劉志朝 楊 佳 王 莉 強 梅

山西醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院 (太原 ，030001)

胎停育是指孕早期胚胎發(fā)育自然終止及胚胎丟失的病理過程[1]。其發(fā)生與環(huán)境、內(nèi)分泌、染色體、免疫系統(tǒng)及心理衛(wèi)生等因素有密切關系，但仍有50%的病因尚未闡明[1]。不良妊娠結局的表觀遺傳學異常研究已成為近年來生殖與發(fā)育研究的前沿領域[2]。動物研究表明印記基因的敲除與胚胎發(fā)育有關[3]。作為一種表觀遺傳學修飾，DNA甲基化可以控制印記基因的表達[4]。精子的印記基因的甲基化修飾又能穩(wěn)定遺傳給子代[5]。故本研究通過分析胎停育與精子印記基因H19、Peg3、Meg3甲基化之間的關系，探索胎停育發(fā)生的可能表觀遺傳學機制。

1 對象與方法

1.1 研究對象

2015年3-4月和2016年3-4月，使用方便抽樣的方法選擇本院生殖中心行孕前檢查的已婚男性。入選標準：22～60歲已婚男性。排除標準：家族有遺傳病史、不育史者；精液<0.5ml)。通過自行設計的問卷，包括人口學特征、生活習慣和心理健康狀況等。由經(jīng)過培訓的調(diào)查員對入選者進行面對面訪談，簽署知情同意書。男性就診者禁欲3～7d，手淫法收集全程精液。因為經(jīng)費有限，從信息比較全的對象中用方便抽樣的方法選取442份精液樣本進行DNA提取及甲基化檢測。以此為基線，從隨訪檔案記錄或通過電話隨訪其配偶妊娠情況及結局。截至2018年3月，共得到394個隨訪結果。其中胎停育35例，作為胎停育組；配偶分娩正?；町a(chǎn)兒144例，從中通過1:1配對選取35例作為對照組。匹配條件：年齡相差不超過6歲；體質(zhì)量指數(shù)(BMI)相差不超過6 kg/m2；吸煙情況一致；飲酒情況一致；受孕方式一致。正?；町a(chǎn)兒：足月(孕周≥37周)、新生兒出生體重正常(≥2500～≤4000g)和無先天畸形。吸煙：≥1支/d，且持續(xù)1年以上。飲酒：≥1次/周，每次≥2兩，且持續(xù)1年以上。受孕方式包括自然妊娠和輔助生殖(IVF/ICSI)。

1.2 精子DNA中H19、Peg3和Meg3印記基因甲基化水平的檢測

采用異硫氰酸胍法[6]提取精子DNA；用EZ Methylation Gold-Kit試劑盒 (Zymo Research, Orange, CA, 美國)進行亞硫酸氫鹽處理；用PyroMark PCR Kit試劑盒(Qiagen，CA, 美國)進行PCR擴增；再經(jīng)單鏈PCR產(chǎn)物純化、測序引物雜交等步驟后使用PSQ96 焦磷酸測序儀 ( Biotage AB, Uppsala, 瑞典)及 PyroMark Gold Q96 kit試劑盒(Qiagen, CA, 美國)對H19、Peg3、Meg3的目的片段進行甲基化水平的檢測。本研究選取H19、Peg3和Meg3的DMR進行分析，分析的CpGs位點數(shù)目分別為H19 7個、Meg3 8個、Peg3 8個。PCR引物序列見表1；PCR擴增后的電泳結果見圖1。

表1 PCR 擴增的引物信息

*生物素標記的引物

(DNA分子量標記條帶從下至上依次為100bp，150bp，300bp，450bp)圖1 印記基因H19、Peg3和Meg3的PCR擴增后的電泳圖

1.3 統(tǒng)計分析

采用IBM SPSS 24.0進行統(tǒng)計分析。使用配對t檢驗對兩組間年齡和BMI進行比較；使用K-S檢驗對DNA的H19、Meg3、Peg3平均甲基化水平及各位點甲基化水平進行正態(tài)性檢驗，除H19的CpG3甲基化服從正態(tài)分布(P=0.2)，其余均不服從正態(tài)分布(P<0.05),使用Wilcoxon符號秩和檢驗分析配對的兩組精子印記基因甲基化水平的差異。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 基本特征比較

研究對象共35對，年齡25～45歲，配對年齡相差3歲以內(nèi)27對(77%)，年齡相差4～6歲8對(23%)，兩組差異無統(tǒng)計學意義(t=0.233,P=0.817)。體質(zhì)指數(shù)(BMI)相差3kg/m2以內(nèi)31對(89%)，相差4～6kg/m2共4對(11%)，差異無統(tǒng)計學意義(t=0.113,P=0.911)。吸煙21對(60%)。飲酒8對(23%)；自然妊娠19對(54%)，輔助生殖(IVF/ICSI)15對(46%)。

