鄧婷婷，黃文勝，葛毅強(qiáng)*，陳 穎,*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100176；3.科技部中國(guó)農(nóng)村技術(shù)開(kāi)發(fā)中心，北京 100045）

隨著轉(zhuǎn)基因作物種植面積的日益擴(kuò)大和著轉(zhuǎn)基因食品飛速發(fā)展，許多國(guó)家都出臺(tái)轉(zhuǎn)基因標(biāo)識(shí)標(biāo)簽制度，歐盟、韓國(guó)及日本的轉(zhuǎn)基因標(biāo)識(shí)閾值（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）分別為0.9%、3.0%、5.0%[1-3]，我國(guó)自2002年起實(shí)施《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識(shí)管理辦法》[4]，明確規(guī)定在中國(guó)境內(nèi)銷(xiāo)售農(nóng)業(yè)部許可并列入標(biāo)識(shí)的轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品，必須進(jìn)行轉(zhuǎn)基因成分的標(biāo)識(shí)。隨著全世界標(biāo)識(shí)制度的完善和定量標(biāo)識(shí)制度的發(fā)展，建立轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)技術(shù)尤其是精準(zhǔn)定量檢測(cè)技術(shù)將越來(lái)越重要。

目前國(guó)內(nèi)外針對(duì)轉(zhuǎn)基因成分定量分析最常用的方法是實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）法，該技術(shù)依靠不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析，已比較成熟地用于轉(zhuǎn)基因定值當(dāng)中[5-8]。我國(guó)也發(fā)布了多項(xiàng)基于實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)的轉(zhuǎn)基因作物定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法[9-10]，其定量靈敏度在0.5%～0.1%之間。但是，實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)用作定量時(shí)由于每次進(jìn)行檢測(cè)操作都需同時(shí)進(jìn)行已知濃度標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，校準(zhǔn)品和樣品間背景的不同及PCR擴(kuò)增效率等因素都引入了偏差，導(dǎo)致其定量結(jié)果往往與實(shí)際值相差甚遠(yuǎn)[11-12]。此外，低拷貝數(shù)的目標(biāo)DNA分子很難通過(guò)擴(kuò)增檢測(cè)到[13-15]，因此在實(shí)際應(yīng)用中局限性較多。

數(shù)字PCR是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的單分子DNA絕對(duì)定量檢測(cè)技術(shù)，通過(guò)對(duì)樣品DNA極度稀釋?zhuān)瑢?duì)每個(gè)微反應(yīng)單獨(dú)進(jìn)行PCR擴(kuò)增后采用終點(diǎn)法檢測(cè)PCR產(chǎn)物，并依據(jù)泊松分布原理對(duì)靶基因定量，在不需要標(biāo)準(zhǔn)樣品的情況下實(shí)現(xiàn)目標(biāo)成分的絕對(duì)定量[16]，有效避免了上述實(shí)時(shí)熒光PCR定量帶來(lái)的擴(kuò)增反應(yīng)抑制物、PCR擴(kuò)增效率差異及標(biāo)準(zhǔn)曲線等帶來(lái)的定量偏差等問(wèn)題，并可減少實(shí)時(shí)熒光PCR帶來(lái)的基體效應(yīng)[17]。數(shù)字PCR具有測(cè)量獨(dú)立性與無(wú)需任何校準(zhǔn)物的特點(diǎn)，也使得低豐度靶標(biāo)分子的精準(zhǔn)檢測(cè)成為可能[13,18-19]。由于數(shù)字PCR定量更加準(zhǔn)確靈敏，目前已經(jīng)逐漸應(yīng)用到轉(zhuǎn)基因定量分析和低含量的轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)中。Fu Wei等[20]選取CaMV35s啟動(dòng)子和NOS終止子作為篩選轉(zhuǎn)基因作物的通用元件，用數(shù)字PCR進(jìn)行定量檢測(cè)，并對(duì)MON810等9 種轉(zhuǎn)基因品系進(jìn)行特異性驗(yàn)證，結(jié)果獲得檢測(cè)限為0.1%這一低于歐盟規(guī)定閾值的結(jié)果，表明該方法特異性好、靈敏度高，適于轉(zhuǎn)基因成分含量的精確定量。David等[21]利用微滴式數(shù)字PCR方法分別建立了兩個(gè)多重定量方法，可對(duì)12 個(gè)品系的轉(zhuǎn)基因玉米進(jìn)行含量測(cè)定，其檢出限、重復(fù)性和真實(shí)性均符合國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)中GMO定量要求。其他研究也表明與實(shí)時(shí)熒光PCR方法相比，數(shù)字PCR定量方法定量更加準(zhǔn)確靈敏[22-24]。

