張新娜，馬麗艷,2,*，潘賽超，張春嬌，張永新，周 昉，黃昆侖,2，戴蘊(yùn)青,2

（1.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（北京），北京 100083；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

真菌毒素是一類由絲狀真菌在適宜條件下產(chǎn)生的有毒次級(jí)代謝產(chǎn)物[1]，迄今發(fā)現(xiàn)已有400多種真菌毒素[2]，是繼農(nóng)藥殘留、重金屬污染后，影響糧食質(zhì)量安全的又一類關(guān)鍵風(fēng)險(xiǎn)因子。當(dāng)前發(fā)現(xiàn)的主要威脅人類和動(dòng)物健康的真菌毒素種類有黃曲霉毒素（aflatoxins，AF）、赭曲霉毒素A（ochratoxin，OTA）、伏馬毒素（fumonisins，F(xiàn)B）、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）、HT-2毒素、T-2毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）、橘毒素、展青霉素、鏈格孢霉毒素等[3-4]。大量研究表明，真菌毒素可致DNA損傷，低濃度下即可對(duì)人和動(dòng)物健康造成危害，使肝臟、腎臟和胃腸道發(fā)生病變，有些毒素還具有致癌、致畸、致突變等毒性[5-6]。

雜糧豆類是除大豆之外的小宗淀粉質(zhì)豆類的總稱，主要包括綠豆、豌豆、蠶豆、紅小豆、扁豆、豇豆、蕓豆、鷹嘴豆等[7]。雜糧豆類有一定的營(yíng)養(yǎng)、保健和藥用價(jià)值，隨著飲食習(xí)慣和膳食結(jié)構(gòu)的變化，人們對(duì)雜糧豆類的需要越來(lái)越多[8]。目前，糧食中真菌毒素的危害已經(jīng)引起廣泛重視，但是對(duì)雜糧豆類產(chǎn)品，由于產(chǎn)地分散，產(chǎn)量規(guī)模小，其安全問題還未引起足夠的重視。但是，已有研究表明，在雜糧豆類的生長(zhǎng)過(guò)程中易受到豆類根腐病、細(xì)菌性葉斑病、灰斑病、銹病、蕎麥鉤翅蛾等為主的病蟲害的危害，從而影響產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量、埋下食品安全隱患[9]。目前對(duì)糧谷的真菌毒素報(bào)道很多[10-14]，對(duì)豆類的研究主要集中在大豆上，在其他雜糧豆類中的研究較少[15-17]。Castillo等[18]研究發(fā)現(xiàn)黑豆可能存在鏈格孢霉毒素、ZEN和單端孢霉烯族毒素的污染風(fēng)險(xiǎn)。Tseng等[19-20]在白豆中檢測(cè)到蛇形霉素、ZEN、T-2和FB1、AFB1、AFB2、AFG1、AFG2，赤豆和綠豆中檢測(cè)到了FB1。Iha等[21]則發(fā)現(xiàn)不同加工處理過(guò)程可以減少黑白斑豆中OTA的污染水平。

真菌毒素的檢測(cè)方法主要有薄層色譜法、氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法、酶聯(lián)免疫吸附法、高效液相色譜法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等[22-30]。目前國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中測(cè)定真菌毒素的方法多針對(duì)某種或某類毒素，樣品的前處理方法多采用固相萃取柱、真菌毒素專用凈化柱或免疫親和柱凈化，選擇性較強(qiáng)[31-34]。由于真菌毒素的種類較多，且同一樣品可能污染多種真菌毒素，建立多種毒素同時(shí)測(cè)定的方法對(duì)于全面掌握真菌毒素的污染狀況非常必要。高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用具有高選擇性和靈敏度，可以同時(shí)檢測(cè)多種化合物，在真菌毒素檢測(cè)中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。與常見的小麥、稻谷、玉米等糧谷類樣品相比，紅豆、綠豆、黑豆等雜糧豆類中在色素、蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物等的含量有一定的差異，在質(zhì)譜中基質(zhì)對(duì)毒素離子化效果會(huì)產(chǎn)生一定的影響。因此，本實(shí)驗(yàn)針對(duì)雜糧豆類中易感染的真菌毒素，通過(guò)優(yōu)化提取溶劑、提取時(shí)間、凈化方式等，建立高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)檢測(cè)多種真菌毒素的方法，為更好地監(jiān)控雜糧豆類中真菌毒素的污染狀況、實(shí)施質(zhì)量安全監(jiān)管、指導(dǎo)消費(fèi)者安全膳食提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅豆、綠豆和黑豆等樣品分別購(gòu)自北京市、河北省大型連鎖超市，以及北京市及河北省縣級(jí)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、OTA、T-2毒素、DON、FB1、FB2、FB3、ZEN、MycoSep 226多功能凈化柱美國(guó)Romer公司；乙腈、甲醇（均為色譜純） 北京百靈威科技有限公司；C18吸附劑 安捷倫科技（中國(guó)）有限公司；Florisil吸附劑 天津博納艾杰爾科技有限公司；超純水（Millpore純水儀制備）。

