徐 君， 張言周， 黎循航，2， 管政兵， 蔡宇杰， 廖祥儒*

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫214122；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，江西南昌330045）

果聚糖（levan）普遍存在于天然植物中，在植物生長(zhǎng)過程中可以儲(chǔ)藏能量，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓，提高植物的耐旱能力[1]。許多微生物也可以合成果聚糖，據(jù)報(bào)道，能合成levan的菌株有很多，如果聚糖微桿菌（Microbacterium laevaniformans）[2]、水生拉恩氏菌 （Rahnella aquatilis）[3]、 枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[4]、 地 衣 芽 孢 桿 菌 （Bacillus licheniformis）[5]、 甲 基 營(yíng) 養(yǎng) 型 芽 孢 桿 菌 （Bacillus Methylotrophicus）[6]。它們合成果聚糖能力不盡相同，且果聚糖相對(duì)分子質(zhì)量也存在差異。據(jù)報(bào)道，有些細(xì)菌來源的levan具有抗病毒、增強(qiáng)免疫力等生理功能[7]。此外，果聚糖還具有熱量低、保濕效果好等特點(diǎn)，在食品、化妝品和醫(yī)藥方面都有著廣泛的應(yīng)用[8-10]。

目前合成levan果聚糖的方法有化學(xué)合成法[11]、微生物發(fā)酵法以及酶催化合成法[7-8]?；瘜W(xué)合成法過程較為繁瑣，且生成的副產(chǎn)物在后期較難除去。發(fā)酵法一般是指微生物利用蔗糖發(fā)酵產(chǎn)生levan，但大部分菌株合成levan的能力不高，且底物利用率也比較有限。一般來說，利用果聚糖蔗糖酶（levansucrase，LSase）合成果聚糖的方法較為簡(jiǎn)單，且能獲得較高的底物轉(zhuǎn)化率和levan果聚糖產(chǎn)量。作者通過克隆來源Bacillus amyloliquefaciens H47中的levansucrase基因，在Escherichia coli BL21（DE3）中表達(dá)成功，并對(duì)重組LSase進(jìn)行純化及酶學(xué)性質(zhì)分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 Bacillus amyloliquefaciens H47、Escherichia coli（E.coli）JM109、Escherichia coli DH5α、Escherichia coli BL21（DE3）、質(zhì)粒 pET-28a（+）：為作者所在實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)存。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：tryptone 10 g/L，酵母提取物 5 g/L，NaCl 10 g/L，agar固體培養(yǎng)基 20 g/L，濕熱滅菌（121 ℃、20 min）。

LB-卡那霉素（Kana）培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基滅菌后冷卻至40～50℃，加入 Kana至終質(zhì)量濃度為50 μg/mL。

1.1.3 主要試劑 限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、XhoⅠ、T4 DNA連接酶、dNTP Mixture、標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Marker和核酸Marker：大連寶生；膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒、DNA提取試劑盒：Takara公司；卡那霉素（Kana）和引物：上海生工。

1.1.4 主要儀器 高效液相色譜儀：HITACHI公司；蛋白質(zhì)電泳儀、凝膠成像儀：上海生工；AKTA avant蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)：美國(guó)通用公司。

1.2 方法

1.2.1 Levansucrase基因克隆及重組載體構(gòu)建 依據(jù)Bacillus amyloliquefaciens H47全基因組測(cè)序結(jié)果分析，設(shè)計(jì)引物序列，levF：5’-GCCGGGATCC ATGAACATCAAAAAATTTGC-3’；levR：5’ -GCCG CTCGAGTTAGTTGTTAACCGT AAGC-3’（下劃線部分為BamHI和XhoI酶切位點(diǎn)）。以B.amyloliquefaciens H47基因組DNA為模板進(jìn)行PCR，產(chǎn)物回收后，將其與pET-28a（+）質(zhì)粒分別用BamHI和XhoI雙酶切，將酶切后的DNA和載體連接，12 h后將連接產(chǎn)物導(dǎo)入E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)含有Kana的LB平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子，挑取10個(gè)轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)入LB-Kana培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證，并送往公司對(duì)目的基因進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2 Levansucrase的表達(dá) 將測(cè)序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒 pET-28a（+）-LSase 導(dǎo)入 E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，通過LB-Kana平板篩選，挑取3-5個(gè)轉(zhuǎn)化子，進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，將正確的轉(zhuǎn)化子挑到LB-Kana液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，-80℃甘油管保存。

