孫姍姍 ， 李 昕 ， 宋翠翠 ， 楊艷坤 ， 白仲虎 *

（1．糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122；2．江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；3．江南大學(xué) 糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

鐵蛋白（Ferritin，F(xiàn)ER）廣泛存在于動、植物及微生物體內(nèi)，在肝臟、脾臟、骨髓中含量較高。1972年，Addison等人證實了可以在人的血清中利用放射免疫分析法檢測到鐵蛋白的存在[1]。血清鐵蛋白可結(jié)合一定量的鐵，在臨床上作為檢測體內(nèi)鐵儲存狀況及多種疾病判斷的常用指標(biāo)。鐵蛋白的含量可以作為判斷鐵缺乏[2]、成人Still病的指征[3]，可以作為反映慢性肝病的嚴(yán)重程度的臨床指標(biāo)[4]，血清鐵蛋白升高有助于乳腺癌[5]、肺癌[6]等惡性腫瘤[7]的臨床診斷，可作為預(yù)測動脈粥樣硬化的危險因素[8]，能夠反映2型糖尿病患者的患病情況[9]，并用于預(yù)測體內(nèi)白血病殘留病灶[10]的輔助檢查，血清鐵蛋白的升高還可以作為女性骨密度降低的指標(biāo)[11]。

化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)（chemilumineseent immunoassay，CLIA）具有標(biāo)本用量少、穩(wěn)定性高、標(biāo)記物制備容易、不污染環(huán)境、操作簡便等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用在免疫診斷檢測中[12]。

作者使用鏈霉親和素包被微孔板，將一對抗體分別用生物素和辣根過氧化物酶 （Horse Reddish Peroxidase，HRP）標(biāo)記，利用生物素和親和素之間的高親和力，采用雙抗體夾心法，建立了快速簡便的化學(xué)發(fā)光定量檢測方法[13]。

1 材料與方法

1.1 原料

兩株抗FER單克隆抗體 （包被抗體、標(biāo)記抗體）：購自羅氏；96微孔板：購自costar；生物素標(biāo)記試劑盒、生物素化 HRP：購自 Thermo；BSA、鏈霉親和素、HRP標(biāo)記試劑盒：購自Sigma；FER抗原為國際標(biāo)準(zhǔn)品（WHO IS 94/572）；質(zhì)控血清為中國藥品生物制品檢定所產(chǎn)品；阻斷劑套裝：購自Meridian；HABA試劑：購自Thermo；底物：鹽城拜明生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；進口試劑盒：羅氏（Roche）對照；NaIO4、醋酸鈉、NaBH4、乙二醇等：上海滬試產(chǎn)品；臨床檢測用血清樣本300份：來自北京解放軍301總醫(yī)院、山東省立醫(yī)院；健康人血清樣本400份：來自上海市仁濟醫(yī)院體檢人群。

1.2 儀器

化學(xué)發(fā)光免疫分析儀TZD-CL-200S：廈門天中達(dá)；電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海三發(fā)；Mix-1500微孔板振蕩器：上海漢林；超微量紫外分光光度計Q5000：美國 Quawell；ST16R 離心機：Thermo Sorvall。

1.3 方法

1.3.1 鏈霉親和素包被（SAC，streptavidin coated）板的制備 取10 mg BSA，加入到1 mL的磷酸緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.0）中，加入 1.69 mg 生物素（相對分子質(zhì)量為556.59，間隔臂為22.4 ?），充分混勻，室溫偶聯(lián)1 h。將標(biāo)記好的生物素化牛血清白蛋白加入到Thermo脫鹽柱中純化脫鹽，用磷酸緩沖液作為洗脫液，去除游離的生物素。用pH 7.0的磷酸鹽緩沖液將上述Biotin-BSA稀釋成3 μg/mL的包被液，每孔200 μL，4℃過夜。將包被液傾去，洗液（含 5 g/L的 Tween-20）洗板。 加入 10 μg/mL的鏈霉親和素，每孔200 μL。加入封閉液（含2%BSA的磷酸緩沖液），200 μL每孔，4℃過夜。將封閉液傾去，板子晾干。

1.3.2 生物素化抗體的制備與純化 取1 mg的羅氏包被抗體，用超濾管超濾更換緩沖液為磷酸緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.0），最后收集到 1 mL 的體積。 加入約0.07 mg的生物素，充分混勻狀態(tài)下室溫偶聯(lián)1 h。

