含有正電性基團-NH2，膜表面帶正電?？梢酝茰y，細菌在兩種混合膜表面粘附情況的差異與其帶電性有關(guān)。經(jīng)過測定，大腸桿菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的表面電位分別為 （-25.01±2.18） mV、（-16.76±2.24） mV 和（-10.16±3.04） mV，均帶負電，其與十八烷硫醇/巰基丙酸混合膜之間存在靜電排斥，與帶正電的十八烷硫醇/半胱胺混合膜相比，其對細菌的粘附有一定的抑制作用，進一步加強了材料表面對細菌的抗粘附性。

圖5 大腸桿菌、銅綠假單胞菌及金黃色葡萄球菌在不同浸潤性的十八烷硫醇/半胱胺混合膜或十八烷硫醇/巰基丙酸混合膜表面的覆蓋率Fig.5 E.coli，P.aeruginosa and S.aureus coverage rate on grafted samples with different contact angles

3 結(jié)語

材料表面的不同性質(zhì)對細菌粘附情況的影響非常復(fù)雜。作者通過在材料表面接枝不同比例的十八烷硫醇/半胱胺，或十八烷硫醇/巰基丙酸混合單分子層，利用3種不同性質(zhì)的常見致病菌，研究材料表面浸潤性對細菌粘附情況的影響。實驗發(fā)現(xiàn)，隨著疏水性的增加，細菌在材料表面的粘附量逐漸降低，在疏水性材料表面的粘附量遠遠低于親水性材料表面。另外，材料表面的帶電性也對其抗細菌粘附的能力有影響，由于大多數(shù)細菌的表面帶負電，其與同樣帶負電的表面之間存在靜電排斥，有利于提高材料表面的抗粘附性。這些結(jié)果能夠幫助理解細菌在材料表面粘附的內(nèi)在機理，同時有助于抗菌材料的設(shè)計和制備。