本研究基于微滴式和芯片式數(shù)字PCR平臺(tái)，以抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻為研究對(duì)象，擬建立轉(zhuǎn)基因水稻的精準(zhǔn)定量分析方法，并與傳統(tǒng)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果進(jìn)行比較，以期為食品和農(nóng)產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分的定量分析提供新的方法和借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

轉(zhuǎn)基因水稻（Oryza sativa）LL62品系（大米樣品）、轉(zhuǎn)基因大豆（Glycine max）GTS40-3-2、轉(zhuǎn)基因玉米（Zea mays）Bt11等標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)購(gòu)于歐盟聯(lián)合研究中心標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與測(cè)量研究所及美國(guó)油脂化學(xué)家協(xié)會(huì)。各種含量的轉(zhuǎn)基因克螟稻、TT51-1、KF6等轉(zhuǎn)基因大米標(biāo)準(zhǔn)樣品及非轉(zhuǎn)基因大米（明恢63）、大豆、玉米、小麥，高粱，油菜等樣品由本實(shí)驗(yàn)室保存。

ddPCR Super Mix（no dUTP）、ddPCR Droplet Generation Oil、ddPCR Droplet Reader Oil、Droplet Generator DG8 Cartridge 美國(guó)Bio-Rad公司；RealMaster Mix（with ROX） 美國(guó)ABI公司；食品基因組提取試劑盒NucleoSpin?Food 美國(guó)MN公司。

1.2 儀器與設(shè)備

QX200?微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)（包括微滴生成器、封膜機(jī)、PCR擴(kuò)增儀和微滴讀取儀） 美國(guó)Bio-Rad公司；Bio-Mark?微流體芯片式數(shù)字PCR系統(tǒng)（含儀器配套耗材） 美國(guó)Fluidigm公司；QuantStudio? 3D微流體芯片式數(shù)字PCR系統(tǒng)（含儀器配套耗材） 美國(guó)Life Technologies公司；7500實(shí)時(shí)熒光PCR儀 美國(guó)ABI公司；樣品研磨機(jī) 德國(guó)IKA公司；離心機(jī) 美國(guó)Beckman Coulter公司；Qubit核酸蛋白分析儀 美國(guó)Thermo Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA提取

所有樣品材料放入樣品研磨機(jī)中，研磨至粒度60 目左右，樣品基因組DNA按照NucleoSpin?Food核酸提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 引物和探針的設(shè)計(jì)及合成

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)大米蔗糖磷酸合成酶（sucrose phosphate synthase，SPS）和轉(zhuǎn)基因克螟稻品系特異性基因序列，分別設(shè)計(jì)3 對(duì)引物探針（表1），用于篩選適用于數(shù)字PCR的引物探針組，相關(guān)序列及其標(biāo)記由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。

表 1 sps和克螟稻品系特異性基因引物探針序列Table 1 Sequences of primers and probes for used for PCR amplification of sps and KMD event-specific genes

1.3.3 擴(kuò)增體系和反應(yīng)參數(shù)

1.3.3.1 數(shù)字PCR擴(kuò)增體系

分別向0.2 mL PCR管中加入2×ddPCR Super Mix（no dUTP）10 μL，終濃度為0.32 μmol/L的sps基因及克螟稻品系特異性基因正向引物和反向引物，0.12 μmol/L sps基因熒光標(biāo)記探針，0.2 μmol/L克螟稻品系特異性基因熒光標(biāo)記探針，1 μL DNA模板，利用ddH2O補(bǔ)齊至20 μL。