將上述標(biāo)記好生物素的抗體加入到Thermo的脫鹽柱中純化脫鹽，洗脫緩沖液為磷酸緩沖液。收集純化后的生物素抗體，通過Quawell的Q5000超微量紫外分光光度計測量生物素抗體的在280 nm處的吸光度。蛋白質(zhì)回收率為95%，以HABA試劑檢驗偶聯(lián)率為14.89。

1.3.3 HRP標(biāo)記抗體的制備 稱取4 mg HRP溶于1 mL 去離子水中，加入 200 μL NaIO4（0.1 mol/L）溶液，室溫避光攪拌20 min，將反應(yīng)物置于醋酸鈉溶液（1 mmol/L，pH 4.4）中，4 ℃透析過夜，加入 4 μL乙二醇，室溫避光反應(yīng)30 min。加入8 mg羅氏標(biāo)記抗體，于碳酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH 9.5）中 4℃避光透析過夜，結(jié)合物加入0.1 mL NaBH4，混勻，4℃避光反應(yīng)2 h，攪拌狀態(tài)下加入等體積的飽和硫酸銨，4℃放置1 h，5 000 r/min離心15 min，棄上清液。沉淀用PBS溶解，加入等體積甘油于-20℃保存[14]。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)品的制備 用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 （含2‰HSA（Human serum albumin），2%的 2-氯乙酰胺，pH 7.6的磷酸緩沖液）將鐵蛋白（FER）國際標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成質(zhì)量濃度分別為 800、400、150、50、10、0 ng/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分裝，-20℃凍存。

1.3.5 化學(xué)發(fā)光免疫分析實驗原理與步驟 采用CLIA雙抗體夾心法體外定量檢測血清中的鐵蛋白的質(zhì)量濃度。在預(yù)包被了鏈霉親和素的微孔板中，加入標(biāo)準(zhǔn)品、血清樣品后，再加入生物素化鐵蛋白抗體，混合后孵育，使生物素化的鐵蛋白抗體與鐵蛋白形成免疫復(fù)合物并與包被板上的鏈霉親和素結(jié)合，洗滌去除未結(jié)合的物質(zhì)；再加入HRP酶標(biāo)抗體結(jié)合物，使之與前面形成的免疫復(fù)合物結(jié)合，再洗滌去除未結(jié)合的物質(zhì)，加入化學(xué)發(fā)光底物后，使用化學(xué)發(fā)光免疫分析儀讀取相對發(fā)光強度（Relative Light Unit，RLU）。

取SAC板，在孔中加入25 μL的標(biāo)準(zhǔn)品、樣品或質(zhì)控品，再加入100 μL的生物素標(biāo)記的FER抗體，混勻20 s，室溫孵育30 min。傾去液體，用洗液將板子洗5次，拍干。每孔加入100 μL的酶標(biāo)抗體，室溫孵育30 min后洗掉。加入含魯米諾的底物，每孔100 μL，化學(xué)發(fā)光免疫分析儀進行檢測。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析 應(yīng)用3次曲線模型對結(jié)果進行分析，根據(jù)已知不同質(zhì)量濃度的鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的RLU值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過曲線計算樣品中的鐵蛋白質(zhì)量濃度。

1.3.7 本法準(zhǔn)確度指標(biāo) 使用質(zhì)量濃度為50 ng/mL和200 ng/mL的鐵蛋白質(zhì)控品作為樣本，按照上述實驗方法進行檢測，各重復(fù)測定3次，利用3次曲線模型擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，測量各質(zhì)量濃度結(jié)果的平均值記為（Mi），根據(jù)公式（1）分別計算相對偏差（Bi）

Bi=（Mi-T）/T×100%

式中：Bi為相對偏差；Mi為測量質(zhì)量濃度的平均值；T為標(biāo)定質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 抗體質(zhì)量濃度的確定