1.2 儀器與設(shè)備

6460高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國(guó)安捷倫科技有限公司；渦旋振蕩器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；YP5002電子天平 上海越平科學(xué)儀器有限公司；HC-3018離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

豆類樣品混合均勻，用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)40 目篩。

稱取研磨好的樣品5.0 g（精確到0.01）于50 mL離心管中，加入15.0 mL甲醇-水（70∶30，V/V），渦旋振蕩3 min，在8 000 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至干凈容器中，再次向樣品中加入10.0 mL乙腈-水（84∶16，V/V），渦旋振蕩3 min，8 000 r/min離心5 min，合并上清液，混勻，取1 mL提取液于2 mL離心管中，加入30 mg C18吸附劑，渦旋30 s后離心，上清液過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，待測(cè)。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：Agilent Proshell 120 EC-C18（3.0 mm×100 mm，2.7 μm）；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸溶液；B為乙腈；梯度洗脫程序：20% B保持1 min；5 min變?yōu)?5% B；8 min變?yōu)?5% B；保持2 min；10.01 min變?yōu)?0% B保持6 min；柱溫30 ℃；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量2.0 μL。

1.3.3 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源，正負(fù)模式切換；檢測(cè)方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；離子源溫度350 ℃；干燥器溫度350 ℃；干燥器流速10 L/min；鞘氣溫度300 ℃；鞘氣流速11 L/min；毛細(xì)管電壓3 500 V；碰撞氣為N2。

采用直接進(jìn)樣的方式，將一定濃度的真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液注入高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜中進(jìn)行質(zhì)譜條件優(yōu)化，確定多反應(yīng)監(jiān)測(cè)參數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)以平均值表示，采用Excel 2013軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

分別在正離子和負(fù)離子模式下進(jìn)行母離子掃描，設(shè)置掃描范圍為200～800 u，確定不同模式下化合物的響應(yīng)值。確定母離子后，進(jìn)行子離子掃描，優(yōu)化碰撞電壓。優(yōu)化結(jié)果表明，ZEN在負(fù)模式下靈敏度較高，其他化合物在正模式下靈敏度較高，11 種真菌毒素多反應(yīng)監(jiān)測(cè)質(zhì)譜參數(shù)見表1，11 種真菌毒素基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖見圖1。

表 1 11 種真菌毒素的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Multiple reaction monitoring parameters for 11 mycotoxins

圖 1 11 種真菌毒素基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液總離子流圖Fig. 1 Total ion current chromatograms of matrix standard solution of 11 mycotoxions

2.2 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)比較5 種提取溶液的提取效果，提取液分2 次提取，結(jié)果見圖2。

圖 2 溶劑對(duì)真菌毒素提取效果的影響Fig. 2 Recovery rates of mycotoxins in different extraction solvents

大多數(shù)真菌毒素易溶于有機(jī)溶劑。乙腈和甲醇是目前最常用的兩種提取溶劑，它們常與一定比例的水組合來(lái)提取不同極性的真菌毒素。乙腈-水（84∶16，V/V）是常用的組合，可用于AF、ZEN、DON等毒素的提 取[31,33,35]。 從 圖2可 以 看 出 ，利用乙腈-水（84∶16， V/V）提取時(shí)，除FB1外，其他真菌毒素的回收率均能達(dá)到80%以上，這與B族FB的分子含有羧基基團(tuán)，極性較強(qiáng)，在該提取溶劑溶解性差有關(guān)。在乙腈、甲醇和水3 種溶劑中，極性最大的為水，其次是甲醇，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨著體系中甲醇比例的提高，對(duì)FB的提取率逐漸增加，但對(duì)其他真菌毒素，特別是AFB1的提取率有所下降?？紤]到不同真菌毒素的極性差異，實(shí)驗(yàn)采用分步提取的方式進(jìn)行提取，先用甲醇-水（70∶30，V/V）溶劑體系進(jìn)行第1次提取，將FB等高極性的化合物提取出來(lái)，再用乙腈-水（84∶16，V/V）體系進(jìn)行第2次提取，將AF等充分提取，從圖2可以看出，經(jīng)過(guò)雙體系聯(lián)合提取后，11 種真菌毒素均達(dá)到理想的提取效果。

2.2.2 提取時(shí)間優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)分別比較提取1、2、3、4 min的提取效果，結(jié)果表明，提取時(shí)間為1 min時(shí)DON、FB1、OTA和ZEN的回收率小于60%；提取時(shí)間為2 min時(shí)，除FB1外，回收率均超過(guò)了70%；當(dāng)提取時(shí)間為3 min時(shí)，所有真菌毒素的回收率均大于70%，延長(zhǎng)提取時(shí)間為4 min時(shí)，回收率無(wú)明顯提高，而提取時(shí)間的延長(zhǎng)可能會(huì)使化合物分解或產(chǎn)生變化[13]。因此，實(shí)驗(yàn)確定提取時(shí)間為3 min。