從甘油管中接3 μL菌液至3 mL的LB-Kana培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min培養(yǎng)12 h后，以1 mL的接種量復(fù)接到含50 mL LB-Kana培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng) 2 h（OD600約為 0.6），加入 0.4 mmol/L的 IPTG，同時(shí)降溫至30℃培養(yǎng)，12 h后低溫離心收集菌體，并用 20 mmol/L、pH 6.5的 Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液將細(xì)胞懸浮，對(duì)懸浮后的菌液進(jìn)行破壁，至菌液呈透明狀，離心收集上清液和沉淀，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)和酶活測(cè)定。

1.2.3 Levansucrase的純化 將粗酶液過0.22 μm濾膜，選用1 mL HisTrap HP組氨酸標(biāo)記親和層析柱（鎳柱）進(jìn)行分離純化。緩沖液A為含有20 mmol/L咪唑，0.5 mol/L氯化鈉的磷酸鈉緩沖液（20 mmol/L、pH 7.4）。緩沖液B為含有500 mmol/L咪唑，0.5 mol/L氯化鈉的磷酸鈉緩沖液（20 mmol/L、pH 7.4）。線性洗脫，先用低濃度咪唑的B將結(jié)合在鎳柱上的雜蛋白質(zhì)沖洗下來，再用較高濃度的咪唑洗滌目的蛋白質(zhì)，收集樣品并做SDS-PAGE檢測(cè)和酶活測(cè)定。

1.2.4 Levansucrase酶活測(cè)定 用Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液（20 mmol/L，pH 6.5）配置 1.2 mol/L的蔗糖溶液作為底物，取0.5 mL蔗糖與0.5 mL酶液，混合均勻后在40℃下反應(yīng)20 min，以不加酶液的為空白對(duì)照，并通過HPLC法檢測(cè)葡萄糖和果糖的生成量。

果聚糖蔗糖酶酶活定義為：每分鐘生成1 μmol葡萄糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）。水解酶活定義為：每分鐘水解1 μmol果糖所需的酶量。轉(zhuǎn)糖基酶活定義為：每分鐘轉(zhuǎn)移1 μmol果糖所需的酶量。

1.2.5 高效液相色譜 反應(yīng)前后各物質(zhì)的量通過高效液相色譜 （HPLC）法檢測(cè)。色譜條件為：HITACHI系列色譜儀，示差檢測(cè)器，HITACHI LaChrom NH2（250 mm×4.6 mm）色譜柱，粒徑5 μm，柱溫 30 ℃，流動(dòng)相為乙腈∶水（70∶30），流速 1 mL/min，進(jìn)樣量 10 μL[12]。

1.2.6 溫度和pH對(duì)重組LSase酶活的影響 LSase最適溫度測(cè)定條件為：蔗糖濃度0.6 mol/L、20 mmol/L、pH 6.5的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液。在25～60℃范圍內(nèi)（25，30，35，40，45，50，55，60 ℃）測(cè)定 LSase 的酶活力，以確定LSase的最適催化溫度。研究過程中，分析了酶在30、40、50℃下的溫度穩(wěn)定性，以處理前的初始酶活力為100%。