首先收集純化后的生物素化牛血清白蛋白，利用HABA試劑檢驗生物素偶聯(lián)率為18.31。按照SAC板的制備方法制備SAC板。通過SAC板的生物素結(jié)合量測試來確定生物素化抗體的結(jié)合量。在SAC 板上分別加入不同質(zhì)量濃度（0.5～10 μg/mL）生物素化抗體后，室溫孵育30 min，再加入生物素化HRP，室溫孵育30 min，洗板，加入底物并檢測。實驗結(jié)果見圖1。表明在2 μg/mL時生物素抗體在SAC板上的結(jié)合量已經(jīng)達(dá)到飽和。后續(xù)實驗即選用2 μg/mL作為生物素化抗體的質(zhì)量濃度。確定生物素化抗體質(zhì)量濃度后，通過檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線上不同質(zhì)量濃度點的RLU，考察酶標(biāo)抗體在1∶500～1∶40 000倍稀釋度間合適的稀釋度。實驗結(jié)果顯示，在1∶2 000的稀釋倍數(shù)時，800 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品的光子數(shù)在十萬到百萬之間，零值和低值能較好的拉開梯度。故本實驗抗體對最佳反應(yīng)質(zhì)量濃度為：生物素抗體質(zhì)量濃度為 2 μg/mL，酶標(biāo)抗體稀釋倍數(shù)為 1∶2 000。

圖1 生物素化抗體在SAC板上的結(jié)合量測試Fig.1 Binding capacity of biotinylated antibody on SAC microplate

2.2 阻斷嗜異性抗體

嗜異性抗體（heterophile antibody，HA）是由已知或未知抗原物質(zhì)刺激人體產(chǎn)生的一類能與多個物種免疫球蛋白發(fā)生相對弱結(jié)合的多重特異性免疫球蛋白[15]。目前免疫試劑所使用的抗體大多來自于實驗動物，HA由于能與許多動物來源的抗體相結(jié)合而干擾測定結(jié)果，影響臨床判斷，容易產(chǎn)生假陽性假陰性或其他干擾，導(dǎo)致誤診。研究證實，在健康人群中，約3%～15%的人體內(nèi)含有HA[16]。目前消除嗜異性抗體干擾的方法主要有使用阻斷劑、熱處理及其他吸附等。熱處理由于可能同時破壞分析物質(zhì)而不被廣泛使用，吸附處理有一定的效果。而使用阻斷封閉劑能降低大部分的嗜異性抗體干擾。阻斷封閉劑是一類旨在消除干擾抗體對于免疫檢測結(jié)果不利影響的專門試劑，分為非特異性和特異性兩類。非特異性阻斷劑主要為正常動物的免疫球蛋白，特異性阻斷劑主要為針對人嗜異性抗體設(shè)計的結(jié)合劑。目前兩種阻斷劑都有商品化的試劑如Meridian公司的主動型阻斷劑TRU Block和被動型阻斷劑。

通過臨床樣本檢測來篩選阻斷劑及其加入量。取經(jīng)臨床監(jiān)測鑒定含有HA的的臨床樣本，分別加入不同劑量的TRU Block或血清，見圖2。

圖 2 不同量的 TRU Block（μg/mL）和小鼠血清（%）對干擾的排除情況Fig.2 Elimination ofHA with various Blockersconcentration

結(jié)果顯示，小鼠血清在量足夠多（4%）的時候能夠排除部分干擾物如人抗鼠抗體（HAMA，human anti-mouse antibody），但排除干擾物能力有限，原因可能是因為不能排除其他動物源性的嗜異性抗體。TRU Block中含有能夠阻斷人抗鼠抗體及其他嗜異性抗體的成分，在本實驗中在250 μg/mL時已能較好的排除干擾。后續(xù)臨床實驗中，將TRU Block統(tǒng)一直接加入到生物素化抗體中使用，以排除部分樣本中的HA干擾。

2.3 本法主要技術(shù)參數(shù)

2.3.1 準(zhǔn)確度 根據(jù)準(zhǔn)確度的指標(biāo)，將標(biāo)準(zhǔn)品與質(zhì)控品同時測定，計算實測質(zhì)控品的質(zhì)量濃度與標(biāo)示質(zhì)量濃度的差值，結(jié)果見表1。

說明本法采用鏈霉親和素-生物素系統(tǒng)，重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確度高。

表1 本法準(zhǔn)確度檢測Table 1 Test of accuracy of the prepared FER detection method

2.3.2 線性范圍 在10～800 ng/mL范圍內(nèi)測定不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，檢測的結(jié)果用三次曲線模型進行擬合，計算相關(guān)系數(shù)（r）值為0.999 4。