1.3.3.2 數(shù)字PCR擴(kuò)增參數(shù)及數(shù)據(jù)分析

將配制好的數(shù)字PCR混合液，加入微反應(yīng)體系生成裝置的加樣孔中生成微反應(yīng)體系。將微反應(yīng)體系放置于PCR擴(kuò)增儀中，按以下參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增：95 ℃、5 min（1 ℃/s），1 個(gè)循環(huán)；94 ℃、15 s，60 ℃、1 min（1 ℃/s），50 個(gè)循環(huán)；98 ℃、10 min（1 ℃/s），1 個(gè)循環(huán)；12 ℃保存反應(yīng)產(chǎn)物。將擴(kuò)增產(chǎn)物放入讀取儀中對(duì)微反應(yīng)體系進(jìn)行熒光檢測(cè)并計(jì)數(shù)。

1.3.3.3 實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增體系和參數(shù)

0.2 mL PCR反應(yīng)管中加入2×Real Master Mix（with ROX）10 μL，終濃度為0.4 μmol/L的正向引物和反向引物、0.2 μmol/L的探針、1 μL DNA模板，利用ddH2O補(bǔ)齊至20 μL。

實(shí)時(shí)熒光PCR程序?yàn)椋侯A(yù)變性95 ℃、10 min；95 ℃、10 s；60 ℃、45 s；45 個(gè)循環(huán)。

1.3.4 引物探針的篩選及其特異性

以常見(jiàn)轉(zhuǎn)基因作物品系和常見(jiàn)植物基因組DNA為模板，按上述反應(yīng)條件對(duì)本研究各組引物探針的有效性和特異性進(jìn)行測(cè)試。分別采用非轉(zhuǎn)基因大米明恢63和轉(zhuǎn)基因克螟稻品系大米樣品DNA為擴(kuò)增模板，以ddH2O為空白對(duì)照，分別對(duì)3 組sps基因和克螟稻品系特異性基因的引物探針進(jìn)行有效性擴(kuò)增。隨后選取擴(kuò)增效率最高的sps基因和克螟稻品系特異性基因引物探針組，利用非轉(zhuǎn)基因大米明恢63、轉(zhuǎn)基因大米TT51-1、KF6 、LL62品系、大豆、玉米、小麥、高粱、油菜、100%及1%轉(zhuǎn)基因克螟稻大米樣品、轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2、轉(zhuǎn)基因玉米Bt11為模板，驗(yàn)證擴(kuò)增效率最高的sps基因和克螟稻品系特異性基因引物探針組的特異性。

1.3.5 轉(zhuǎn)基因克螟稻定量體系的條件優(yōu)化

利用Qubit核酸蛋白分析儀將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%的轉(zhuǎn)基因克螟稻DNA溶液定量到質(zhì)量濃度20 ng/μL，并按6 倍梯度稀釋后分別加入4 μL DNA溶液至內(nèi)源基因sps的微滴式數(shù)字PCR擴(kuò)增體系中，每個(gè)梯度3 次重復(fù)進(jìn)行定量實(shí)驗(yàn)，通過(guò)計(jì)算每個(gè)梯度3 次重復(fù)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），判斷轉(zhuǎn)基因克螟稻定量體系中最適DNA模板添加量。

以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%的轉(zhuǎn)基因克螟稻大米樣品為模板，分別考察擴(kuò)增退火溫度和單雙重微滴式數(shù)字PCR等擴(kuò)增條件對(duì)定量結(jié)果的影響。將微滴式數(shù)字PCR擴(kuò)增參數(shù)中的退火溫度分別設(shè)為58、60、62 ℃和64 ℃，每個(gè)梯度3 次重復(fù)進(jìn)行定量實(shí)驗(yàn)，按1.3.3節(jié)所述方法計(jì)算最終的克螟稻轉(zhuǎn)基因成分含量。根據(jù)優(yōu)化好的條件，分別比較sps基因和克螟稻品系特異性基因分開(kāi)擴(kuò)增的兩個(gè)單重微滴式數(shù)字PCR體系與兩個(gè)基因合并后的雙重微滴式數(shù)字PCR體系擴(kuò)增5 次重復(fù)結(jié)果的差異。

