肖 慧，孫 柯，屠 康，潘磊慶*

（南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

果蔬品質(zhì)安全檢測主要包括對果蔬外部品質(zhì)、內(nèi)部品質(zhì)及食用安全性的測定及評估，其中果蔬的內(nèi)部品質(zhì)檢測是果蔬流通中的重要環(huán)節(jié)之一[1]。傳統(tǒng)的果蔬內(nèi)部品質(zhì)檢測方法主要是抽樣進行破壞性實驗，檢測成本高，而且測量每種參數(shù)都需要進行不同的實驗，不能夠滿足果蔬快速分級分選及品質(zhì)指標預測的現(xiàn)實要求。同時，傳統(tǒng)的品質(zhì)檢測方法無法完成多指標同時檢測，耗時耗力[2-4]。現(xiàn)如今，越來越多的無損檢測技術被應用于果蔬的品質(zhì)檢測中，其中，近紅外光譜技術備受關注。近紅外光譜的光譜區(qū)域范圍為800～2 500 nm，該譜區(qū)承載的分析信息主要是分子含氫基團振動的倍頻和合頻，因此可充分利用全譜或多波長下的光譜數(shù)據(jù)進行定性或定量分析[5]?，F(xiàn)代近紅外光譜分析是光譜測量技術、計算機技術、化學計量學技術與基礎測試技術的有機結(jié)合，通過將近紅外光譜所反映樣品基團、組成或物態(tài)信息與用標準或認可的參比方法測得的組成或性質(zhì)數(shù)據(jù)采用化學計量學技術建立校正模型，然后通過對未知樣品光譜的測定和建立的校正模型完成快速預測其組成或性質(zhì)的一種分析方法[6]。

近年來，近紅外檢測技術作為一種無損、快速分析和評估各類食品質(zhì)量與安全的方法，得到了廣泛認可。近紅外光譜技術發(fā)展迅速，微型化的光譜儀已成為快速分析研究的重點，因其具備體積小、重量輕、價格低和高性能等特點，為現(xiàn)代食品、藥品、日用品等領域的快速檢測提供了有力的支撐[7]。同時因近幾年光譜技術的迅猛發(fā)展，實現(xiàn)該技術的硬件更為多樣，使得設計開發(fā)不同用途的近紅外儀器更易于實現(xiàn)，其中針對不同樣品的專用檢測設備成為現(xiàn)今近紅外應用的熱點，是將近紅外研究由理論轉(zhuǎn)為應用的關鍵一步，對于促進近紅外技術的發(fā)展有極其重要的作用。郭志明等[8]基于新型光譜儀微機電系統(tǒng)開發(fā)了果蔬品質(zhì)手持式近紅外設備，能完成對番茄中可溶性固形物含量（soluble solids content，SSC）及番茄紅素的預測。馮幫等[9]利用線性漸變?yōu)V光片作為分光原理開發(fā)了小型近紅外檢測系統(tǒng)。聞明等[10]研制了以發(fā)光二極管為近紅外光源的整粒小麥成分快速分析儀器。王凡等[11]基于可見-近紅外光譜技術開發(fā)的便攜式番茄多品質(zhì)檢測裝置可對番茄的顏色、硬度、總酸、總糖實現(xiàn)快速無損的同時檢測。李倩倩等[12]利用自搭建的獼猴桃SSC便攜式無損檢測系統(tǒng)對多個品種的獼猴桃糖度進行了預測。尹慧敏等[13]設計開發(fā)的便攜式谷物成分近紅外檢測儀對水稻的測試實驗中得到蛋白質(zhì)的預測與真實值相關系數(shù)為0.747 1，其結(jié)果進一步證明了便攜式食品近紅外檢測儀的可行性。