LSase最適pH測(cè)定條件為：在蔗糖濃度0.6 mol/L、40℃條件下，測(cè)定LSase在不同的pH（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0）下酶活力的大小 （其中3.0～8.0為Na2HPO4-檸檬酸緩沖液，pH 8.0～9.0為Na2HPO4-KH2PO4緩沖液）。酶pH穩(wěn)定性測(cè)定的前處理?xiàng)l件為：將LSase在上述pH條件下放置12 h后，測(cè)定其殘余活力。

1.2.7 酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定 酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定條件為：20 mmol/L、pH 6.5 的 Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液，底物為蔗糖。底物濃度范圍0.025～0.9 mol/L。動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km和Vmax均采用Lineweaver-Burk方程進(jìn)行計(jì)算。

1.2.8 LSase催化底物反應(yīng) 將果聚糖蔗糖酶加到200 g/L的蔗糖溶液中，在pH 6.0、40℃條件下進(jìn)行催化反應(yīng)12 h后終止反應(yīng)，并用1.2.5方法分析體系中各物質(zhì)的量。

2 結(jié)果與討論

2.1 Levansucrase基因的克隆及重組載體的構(gòu)建

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的核酸膠電泳，條帶顯示目的基因大小約為1.5 kb。將重組質(zhì)粒用BamHI和XhoI進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，結(jié)果見圖1。兩個(gè)DNA片段大小約為5.4 kb和1.5 kb，表明目的基因成功插入載體pET-28a（+）上，測(cè)序結(jié)果也表明重組載體pET-28a-LSase在Escherichia coli中構(gòu)建成功。

圖1 重組質(zhì)粒pET-28a-LSase的酶切驗(yàn)證Fig.1 Identification of recombinant plasmid of pET-28a-LSase

2.2 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)

重組菌 E.coli BL21（DE3）/pET-28a（+）-LSase經(jīng)0.4 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)12 h后，離心收集菌體。以攜帶空載體 pET-28a（+）的 E.coli BL21（DE3）為對(duì)照組，結(jié)果見圖2。SDS-PAGE結(jié)果顯示，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的重組菌 E.coli BL21（DE3）/pET-28（a）-LSase，目的蛋白質(zhì)條帶出現(xiàn)在約 52 000（泳道4）處，這與預(yù)估的目的蛋白質(zhì)大小一致，并且在重組菌破碎后的上清液中檢測(cè)到酶活，而對(duì)照組均沒有檢測(cè)到酶活，表明 LSase在E.coli BL21（DE3）中成功表達(dá)。

圖2 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of expressed products

2.3 重組蛋白質(zhì)的分離純化

粗酶液經(jīng)His Trap HP親和柱純化后，具有組氨酸標(biāo)簽的LSase能夠與鎳結(jié)合，而其他雜蛋白質(zhì)被去除，得到的蛋白質(zhì)相對(duì)較純，結(jié)果見圖3。

圖3 純化后LSase的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of samples from purification

2.4 溫度對(duì)重組酶活性的影響

2.4.1 最適反應(yīng)溫度 由圖4可知，重組酶LSase的水解酶活和轉(zhuǎn)移酶活的最適溫度分別在45℃和40℃。不同來源的酶最適溫度差別很大，Bacillus sp.TH4-2來源的果聚糖蔗糖酶在60℃時(shí)轉(zhuǎn)移酶活性最大[13]，而運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌（Zvmomonas mobilis）的重組酶合成果聚糖 的最適合溫度為0℃[14]，Microbacterium laevaniformans ATCC 15953所產(chǎn)的酶在30℃時(shí)表現(xiàn)出了最大的轉(zhuǎn)移酶活性，而分解酶活性的最適溫度在45～50℃[15]。