1.3.6 轉(zhuǎn)基因克螟稻定量方法在芯片式數(shù)字PCR平臺(tái)上的適用性

分別在微流體芯片式數(shù)字PCR平臺(tái)Bio-Mark?和QuantStudio? 3D對(duì)已建立的基于微滴式數(shù)字PCR平臺(tái)的轉(zhuǎn)基因克螟稻成分定量檢測(cè)方法進(jìn)行驗(yàn)證。利用已優(yōu)化的雙重?cái)?shù)字PCR條件，將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%的轉(zhuǎn)基因克螟稻標(biāo)準(zhǔn)樣品分別在Bio-Mark?和QuantStudio? 3D微流體芯片式數(shù)字PCR平臺(tái)上進(jìn)行擴(kuò)增，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)其擴(kuò)增曲線，以確保每個(gè)微滴/微孔均能有效擴(kuò)增，針對(duì)擴(kuò)增微反應(yīng)體系的分布情況等逐一進(jìn)行分析。

1.3.7 轉(zhuǎn)基因克螟稻定量的絕對(duì)靈敏度和線性范圍

利用Qubit核酸蛋白分析儀測(cè)定轉(zhuǎn)基因克螟稻大米DNA溶液濃度后按2 倍梯度稀釋?zhuān)謩e稀釋至1.5 pg及0.5 pg，即內(nèi)外源基因的濃度均為1 copies/μL（大米單拷貝基因組質(zhì)量約為0.5 pg[25]）。共稀釋4 個(gè)梯度，每個(gè)梯度3 個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，按1.3.3節(jié)進(jìn)行微滴式數(shù)字PCR擴(kuò)增，分別檢測(cè)其內(nèi)源基因sps和克螟稻品系特異性基因的拷貝數(shù)，根據(jù)內(nèi)外源基因的理論值和實(shí)際值繪制相關(guān)性曲線。

1.3.8 數(shù)字PCR與實(shí)時(shí)熒光PCR對(duì)不同含量轉(zhuǎn)基因克螟稻的測(cè)定

利用上述實(shí)驗(yàn)建立的雙重?cái)?shù)字PCR定量體系，分別在QX200?微滴式數(shù)字PCR平臺(tái)和QuantStudio? 3D微流體芯片式數(shù)字PCR平臺(tái)上對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%、1%、5%的轉(zhuǎn)基因克螟稻樣品的進(jìn)行定量分析，每個(gè)樣品3 次重復(fù)定量實(shí)驗(yàn)，根據(jù)儀器自動(dòng)給出的內(nèi)外源基因拷貝數(shù)濃度，計(jì)算二者之比即為樣品中的轉(zhuǎn)基因克螟稻含量。

根據(jù)1.3.3節(jié)的實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增體系和參數(shù)，利用已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%、10%、5%、0.5%及0.1%的轉(zhuǎn)基因克螟稻樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，基于擴(kuò)增Ct值制作內(nèi)外源基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并將0.1%、1%、5%轉(zhuǎn)基因克螟稻樣品內(nèi)外源基因Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，對(duì)這3 個(gè)含量的樣品進(jìn)行定量，將其結(jié)果與微滴式及芯片式數(shù)字PCR定量結(jié)果比較研究。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)字PCR擴(kuò)增結(jié)束后，每個(gè)基因熒光本底值與陽(yáng)性值之間差異較大，即陰陽(yáng)性擴(kuò)增熱點(diǎn)之間界限分明且陽(yáng)性擴(kuò)增熱點(diǎn)較為集中，即可判定為擴(kuò)增結(jié)果良好，擴(kuò)增圖像可直接用作實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

由于數(shù)字PCR是絕對(duì)定量技術(shù)，無(wú)需標(biāo)準(zhǔn)曲線即可直接測(cè)得樣中的內(nèi)外源基因絕對(duì)含量。因此，數(shù)字PCR讀取儀逐一對(duì)每個(gè)微反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行計(jì)數(shù)分析后，根據(jù)泊松分布原理計(jì)算得到sps和克螟稻品系特異性基因的拷貝數(shù)濃度（copies/μL）。而本研究采用的sps和克螟稻品系特異性基因均為單拷貝基因，按下式計(jì)算樣品中轉(zhuǎn)基因克螟稻定量結(jié)果[26-27]：