葡萄的采后處理、品質(zhì)鑒定檢測一直是農(nóng)產(chǎn)品加工研究的重要課題，采用近紅外光譜技術建立的葡萄品質(zhì)預測模型良好，F(xiàn)ernanez-Novales等[14]利用光纖型近紅外光譜儀研究白葡萄酒發(fā)酵液中的干物質(zhì)及糖分變化，Nogales-Bueno等[15]利用近紅外光譜確定葡萄的成熟度，Hernandez-Hierro等[16]基于近紅外光譜信息研究葡萄成熟過程總的花青素變化，Urraca等[17]利用手持式近紅外設備對田間整穗葡萄的糖度檢測實驗，結(jié)果表明便攜式近紅外設備對田間葡萄穗品質(zhì)檢測的可行性。本實驗主要研究基于光纖可見-近紅外技術的低成本、小型葡萄專用品質(zhì)預測儀器的開發(fā)，并選用“美人指”和“白玉霓”兩個品種對儀器進行驗證實驗。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

圖 1 “美人指”葡萄（A）及“白玉霓”葡萄（B）Fig. 1 Manicure Finger (A) and Ugni Blanc (B)

“美人指”葡萄（Vitis vinifera L. cv. Manicure Finger）和白色的“白玉霓”葡萄（Vitis vinifera L. cv.Ugni Blanc）（如圖1所示，采集不同成熟期的每種葡萄各200 粒），采自江蘇南京八卦洲（32°5′N，118°8′E，南京）。

圖 2 葡萄品質(zhì)可見-近紅外檢測儀器Fig. 2 Vis-NIR instrument for examining grape quality

圖 3 工作流程圖Fig. 3 Flow chart of the working process

沒食子酸標準品、HCl、乙醇均為分析純。

1.2 儀器與設備

PAL-1手持糖度儀 日本愛拓公司；Ci6X手持色差儀美國愛色麗公司；UV 1800紫外分光光度計 日本島津公司；FX2000型光譜儀、FIB-Y-200-NIR光纖、HL2000光源、STD-WS校正白板 上海復享公司；Surface Pro3平板電腦 美國微軟公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄品質(zhì)近紅外快速檢測系統(tǒng)硬件

1.3.1.1 葡萄品質(zhì)近紅外快速檢測系統(tǒng)工作原理

本研究設計的葡萄品質(zhì)可見-近紅外檢測儀器，采用漫反射模式獲取整粒葡萄漿果的可見-近紅外光譜（400～1 100 nm），光纖傳輸將攜帶葡萄品質(zhì)信息的光信號輸入光譜儀后經(jīng)數(shù)據(jù)采集卡，進行模數(shù)轉(zhuǎn)換（A/D）后傳輸?shù)狡桨咫娔X，最后在平板電腦上完成光譜的還原及數(shù)據(jù)處理。儀器硬件部分主要包括：光源、光纖光譜儀、傳輸光纖、樣品池、掌上電腦和殼體，如圖2所示。儀器工作流程如圖3所示。

1.3.1.2 光譜采集模塊

市售的光譜儀根據(jù)分光系統(tǒng)的不同大致可分為傅里葉變換型、聲光可調(diào)濾光型、濾光片型、光柵型4 大類。分光系統(tǒng)的性能決定近紅外光譜儀包括光譜分辨率、波長準確性和波長重復性在內(nèi)的多個核心參數(shù)[18]。波長范圍是選擇光譜儀的重要參考衡量指標之一，而波長范圍的選擇因測試樣品種類、狀態(tài)、需預測的指標的不同而不同，對于葡萄而言，Beghi等[19]曾利用可見-近紅外光譜對葡萄的植物檢疫狀態(tài)進行預測評估，Martinez-Sandoval等[20]使用近紅外高光譜對單粒葡萄果粒的花青素含量進行建模預測。Kemps等[21]利用可見-近紅外光譜對多個葡萄品種中包含花青素、多酚含量、總糖含量及硬度在內(nèi)的多個指標進行建模預測，在本儀器中，考慮成本、穩(wěn)定性、建模可靠性等多個因素后，選擇400～1 100 nm作為指標檢測的建模波段。