圖4 溫度對(duì)LSase酶活力的影響Fig.4 Effect of temperature on the activity of LSase

2.4.2 溫度穩(wěn)定性 將LSase置于不同溫度（30、40、50℃）下處理，測(cè)定其殘余酶活，結(jié)果見圖5-6。表明在30℃下放置12 h后，分解殘余酶活為83.07%，轉(zhuǎn)移殘余酶活為76.06%，40℃放置12 h后，分解和轉(zhuǎn)移殘余酶活分別為74.97%和76.05%，在50℃放置2 h后，分解酶活降低為原來的21.23%，轉(zhuǎn)移酶活為12.46%，而在4 h后，酶幾近失活。

圖5 溫度對(duì)LSase水解酶活穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of temperature on the hydrolytic stability of LSase

圖6 溫度對(duì)LSase轉(zhuǎn)移酶活穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of temperature on the transfructosylation stability of LSase

2.5 pH對(duì)重組酶活性的影響

2.5.1 最適反應(yīng)pH 由圖7可知，在pH 6.5時(shí)，重組LSase的水解活力最大，而在pH 6.0時(shí)轉(zhuǎn)移活力最大。這與已報(bào)道的Microbacterium laevaniformans ATCC15953所產(chǎn)酶的最適 pH接近[15]。Lactobacillus sanfranciscensis TMW 1.392的果聚糖蔗糖酶最適pH為5.4，當(dāng) pH在 4.4～6.2范圍內(nèi)，酶活在50%以上，但當(dāng) pH大于7.0時(shí)，該酶的活性則完全被抑制[16]。目前報(bào)道的大部分細(xì)菌來源的levansucrase最適pH都在5.0～7.0之間[13-16]。

2.5.2 pH穩(wěn)定性 將重組酶LSase置于不同的pH（4～9）下放置，12 h后測(cè)定其殘余酶活，結(jié)果見圖 8。LSase在pH 6.0～7.5時(shí)穩(wěn)定，12 h后其殘余酶活仍然高達(dá)75%以上。

2.6 果聚糖蔗糖酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)用 Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液 （pH 6.5、20 mmol/L）配置不同濃度的蔗糖溶液，采用1.2.7方法，計(jì)算出Km和Vmax分別為150.74 mmol/L和21.23 μmol/（mL·min）。

圖7 pH對(duì)酶活力的影響Fig.7 Effect of pH on the activity of LSase

圖8 pH對(duì)酶穩(wěn)定性的影響Fig.8 Effect of pH on stability of LSase

不同微生物來源的levansucrase對(duì)蔗糖的親和力差別很大。Leuconostoc mesenteroides B-512 FMC[17]、Rahnella aquatilis[18]、P.syringae[19]和Zymomonas mobilis[20]的果聚糖蔗糖酶的 Km分別為26.6、50、122、160 mmol/L。

2.7 LSase催化反應(yīng)

以200 g/L蔗糖為底物，在pH 6.0、40℃條件下進(jìn)行果聚糖蔗糖酶催化反應(yīng)，12 h后終止反應(yīng)并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析。結(jié)果表明，產(chǎn)物中含有葡萄糖、果糖和果聚糖等一系列產(chǎn)物，且體系中的果聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為34.05%，而蔗糖只剩4.31%。

3 結(jié)語

將來源于Bacillus amyloliquefaciens H47中的levansucrase基因進(jìn)行克隆，并實(shí)現(xiàn)了在Escherichia coli BL21（DE3）中的異源表達(dá)，經(jīng)鎳柱純化后，對(duì)LSase的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步探索。研究發(fā)現(xiàn)，重組酶LSase的水解酶活和轉(zhuǎn)移酶活最適溫度分別為45℃和40℃，在溫度低于40℃時(shí)，酶活較穩(wěn)定。最適pH分別為6.5和6.0。在pH 6.0～7.5之間，酶可以較長(zhǎng)時(shí)間保存。而果聚糖蔗糖酶Km和Vmax分別為 150.74 mmol/L 和 21.23 μmol/（mL·min）。 此外，在pH 6.0、40℃條件下進(jìn)行酶催化反應(yīng)，12 h后體系中果聚糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到34.05%。