2 結(jié)果與分析

2.1 引物探針篩選

通過(guò)采用實(shí)時(shí)熒光PCR方法對(duì)已設(shè)計(jì)合成的內(nèi)外源基因引物探針進(jìn)行篩選，結(jié)果表明所有引物探針均能有效擴(kuò)增出靶基因，但sps基因引物探針組F2/R2/P2和克螟稻品系特異性基因引物探針組LB-F1/R1/P1信號(hào)最強(qiáng)（圖1）。為保證后續(xù)數(shù)字PCR能到達(dá)最大效率，本研究選取sps-F2/R2/P2和LB-F1/R1/P1兩組引物探針，用于轉(zhuǎn)基因克螟稻的內(nèi)外源基因定量。

圖 1 sps及克螟稻品系特異性基因的引物探針篩選結(jié)果Fig. 1 Effectiveness of the primers and probes in amplifying sps and KMD event-specific genes

圖 2 sps- F2/R2/P2及LB-F1/R1/P1引物探針組特異性擴(kuò)增結(jié)果Fig. 2 Specificity of the primers and probes in amplifying sps and KMD event-specific genes

以利用非轉(zhuǎn)基因大米、常見(jiàn)轉(zhuǎn)基因大米、大豆及玉米品系及常見(jiàn)作物基因組為模板，對(duì)sps-F2/R2/P2和LB-F1/R1/P1兩組引物探針的特異性進(jìn)行分析。sps-F2/R2/P2引物探針組僅能擴(kuò)增出大米成分（含非轉(zhuǎn)基因大米明恢63、轉(zhuǎn)基因大米TT51-1、KF6、LL62品系），對(duì)其他禾本科植物玉米、小麥、高粱及大豆、油菜等作物均無(wú)擴(kuò)增。LB-F1/R1/P1引物探針組僅能擴(kuò)增出克螟稻轉(zhuǎn)基因成分，對(duì)其他轉(zhuǎn)基因大米品系和其他轉(zhuǎn)基因作物均無(wú)擴(kuò)增（圖2）。表明這兩組引物探針特異性較好。

2.2 轉(zhuǎn)基因克螟稻微滴式數(shù)字PCR定量體系的條件優(yōu)化

當(dāng)加入數(shù)字PCR擴(kuò)增體系中的克螟稻大米樣品DNA量從20 ng/μL按6 倍稀釋6 個(gè)梯度后，20 μL擴(kuò)增體系中DNA量在10 pg～80 ng之間時(shí)，目標(biāo)基因的理論拷貝數(shù)濃度約為8 000、1 333、222、37、6、1 copies/μL。當(dāng)其含量高達(dá)8 000 copies/μL即擴(kuò)增體系中DNA濃度高達(dá)80 ng時(shí)，6 次重復(fù)的RSD高于25%，而其余幾個(gè)濃度梯度，即使DNA含量低至1 copies/μL，6 次重復(fù)的RSD仍低于25%（表2），即本研究中克螟稻定量體系中最適DNA添加量在10 pg～13 ng之間。

表 2 克螟稻定量體系模板優(yōu)化Table 2 Optimization of genomic DNA concentration in the quantitative system

當(dāng)數(shù)字PCR擴(kuò)增退火溫度分別為58、60、62 ℃和64 ℃時(shí)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%的克螟稻轉(zhuǎn)基因相對(duì)含量分別為99.29%、100.36%、100.43%、97.39%，所有擴(kuò)增樣品均能有效區(qū)分陰性和陽(yáng)性微滴點(diǎn)（圖3）。雖然當(dāng)退火溫度為60 ℃時(shí)偏差最小，但統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示這4 組數(shù)據(jù)無(wú)顯著性差異（P＞0.05），即退火溫度在58～64 ℃之間時(shí)，對(duì)定量結(jié)果無(wú)顯著性影響。

圖 3 克螟稻定量體系PCR退火溫度優(yōu)化Fig. 3 Optimization of annealing temperature for GM rice KMD in digital PCR