2.2.3 凈化方式優(yōu)化

在毒素的提取過(guò)程中樣品中的碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪、色素等組分也部分被提取，不僅會(huì)影響痕量目標(biāo)物的檢測(cè)，也會(huì)對(duì)色譜、質(zhì)譜系統(tǒng)造成污染。為降低基質(zhì)效應(yīng)，需要對(duì)提取液進(jìn)行凈化。MycoSep 226多功能凈化柱在多組分真菌毒素的分析中應(yīng)用較多[35-36]，F(xiàn)lorisil和C18吸附劑對(duì)脂類、非極性干擾物有一定的吸附作用。實(shí)驗(yàn)比較MycoSep 226多功能凈化柱、Florisil和C18吸附劑的凈化效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)提取液經(jīng)MycoSep 226多功能凈化柱凈化后，F(xiàn)B1和OTA被吸附無(wú)法檢測(cè)到，這與劉丹等[36]的研究一致。提取液中加入30 mg吸附劑凈化后，F(xiàn)lorisil對(duì)FB1有一定的吸附，而C18的凈化效果良好，除FB1和ZEN的回收率在80%左右外，其他毒素的回收率均達(dá)90%以上，凈化后效果良好。Sun Juan等[37]在研究谷物中多種毒素的提取方法時(shí)也發(fā)現(xiàn)C18吸附劑凈化后，大多數(shù)真菌毒素的回收率為60.0%～101.7%，結(jié)果較為滿意。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨著C18吸附劑加入量的增加，也會(huì)對(duì)FB1和ZEN有一定的吸附，因此本實(shí)驗(yàn)采取30 mg C18進(jìn)行凈化處理。

2.2.4 線性關(guān)系、檢出限和定量限測(cè)定

分別吸取不同濃度的真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，用空白基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，按建立好的方法進(jìn)行質(zhì)譜分析，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，定量離子的響應(yīng)值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以3 倍信噪比計(jì)算方法的檢出限。標(biāo)準(zhǔn)溶液的線性范圍、相關(guān)系數(shù)及檢出限見表2。

表 2 11 種真菌毒素的線性范圍、相關(guān)系數(shù)和檢出限Table 2 Linear ranges, correlation coefficients (r) and LODs of 11 mycotoxins

從表2可以看出，不同真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線的質(zhì)量濃度范圍有一定差異，主要考慮了真菌毒素的限量水平、儀器的響應(yīng)值、實(shí)際陽(yáng)性樣品的含量范圍等因素。11 種真菌毒素在各種范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)在0.999 0～0.999 9之間。GB 2761—2017《食品中真菌毒素限量》中規(guī)定了食品中6 種真菌毒素的限量，其中涉及豆類及其制品有AFB1和OTA，其限量均為5 μg/kg；涉及谷物及其制品中有DON和ZEN，限量分別為1 000 μg/kg和60 μg/kg，目前尚未對(duì)FB和T-2毒素制定限量標(biāo)準(zhǔn)。歐盟對(duì)直接食用的玉米中FB的限量為1 000 μg/kg；對(duì)其他谷物中T-2的限量為50 μg/kg[38]，從已有的限量看，本實(shí)驗(yàn)建立的方法能滿足食品中真菌毒素殘留限量的測(cè)定要求。

2.2.5 方法的準(zhǔn)確度和精密度

采用添加回收的方法測(cè)定方法的準(zhǔn)確度。分別向空白樣品中添加不同濃度的真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，按確定好的方法提取、凈化、分析，加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表 3 11 種真菌毒素的加標(biāo)回收率（n= 6）Table 3 Recoveries and relative standard deviations of 11 mycotoxins from spiked samples (n= 6)

從表3可以看出，11 種真菌毒素在2.50、5.00、25.0 μg/kg三個(gè)添加水平的回收率在70.0%～108%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）在1.3%～8.6%之間，符合GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范基本信息 食品理化檢測(cè)》中的相關(guān)要求。

2.2.6 雜糧豆類中真菌毒素的檢測(cè)

利用建立的方法對(duì)黑豆（12 份）、綠豆（13 份）、紅豆（12 份）共37 份樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)6 份樣品中檢出真菌毒素，陽(yáng)性率為16.2%，所檢測(cè)到的真菌毒素均為ZEN殘留，其中綠豆樣品2 份、紅豆樣品4 份。

綠豆樣品中ZEN檢出陽(yáng)性率為15.4%，平均含量3.4 μg/kg，該含量均低于谷物及其制品中規(guī)定的ZEN的限量值。紅豆樣品中ZEN檢出陽(yáng)性率為33.3%，其中有兩份樣品含量較高，分別為270 μg/kg和764 μg/kg，超過(guò)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中ZEN的限量值（60 μg/kg）4～12 倍，應(yīng)當(dāng)引起注意。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立甲醇-水（70∶30，V/V）、乙腈-水（84∶16，V/V）兩種溶劑體系聯(lián)合提取，C18吸附劑凈化，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)檢測(cè)雜糧豆類中的11 種真菌毒素的方法。該方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確度高可用于真菌毒素的快速檢測(cè)。對(duì)雜糧豆類中真菌毒素檢測(cè)結(jié)果表明，該類食品中存在一定的安全隱患，希望相關(guān)部門給予重視、進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，制定相應(yīng)的政策和措施，以保障餐桌上的食品安全。