微型光纖光譜儀一般采用衍射光柵作為分光系統(tǒng)，影響分光效果的主要因素是光柵的角色散和線色散參數(shù)，光柵的色散越大，分光效果越好。為提高光譜儀的光學特性，很多光譜儀采用非對稱交叉式Czemy-Turner結(jié)構(gòu)，但該結(jié)構(gòu)較為復雜，且依然存在雜散光水平較高的問題[22]。本系統(tǒng)選用微型光纖光譜儀作為系統(tǒng)的核心器件，新型全息凹面光柵使用了非等距分布的的凹槽，沒有鬼線，雜散光很低，使光柵分光系統(tǒng)的光學性能有較大提升，同時降低了系統(tǒng)復雜度，具備光路簡潔、體積小、便于安裝等優(yōu)點[23]。

該光譜儀的原理是光源發(fā)出的光先經(jīng)過樣品池，再由光柵分光，光柵不需轉(zhuǎn)動，經(jīng)光柵色散的光聚焦在多通道檢測器的焦面上，同時被檢測。在可見-短波近紅外區(qū)域使用電荷耦合器件作為檢測器，通道數(shù)達2 048 個，可獲得很好的分辨率。由于檢測器對所有波長的單色光同時檢測，掃描速率大大提升，在1 s內(nèi)可完成上百次的掃描累加，從而得到較高的信噪比和靈敏度。

1.3.1.3 光源及光傳輸模塊

光源的發(fā)光范圍決定了光譜儀的工作波長范圍，對近紅外儀器中的光源系統(tǒng)的基本要求是能在測量譜區(qū)內(nèi)保證足夠的光強和穩(wěn)定性，以保證光譜的穩(wěn)定性。本系統(tǒng)采用鹵素燈，鹵素燈光源同時包含可見光區(qū)域和近紅外光區(qū)域，能滿足可見-近紅外光譜儀的需求，同時性能穩(wěn)定。

本系統(tǒng)中的光傳輸通過低OH的Y型石英光纖傳導，適合于漫反射模式，光纖利用全反射的原理把光約束在其界面內(nèi)，并引導光波沿著光軸線的方向前進[24]。Y型光纖雙頭端的一頭連接光源，將光源發(fā)出的光傳輸至單頭端，光從單頭端發(fā)出照射到樣品后與樣品作用，漫反射的光被單頭端接收傳輸至雙頭端的另一頭進入光譜儀被分析。

1.3.1.4 樣品池模塊

考慮到檢測對象為單粒葡萄漿果，檢測光纖頭與葡萄漿果表面的距離直接影響樣本光譜的可靠性。實驗發(fā)現(xiàn)，光纖頭貼近樣本表面的測量方式能最大程度降低照射光斑不一樣帶來的實驗誤差。由于不同品種的葡萄果粒之間存在形狀和大小的差異，為滿足不同品種葡萄的測定需求，本系統(tǒng)設計了可調(diào)式支撐模塊，用于調(diào)整不同大小的樣品表面至光纖檢測端的距離，保持光斑大小一致，如圖4所示。通過調(diào)節(jié)帶有內(nèi)螺紋的樣品架控制樣品表面距離光纖端口的距離，極大地減小了由于光斑大小不一致帶來的實驗誤差。

圖 4 葡萄測定專用樣品池Fig. 4 Designed sample cuvette for grape berries

1.3.2 便攜式葡萄多品質(zhì)無損檢測儀器軟件開發(fā)

軟件系統(tǒng)包括：黑白背景校正、干涉圖數(shù)據(jù)采集、光譜顯示、數(shù)據(jù)分析處理、數(shù)據(jù)保存及管理四大功能模塊。軟件基于Windows系統(tǒng)采用C#撰寫，通過USB通訊功能控制光譜儀完成對樣品光譜的采集，采集到的干涉圖經(jīng)過計算機處理后可還原為光譜數(shù)據(jù)并進行計算分析。將自動將背景光譜設定為0%，白板光譜設定為100%，待背景光譜及白板光譜采集完成后才可進行樣品光譜的采集，采集到的光譜數(shù)據(jù)與背景光譜及白板光譜進行計算后，軟件界面會顯示光譜反射率數(shù)據(jù)圖像。