以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%的轉(zhuǎn)基因克螟稻大米樣品為模板，根據(jù)優(yōu)化條件，在模板含量為10 ng DNA，退火溫度為60 ℃時(shí)，比較分開(kāi)擴(kuò)增sps基因和克螟稻品系特異性基因的兩個(gè)單重?cái)?shù)字PCR體系與兩個(gè)基因合并后的雙重?cái)?shù)字PCR擴(kuò)增體系定量結(jié)果。單重?cái)U(kuò)增后定量得到的克螟稻轉(zhuǎn)基因相對(duì)含量均值為100.11%，RSD為1.74%（圖4a），而雙重體系的相對(duì)含量均值為99.93%，RSD為3.59%（圖4b）。兩種方法定量偏差及多次重復(fù)的RSD均遠(yuǎn)小于25%，符合目前國(guó)際最嚴(yán)格的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)和歐盟定量方法要求[28-29]，即兩種方法均適用于克螟稻大米樣品的定量。為節(jié)約試劑和時(shí)間成本，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，均采用雙重?cái)?shù)字PCR擴(kuò)增體系進(jìn)行研究。

圖 4 單重?cái)?shù)字PCR與雙重?cái)?shù)字PCR擴(kuò)增結(jié)果比較Fig. 4 Comparison of amplification results between singplex and duplex digital PCR

圖 5 100%克螟稻轉(zhuǎn)基因大米在芯片式數(shù)字PCR平臺(tái)上擴(kuò)增Fig. 5 Amplification of KMD GM rice genes on the chip-based digital PCR platform

轉(zhuǎn)基因克螟稻定量方法在芯片式數(shù)字PCR平臺(tái)上的適用性利用已優(yōu)化的微滴式數(shù)字PCR擴(kuò)增條件，分別將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%的克螟稻大米樣品在微流體芯片式數(shù)字PCR平臺(tái)Bio-Mark?和QuantStudio? 3D上進(jìn)行擴(kuò)增，分別得到其內(nèi)源基因與外源基因的實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線（圖5）。Bio-Mark?數(shù)字PCR平臺(tái)上內(nèi)外源基因各自的765 個(gè)反應(yīng)倉(cāng)Ct值均較為集中，表明所有微孔均得到了較好的擴(kuò)增，這也使得定量結(jié)果準(zhǔn)確可靠（圖5a、b），相對(duì)含量為103.26%，3 次重復(fù)的RSD僅為1.7%，定量準(zhǔn)確性和精密度均較為理想。QuantStudio? 3D微流體芯片式數(shù)字PCR平臺(tái)對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%的標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行芯片式數(shù)字PCR定量檢測(cè)時(shí)，內(nèi)外源基因所產(chǎn)生的陰性點(diǎn)和陽(yáng)性點(diǎn)分離較好，無(wú)中間模糊區(qū)（圖5c、d），相對(duì)含量為99.43%，3 次重復(fù)的RSD僅為1.7%。表明本研究所建立的微滴式數(shù)字PCR定量方法在其他微流控芯片式數(shù)字PCR平臺(tái)上也能正常擴(kuò)增，本方法適用性較好。

2.3 轉(zhuǎn)基因克螟稻定量絕對(duì)靈敏度和線性范圍

將克螟稻轉(zhuǎn)基因大米DNA溶液按多倍梯度稀釋時(shí)，在1～1 000 copies/μL的整個(gè)稀釋梯度中，sps與克螟稻品系特異性基因RSD分別在0.63%～2.62%和0.96%～3.62%之間，所有稀釋梯度的RSD均符合國(guó)際要求[29]。其內(nèi)外源基因稀釋梯度理論值和實(shí)際值線性相關(guān)，R2分別為1和0.999 8。該體系所檢測(cè)的濃度梯度均具有很好的線性關(guān)系，并且與理論拷貝數(shù)相符，該檢測(cè)體系能夠?qū)康椭? copies/μL的轉(zhuǎn)基因克螟稻進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

2.4 轉(zhuǎn)基因克螟稻數(shù)字PCR定量結(jié)果與實(shí)時(shí)熒光PCR方法定量結(jié)果比較

運(yùn)用已建立的數(shù)字PCR方法，分別在QX200?微滴式數(shù)字PCR平臺(tái)、QuantStudio? 3D微流體芯片式數(shù)字PCR平臺(tái)及實(shí)時(shí)熒光PCR平臺(tái)上定量分析轉(zhuǎn)基因質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%、1%、5%的克螟稻轉(zhuǎn)基因大米樣品，將三者結(jié)果進(jìn)行比較分析。所有平臺(tái)定量結(jié)果的3 次重復(fù)RSD均小于25%，表明所有操作重復(fù)性較好。微滴式和芯片式數(shù)字PCR平臺(tái)上3 個(gè)梯度轉(zhuǎn)基因大米樣品定量偏差在-0.204%～7.203%之間（表3），即使是針對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的克螟稻轉(zhuǎn)基因大米樣品，該方法在不同平臺(tái)上的定量結(jié)果精密度和準(zhǔn)確性仍然符合要求。表明本研究建立的數(shù)字PCR方法對(duì)克螟稻的定量檢測(cè)靈敏度可達(dá)0.1%。