2.3.3 靈敏度 平行測定10孔0 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品（標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液）的相對發(fā)光強度（RLU），計算RLU的平均值（M）與RLU標(biāo)準(zhǔn)差（SD）。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出（M+2SD）對應(yīng)的質(zhì)量濃度值即為靈敏度0.2 ng/mL。

2.3.4 精密度 對中國食品藥品檢定研究院提供的高、中、低（200、100、50 ng/mL）三個水平的質(zhì)控品進行測定，各重復(fù)檢測10次，計算各質(zhì)控品的檢測值，并計算各質(zhì)控的平均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差及變異系數(shù)（CV%）。批內(nèi)變異系數(shù)、三批試劑盒間的批間變異系數(shù)見表2。試劑盒批內(nèi)精密度皆小于10%，批間精密度皆小于15%，滿足2010版藥典中生物制品檢定要求。

表2 批內(nèi)及批間精密度Table 2 Test of precision of the prepared FER detection method

2.3.5 特異性 向血清樣本中加入不同質(zhì)量濃度的干擾物質(zhì)：癌胚抗原（CEA）、人白蛋白、肝鐵蛋白、脾鐵蛋白、人類心臟鐵蛋白、以及血紅蛋白。交叉反應(yīng)結(jié)果用達(dá)到相同的光強度時干擾物質(zhì)量和鐵蛋白量的比值來表示，交叉反應(yīng)結(jié)果見表3。結(jié)果表明，試劑盒特異性良好，非鐵蛋白類的蛋白質(zhì)基本不可檢出，肝臟、脾臟鐵蛋白可完全檢出，與鐵蛋白的水平能夠輔助診斷乙型肝炎、脂肪肝等肝臟疾病一致。

表3 交叉反應(yīng)考察結(jié)果Table 3 Results of cross-reaction

2.3.6 穩(wěn)定性 對試劑盒各組分進行37℃、9 d熱穩(wěn)定性考察，結(jié)果見表4。熱穩(wěn)定性結(jié)果與4℃保存的試劑盒相比，標(biāo)準(zhǔn)品的RLU下降幅度低于10%，靈敏度為0.2 ng/mL，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)r為0.998 0，批內(nèi)及批間精密度分別為3.21%～4.68%，4.27%～7.39%。

加速穩(wěn)定性試驗中，于37℃存放的試劑盒各組分在9 d后下降幅度低于10%，說明本法熱穩(wěn)定性各項指標(biāo)符合要求，此有效期可以滿足正常實驗室及臨床需求。

表4 穩(wěn)定性考察結(jié)果Table 4 Results of heat stability test

2.3.7 參考范圍的測定 對400例正常人臨床血清樣本進行檢測，其中男性245人（16～82歲），女性155人（19～76歲），根據(jù)美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會C28-A2[17]要求，建立自制試劑盒的正常參考范圍為：男性 30～400 ng/mL，女性 15～300 ng/mL。該參考范圍是基于一定數(shù)量的正常人血清樣本確定的，由于地理、人種、性別及年齡等差異，建議各實驗室建立自己的正常參考范圍。

2.4 與其他試劑盒及檢測方法的比較

同時用本法與羅氏試劑盒檢測臨床已確診的300份血清樣本，分析計算相關(guān)系數(shù)，對比結(jié)果見圖3。

圖3 本法與羅氏進口試劑盒相關(guān)性Fig.3 Linear correlation between the prepared methodand Roche kit

3 結(jié)語

作者采用了鏈霉親和素-生物素化學(xué)發(fā)光反應(yīng)系統(tǒng)，先將鏈霉親和素包被在96孔發(fā)光板孔中，使其主動吸附生物素化捕獲抗體。這種通過鏈霉親和素-生物素系統(tǒng)的間接包被法，吸附的抗體比較牢固和均一，不僅使包被的抗體量增加，單位面積的抗體增多，而且可以使其與抗原的結(jié)合位點充分暴露，可明顯減少非特異性吸附，大大提高了靈敏度及測定結(jié)果的可靠性、重復(fù)性。

本法測定鐵蛋白含量采用雙抗夾心二步法，所需樣本量少（25 μL），反應(yīng)時間短，操作簡便，重復(fù)性好，結(jié)果穩(wěn)定，測量范圍滿足臨床要求，適用于大批量檢測，可替代國外同類試劑盒。