2.2 印記基因平均甲基化水平比較

兩組精子的H19、Peg3和Meg3甲基化水平比較無差異(P>0.05)。見表2。

2.3 印記基因各CpG位點甲基化水平比較

由于平均甲基化水平由各CpG位點組成，平均甲基化水平可能掩蓋某些CpG位點間的變化，因此將對照組和胎停育組精子的H19的7個、Peg3的7個和Meg3的8個CpG位點分別進行Wilcoxon符號秩和檢驗，胎停育組的Meg3的CpG3位點和CpG6位點甲基化水平顯著性減少(P<0.05)。其余CpG位點組間比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。去除極端值(n=4)后，發(fā)現(xiàn)胎停育組的Meg3的CpG3位點還是顯著減少(P<0.05)，而Meg3的CpG6位點甲基化水平組間比較無統(tǒng)計學差異(P<0.05)。提示精子Meg3的CpG3位點甲基化水平的改變與胎停育發(fā)生有關聯(lián)。見表3。

表2 兩組印記基因平均甲基化水平比較[%，M(P25，P75)]

表3 兩組印記基因各CpG位點甲基化水平比較[% ， M(P25，P75)]

*兩組比較P<0.05

3 討論

有研究指出印記基因H19與胎盤的形成和胚胎發(fā)育有關，敲除H19會導致胚胎死亡[3]。目前，關于人類H19基因與精液質(zhì)量的研究相對較多，如李建波等[7]發(fā)現(xiàn)H19甲基化水平與少精子癥和精子濃度有關，H19可能通過影響精子質(zhì)量影響胚胎發(fā)育。因此本研究通過匹配受孕方式減少精子質(zhì)量對結果的影響。Ankolkar等[8]的研究發(fā)現(xiàn)反復自發(fā)性流產(chǎn)組中研究對象精子的H19印記基因甲基化水平低于對照組。然而，在本次選用的人群樣本研究中，未觀察到胎停育與精子H19印記基因甲基化水平有關。胎停育發(fā)生的病因尚未明了，其與遺傳和環(huán)境關系極為復雜，需要進一步研究揭示。

Peg3是一個父系表達的印記基因，有研究顯示，敲除小鼠Peg3基因可導致胎盤異常、生殖能力及輔助行為缺陷、代謝異常和自主吸奶等行為缺陷[9]。以往的動物研究中敲除Peg3的DMR的雄鼠與正常雌鼠結合后，胚胎死亡與低出生體重小鼠的發(fā)生率上升[10]。胎盤Peg3 mRNA的高表達可能使巨大胎兒的發(fā)生率上升[11]。但是本次選用的人群樣本的研究中，未觀察到胎停育組與對照組精子Peg3印記基因甲基化水平的差異 ?？赡苁侨巳貉芯扛鼮閺碗s，有待于進一步探討。

Miyoshi等[12]在2000年發(fā)現(xiàn)小鼠Glt2的人類同系物，命名為Meg3。雌鼠此基因的敲除導致圍產(chǎn)期小鼠死亡和骨骼肌缺陷，表明小鼠Meg3在胚胎發(fā)育中有重要作用[13]。本次選用的人群樣本研究中，發(fā)現(xiàn)胎停育組Meg3的CpG3位點甲基化水平顯著低于對照組，說明精子Meg3甲基化水平與胚胎發(fā)育有關。前期研究表明，Meg3的DMR低甲基化會導致Meg3表達升高，例如，培養(yǎng)肝癌細胞的過程中加入甲基化抑制劑5-氮雜-2'-脫氧胞苷(5-Aza-CdR) 后Meg3的表達顯著增加[14]。而Meg3的表達與細胞增殖呈負相關，Meg3高表達抑制細胞增殖[15]。因此Meg3的低甲基化可能通過使Meg3的表達升高而抑制胚胎細胞的增殖與分化，從而影響胚胎正常發(fā)育。

就樣本量來說，因為關于印記基因甲基化水平對胎停育的危險性的研究很少，尤其是某些印記基因的甲基化水平高或者低是否是胎停育的危險因素的結論尚不能判定，OR值難以估計，所以樣本量不易計算。參考先前類似研究的樣本量，如Ankolkar等[8]的研究有23個病例和23個對照，Vidal等[16]的研究中有19個病例和60個對照，因此本研究用35個病例和35個對照進行分析。同時，本研究利用可供選擇的對照多的優(yōu)勢(n=144)，對一些因素進行了匹配，減小了混雜因素的影響，并且提高了研究效率。但是匹配的變量與所研究的變量之間的交互作用未能考慮，這是本研究的局限性。表觀遺傳學改變?nèi)菀资墉h(huán)境因素的影響，因此進一步的研究應該對同一個時間內(nèi)研究對象的精液樣本中印記基因甲基化水平與相關的環(huán)境改變和發(fā)育狀況之間的相關性作比較。