利用實(shí)時(shí)熒光PCR方法對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)同樣為0.1%、1%、5%克螟稻樣品進(jìn)行定量時(shí)，內(nèi)外源基因的實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增效率分別為107.34%和99.62%，符合90%～110%的范圍[30]且內(nèi)外源基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線R2都達(dá)到0.99以上。根據(jù)各組數(shù)據(jù)RSD可知，本研究中實(shí)時(shí)熒光PCR的實(shí)驗(yàn)操作重復(fù)性較好，且內(nèi)外源基因PCR擴(kuò)增效率及標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)性也符合要求，而3 個(gè)梯度轉(zhuǎn)基因大米樣品的定量值其與實(shí)際值偏差分別為29.942%、25.426%及-6.738%（表3），遠(yuǎn)大于微滴式及芯片式數(shù)字PCR的偏差，尤其是0.1%和1%的克螟稻樣品定量偏差均已超過(guò)目前國(guó)際通用的定量方法要求[29]。而數(shù)字PCR即使針對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的樣品，其偏差最大也僅為7.203%，符合轉(zhuǎn)基因定量中偏差在25%以?xún)?nèi)的要求[28-29]。因此，數(shù)字PCR的定量準(zhǔn)確性及靈敏度要好于實(shí)時(shí)熒光PCR，尤其是針對(duì)低含量的克螟稻成分進(jìn)行定量時(shí)，數(shù)字PCR的結(jié)果更為可靠。

表 3 不同含量的克螟稻數(shù)字PCR及實(shí)時(shí)熒光PCR定量檢測(cè)結(jié)果Table 3 Quantitative results of different contents of KMD GM rice by digital PCR and real-time PCR%

3 討論與結(jié)論

雖然數(shù)字PCR技術(shù)將DNA模板進(jìn)行稀釋分布到大量的獨(dú)立反應(yīng)室中進(jìn)行單獨(dú)擴(kuò)增，極大降低了反應(yīng)間的相互抑制，提高了反應(yīng)效率，但也有研究表明DNA純化方法等條件優(yōu)化措施會(huì)對(duì)定量結(jié)果產(chǎn)生較大的影響[24,31]。因此本研究對(duì)最能影響克螟稻定量反應(yīng)體系的因素如模板濃度、退火溫度及單雙重反應(yīng)的差異等情況均進(jìn)行研究，建立適用于克螟稻品系特異性轉(zhuǎn)基因成分定量的最優(yōu)條件。還有研究表明模板DNA的片段長(zhǎng)度會(huì)影響模板的均勻分布，進(jìn)而影響定量結(jié)果[11]，本研究分析隨機(jī)酶切、超聲等方式斷裂大米基因組DNA對(duì)數(shù)字PCR定量結(jié)果的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)DNA濃度在合適范圍內(nèi)時(shí)，各種處理后的定量結(jié)果與對(duì)照相比，其差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（數(shù)據(jù)未列出），即大米基因組DNA無(wú)需斷裂處理也可得到較為理想的定量結(jié)果。但此結(jié)果僅適用于克螟稻等轉(zhuǎn)基因大米品系的定量研究，對(duì)于其他轉(zhuǎn)基因作物，尤其是小麥等基因組較大的作物，在對(duì)樣品精準(zhǔn)定量前還需對(duì)數(shù)字PCR的各種條件逐一進(jìn)行優(yōu)化。