在數(shù)據(jù)采集模塊中，用戶可根據(jù)不同的葡萄品種設定不同的積分時間參數(shù)及平滑窗口數(shù)，實現(xiàn)儀器利用的最大化。光譜模型采用最小二乘-支持向量機（least squares support vector machine，LS-SVM）回歸建立，相較于常規(guī)的偏最小二乘回歸[25]能提供更好的預測結(jié)果，更小的預測偏差。通過該系統(tǒng)測得的光譜數(shù)據(jù)可批量以.txt格式保存，此設計更便于日后的模型更新及完善。

1.3.3 光譜數(shù)據(jù)的采集

利用可見-近紅外系統(tǒng)完成對所有果粒樣本可見-近紅外光譜的采集，光源強度為9 W，光譜波段為400～1 100 nm，積分時間為4 ms，采樣平均次數(shù)為10 次，光譜分辨率為0.38 nm。以每個葡萄果粒赤道上間隔180°的兩個點作為采樣點，這兩點的光譜作為獨立數(shù)據(jù)預測CIE L*a*b*值，這兩點的光譜平均值作為該樣品的光譜值預測SSC及總酚（total phenolic，TP）含量。

1.3.4 理化指標的測定

SSC：通過手持糖度儀測定，精確度為0.1 °Brix；L*、a*、b*：通過手持色差儀測定，L*值代表明度，a*值表示紅綠值，b*值表示黃藍值；TP含量：通過Fragoso等[26]所述方法測定。將葡萄皮用液氮冷凍研磨，取0.2 g研磨后果皮樣品于20 mL乙醇酸溶液（1% HCl-96%乙醇（17∶3，V/V）中40 ℃超聲浸提40 min。浸提后溶液于13 710×g離心5 min，上清液用乙醇酸溶液定容至50 mL，用紫外分光光度計在280 nm波長處測定吸光度。用2.0～20.0 mg/L的沒食子酸標準溶液作標準曲線，TP含量數(shù)據(jù)表示為每千克鮮樣中的沒食子酸質(zhì)量（g/kg）。

1.3.5 儀器穩(wěn)定性測試

為測試本儀器的穩(wěn)定性，選取3 個葡萄樣本，每個樣本75 min內(nèi)每15 min測定一次光譜X（每個樣本共測定6 次），按下式計算每個樣本的光譜值平均相對誤差百分比：

2 結(jié)果與分析

2.1 穩(wěn)定性測試結(jié)果

3 個樣本的平均相對誤差百分比的平均值如圖5所示，同一樣本在75 min內(nèi)多次測定的平均相對誤差在400～1 100 nm內(nèi)均不超過10%，證明了儀器中包括光源、光譜儀在內(nèi)的硬件的穩(wěn)定性和重復性。

圖 5 3 個葡萄樣品75 min內(nèi)每15 min測定的光譜平均相對誤差Fig. 5 Mean relative spectral errors of three grape samples measured for every 15 minutes in 75 minutes

2.2 兩種葡萄品質(zhì)最小二乘-支持向量機回歸建模結(jié)果

每個樣品的原始近紅外光譜共2 048 個波長數(shù)據(jù)點（覆蓋波長范圍為347.29～1 131.22 nm），由于前后段噪聲較大，在建模及預測分析中去除了前141及最后的80 個波長數(shù)據(jù)點保留了400.29～1 100.05 nm共1 827 個波長的數(shù)據(jù)進行后續(xù)分析。利用標準正態(tài)變換和平均窗口平滑降低系統(tǒng)噪聲及散射造成的干擾[27]。預處理后的光譜數(shù)據(jù)利用基于徑向基核函數(shù)的LS-SVM建立模型，通過留一交叉驗證的最小預報誤差平方加和確定模型的最佳參數(shù)γ和α的值[28]。模型的結(jié)果如表1所示。

表 1 2 種葡萄品質(zhì)LS-SVM回歸建模結(jié)果Table 1 LS-SVM regressions for grape quality parameters