在轉(zhuǎn)基因定量中考慮測(cè)量值的不確定度很有必要，由于對(duì)一些影響因素缺少定量描述，因此在轉(zhuǎn)基因成分定量檢測(cè)的不確定度分析方面還沒(méi)有一個(gè)通行的成熟方法，歐盟聯(lián)合研究中心推薦采用循環(huán)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行某一轉(zhuǎn)基因定量方法的不確定度評(píng)估[32]，在缺乏循環(huán)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)時(shí)，可以利用現(xiàn)有數(shù)據(jù)依據(jù)國(guó)家計(jì)量技術(shù)規(guī)范[33]和文獻(xiàn)[30,34]方法對(duì)定量的不確定度進(jìn)行分析。由于數(shù)字PCR無(wú)需標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣品進(jìn)行定量，由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性、穩(wěn)定性、稀釋梯度及標(biāo)準(zhǔn)曲線等因素帶來(lái)的不確定度均無(wú)需考慮，這也是利用實(shí)時(shí)熒光PCR定量檢測(cè)轉(zhuǎn)基因成分時(shí)最能影響不確定度的部分[35]。此外，數(shù)字PCR為終點(diǎn)讀取，PCR擴(kuò)增效率的不確定度理論上也可排除在外。因此除取樣的不確定度之外，僅需考慮稀釋梯度、批內(nèi)重復(fù)、儀器示值等的不確定度即可。

轉(zhuǎn)基因含量通常以質(zhì)量、體積或者單位個(gè)數(shù)（顆粒、DNA以及蛋白分子等）的形式描述純的轉(zhuǎn)基因成分的質(zhì)量與相應(yīng)成分的總質(zhì)量之比。數(shù)字PCR是通過(guò)絕對(duì)定量方法測(cè)定目的基因在樣本中的拷貝數(shù)，通過(guò)內(nèi)外源基因的拷貝數(shù)之比得到轉(zhuǎn)基因成分的含量。在目標(biāo)基因?yàn)閱慰截惒迦氲霓D(zhuǎn)基因品系中，所得內(nèi)外源基因拷貝數(shù)之比即為轉(zhuǎn)基因含量百分比。若目標(biāo)基因?yàn)槎嗫截惒迦牖驑颖緸橛H本雜交后代，該比值作為相對(duì)定量結(jié)果將不夠準(zhǔn)確，需作進(jìn)一步換算。對(duì)于定量中的內(nèi)源基因，首先要選擇低拷貝且拷貝數(shù)可穩(wěn)定遺傳的基因，由于單拷貝基因相對(duì)于多拷貝基因來(lái)說(shuō)更加穩(wěn)定，在不同作物栽培種中的突變率更低[36]，更加適合用作轉(zhuǎn)基因成分定量中的內(nèi)源基因。而轉(zhuǎn)基因定量分析中的外源基因選擇時(shí)，單拷貝的特異邊界序列是首選，尤其是當(dāng)檢測(cè)樣品為混合產(chǎn)品時(shí)，對(duì)每一品系分別進(jìn)行定量，得到的轉(zhuǎn)基因成分含量比利用某一外源篩選元件進(jìn)行定量得到的結(jié)果要更為準(zhǔn)確。但也有研究指出以多拷貝基因?yàn)閷?duì)象的檢測(cè)由于原始材料中基因的拷貝數(shù)高使得檢測(cè)靈敏度更高[37]。本研究中大米內(nèi)源基因sps和克螟稻品系特異性基因均為穩(wěn)定遺傳的單拷貝基因，因此內(nèi)外源基因拷貝數(shù)之比可直接轉(zhuǎn)換為克螟稻轉(zhuǎn)基因成分含量。

轉(zhuǎn)基因標(biāo)識(shí)制度的有效實(shí)施依賴(lài)于科學(xué)可靠的轉(zhuǎn)基因定量檢測(cè)方法。本研究結(jié)果表明，基于數(shù)字PCR的定量方法可準(zhǔn)確檢測(cè)樣品中的從0.1%～100%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的克螟稻轉(zhuǎn)基因大米成分，尤其是在對(duì)低含量克螟稻轉(zhuǎn)基因大米成分的定量中，方法的精密度和準(zhǔn)確性均高于目前常用的實(shí)時(shí)熒光PCR方法，可以滿(mǎn)足轉(zhuǎn)基因標(biāo)識(shí)需求，也為我國(guó)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識(shí)閾值的設(shè)定提供了一定的借鑒依據(jù)。