本系統(tǒng)能對“美人指”葡萄及“白玉霓”葡萄的a*值、SSC及TP含量有較好的建模效果，建模集的R2均高于0.90；交叉驗證的R2cv略低于相應模型的建模集決定系數(shù)Rc2，交互驗證均方根誤差（root mean square error of cross-validation，RMSECV）略高于相應模型的交互驗證均方根誤差（root mean square error of calibration，RMSEC），但結(jié)果相差不大，證明模型沒有過擬合，同時證明系統(tǒng)中選用LS-SVM作為建模模型的可靠性，且因子數(shù)越少時，模型計速度越快。由于成熟的“美人指”葡萄呈紅色的手指狀長條形，成熟的“白玉霓”葡萄呈黃色的圓球形，證明該系統(tǒng)的硬件選擇及樣品池的設計能夠滿足不同形狀大小的葡萄的需要?！懊廊酥浮逼咸哑贩Na*值、SSC及TP含量LS-SVM模型的RMSEC分別為2.16、0.84 °Brix、0.19 g/kg，能夠滿足實際應用要求。

2.3 兩種葡萄模型預測結(jié)果

從江蘇南京八卦洲采集“美人指”及“白玉霓”兩個品種的葡萄漿果各70 粒，對裝置進行外部驗證。通過儀器獲得每個葡萄漿果的光譜值，并調(diào)用儀器內(nèi)置模型預測出該樣本的理化參數(shù)值，同時與理化方法測得的參考值進行比較，結(jié)果如表2及表3所示。

表 2 2 種葡萄模型預測結(jié)果Table 2 Model prediction of grape quality parameters

表 3 驗證集的理化測定值及模型預測誤差Table 3 Reference values and prediction errors of prediction set for each parameter

外部驗證的預測集結(jié)果顯示，兩個品種的各品質(zhì)指標能夠被較好的預測，其中，“美人指”的a*值、SSC、TP含量3 個指標的預測決定系數(shù)（R2p）分別為0.81、0.85、0.85，預測根均方誤差（root mean square error of prediction，RMSEP）分別為3.15、1.39 °Brix、0.24 g/kg；“白玉霓”3 個指標的R2p分別為0.83、0.90、0.83，RMSEP分別為0.78、1.56 °Brix、0.22 g/kg。Cozzolino[29]、Ferrer-Gallego[30]等曾提出當預測集標準差均方根誤差的比值（the ratio of standard deviation to standard error of prediction set，RPD）低于1.4時，模型不可靠；當RPD值在1.4～2之間時，模型相對可靠；當RPD高于2時，證明該模型可被認為是一個較好的模型。如表2所示，所有模型的RPD值均高于1.4，兩個葡萄品種的a*值、SSC、TP含量3 個指標均能被很好地預測，模型RPD均高于2，其中“白玉霓”的SSC模型的RPD高達3.07。同時，統(tǒng)計結(jié)果顯示（表3），對于L*、a*、b*的預測，“美人指”品種的最小預測誤差為0.14，“白玉霓”品種的最小預測誤差為0.00；對于SSC的預測，“美人指”品種的最小預測誤差為0.03 °Brix，“白玉霓”品種的最小預測誤差為0.04 °Brix；對于TP的預測，“美人指”品種的最小預測誤差為0.00 g/kg，“白玉霓”品種的最小預測誤差為0.00 g/kg。外部驗證結(jié)果證明本儀器可滿足不同類型葡萄果粒的品質(zhì)檢測需求。

3 結(jié) 論

本研究開發(fā)的葡萄專用小型近紅外檢測儀器能夠滿足多種類型葡萄果粒的測定需求，對于不同種類的葡萄能夠根據(jù)實際情況選擇合適的測定參數(shù)，同時軟件數(shù)據(jù)存儲的設計能夠更便于日后模型更新的需求，充分展現(xiàn)一機多用。對于2 個不同品種葡萄實驗表明本系統(tǒng)能夠?qū)ζ咸训谋砻骖伾?、SSC、TP含量完成較好的建模效果，外部驗證結(jié)果顯示模型對 “美人指”a*值、SSC、TP含量3 個指標的RMSEP分別為3.15、1.39 °Brix、0.24 g/kg；模型對“白玉霓”3 個指標的RMSEP分別為0.78、1.56 °Brix、0.22 g/kg。本研究為果蔬專用型近紅外儀器的開發(fā)提供了方法參考。